著者は貴重な作業と討論のためにCobb研究所のすべての現メンバーと元メンバー、そして管理援助のためのDionne Wareに感謝します。これらの研究は、国立保健研究所R37 DK34128およびウェルチ財団グラントI1243によってMHCに支持された

キナーゼ精製リソースおよび一般的な免疫沈降パイプライン注：このアッセイで使用するためのキナーゼは、培養細胞の免疫沈降物から、またはアフィニティータグ精製などの組換え手段によって供給され得る6 。以下は、関心対象のキナーゼに依存して修飾しなければならないかもしれないフラッグタグ免疫沈降のための一般的プロトコールである。可能な限りすべてを氷上に置いておくべきです。 <ol><li> 2μLの1mg / mL抗体を200μLの細胞ライセート（通常は1mg / mL総タンパク質濃度）に添加し、4℃で1時間インキュベートする。 </li><li> プロテインAセファロースビーズを、溶解バッファー（以下参照）で2〜3回、短時間4℃で5,000xgで30秒間〜1分間回転させ（「タッチスピン」）、ピペットで上清を除去し、緩衝液にビーズを再懸濁する。 <ol><li>溶解緩衝液を調製する：50mM HEPES pH7.7,150mM NaCl、1.5mM MgCl 2、1mM EGTA、10％グリセロール、0.2mMオルトバナジウム酸ナトリウム、100mMフッ化ナトリウム、50mMβ-グリセロリン酸、0.1％Triton X100または0.1％NP-40を含む。 </li></ol></li><li>ライセートに溶解緩衝液中のプロテインAセファロースビーズの50％スラリー30μLを加える;ロッキングしながら4℃で1時間インキュベートする。 </li><li> 4℃で回転させてビーズをペレット化し、上清を除去する。 </li><li> 1mLのビーズ洗浄バッファー（1M NaCl、20mMトリスpH7.4）で3回洗浄する。 </li><li> 1xキナーゼ反応緩衝液（10mM HEPES pH8.0,10mM MgCl 2 ）で1回洗浄する。ビーズを除去せずにできるだけ多くのバッファーを除去する。 </li></ol>キナーゼ反応の初期化注：IPキナーゼアッセイの場合、約15μLの懸濁していないビーズが典型的な開始サンプルです。組換えタンパク質キナーゼアッセイの場合、典型的な出発量は、25〜50μLの最終反応容積に対して0.1〜1.0μg/ l〜1/10の範囲である。組換えタンパク質サンプルの容量を調整するアッセイを初期化する前にそれらが保存されているバッファーと等しくなるようにします。大量のキナーゼを使用する場合は、アッセイ期間中のタンパク質安定性の維持を助けるために、BSAなどのキャリアタンパク質を含める。 <ol><li> 以下に示す5xキナーゼ反応バッファーを調製する： 50mM HEPES pH 8.0 50mM MgCl 2 50mMベンズアミジン（プロテアーゼ阻害剤） 50mMのDTT（還元剤） 250μMATP（非標識または「コールド」） </li><li> キナーゼサンプルを1.5 mLチューブに氷上で保存してください。以下の反応混合物を別々に冷却した1.5mLチューブで調製する： 21μLのH 2 O 6μL5xキナーゼ反応緩衝液 1μLの放射標識（「ホット」）ATP 基質2μL（約5mg / mL） 注：組換えキナーゼアッセイでは、精製タンパク質に対応するように容量を調整することができます。最終反応容積が30μLとなるように計算する。このレシピを使用してマスターを準備するミックス。標識されたATPを受領したら、反応混合物に加える前にH 2 O中のストックを0.01mCi /μLの比活性に希釈する。 </li><li>アッセイを初期化するために、反応混合物全体をキナーゼサンプルに添加し、アッセイされるキナーゼの活性に依存して、30℃で5分〜1時間インキュベートする。 注記：以前にアッセイされていないキナーゼを用いて作業する場合は、キナーゼ活性の経時変化を時間間隔で5分間隔で実行します。 </li></ol>反応停止およびSDS-PAGE <ol><li>氷上に置き、7.5μLの5倍Laemmliサンプルバッファー6を加えることにより反応を停止する。 </li><li>ヒートブロック中、100℃で30秒〜2分間加熱する。 </li><li> 10-15％SDS-PAGEゲル上でスピンをタッチし、ウェルあたり20μLを負荷する。キナーゼと基質を分離するのに十分な長さのゲルを流します（通常5Wの定電力で1時間）。ゲル装置をシールドして32 </sup&gt; Pである。 <ol><li>ここでは自家製ゲル装置を使用していますが、標準的な市販のミニゲルが完全に適しています。次のように寸法を使用します。 ゲル：幅8cm、長さ5.5cm（分解能）、厚さ1.5mm。 コムズ：15ウェル、1.5mm厚、2.9mm幅、16mm深さ</li></ol></li></ol> 4.ゲル染色および乾燥注意：すべてのステップで、放射性遮蔽を使用し、個人用保護具を着用して、 32 Pまでの人体への暴露を減らしてください。具体的な手順の詳細については、参考文献をいくつか記載しています。 <ol><li>ガラス/アルミナプレートからゲルを取り出し、50rpmに設定されたオービタルシェーカー上で50mLのクーマシー染色液（10％氷酢酸、50％メタノール、0.25％R-250色素）に1時間入れる。このステップでは、ゲル自体よりもわずかに大きい容器を使用してください。 8 </li><li>ゲルをステインから固定溶液（10％氷酢酸d、20％メタノール）を用いて脱色する。軌道シェーカー上で一晩、固定溶液600-700mL中でゲルを50rpmで揺する。クーマシー染料8,9を吸収するために、容器に泡や結び目のある実験用ワイプをゲルに入れます。 </li><li>固定溶液からゲルを取り出し、ゲルが乳白色に変わるまで静かに攪拌しながらメタノール200mLで1〜2分間浸します。これは、乾燥工程中の割れを防止するのに役立つ。 </li><li> 14cm×14cmの定性濾紙をメタノールで濡らし、スラブゲル真空乾燥機の上に置く。フィルターペーパーの前面を上にしてゲルを下にして置きます。 </li><li>しわや気泡を避けるために、プラスチックラップで慎重にゲルを覆う。乾燥機を80℃で1.5時間運転する。真空が達成された後、ふたを開け、必要に応じて柔らかいゴム製のブレイラで気泡をロールアウトします。 </li></ol> 5.オートラジオグラムおよびシンチレーションカウント<ol><li> driを削除ゲルの側面のろ紙にオートラッドマーカー、リン光ルーラーまたはドットを付けます。ドットを使用する場合は、それらが非対称パターンになっていることを確認してください。これは、露光および現像後にゲルをフィルムと整列させる。 </li><li> Geigerカウンタを使用して信号の強度を確認します。強度の高い画面で-70℃〜-80℃で弱い信号を照射すると、フィルムのバンド密度が増加します。 </li><li>暗室では、フィルムと増感スクリーンを備えたフィルムカセットに乾燥ゲルを、上から下の順番に、ゲル、フィルム、増感紙の順で入れます。 </li><li> 増感紙をカセットの蓋に取り付け、ゲルを適所にテープで貼り、このステップを簡単にします。増感スクリーンは、 32 Pからのベータ粒子によって照射されると光を発する。これらの光の放出は、ベータ粒子よりも効率的にフィルムに浸透する。 <ol><li>増感紙から放出される波長がフィルムが最も敏感である波長に池を維持する。 </li><li>ガイガーカウンターを使用して、曝露をどのくらいの期間放置するかを決定する：cpmカウントが〜100以下の場合は、-70℃で一晩お試しください。カウントが〜10,000の場合は、1時間の露出で開始し、そこから最適化します。 </li></ol></li><li>露光終了後、フィルムを取り出し、医療/ X線フィルムプロセッサーで現像する。暴露が-70〜-80℃で行われた場合は、カセットを室温まで温めて、結露が生じる前にフィルム上の結露を最小にしたり、フィルムを取り除いたりしてください。 </li><li>フィルムを乾燥したゲル/濾紙の上に置き、乾燥ゲル上のマーカー/ドットの画像をマーカー/ドットと整列させる。タンパク質標準に対応するバンドをフィルムに記入する。タンパク質標準にラベルを付け、将来の参照のために反応がどのレーンであるかを記録する。 </li><li>フィルム上の関心のあるバンドに対応するバンドをゲルから切り取って置きます7mLのシンチレーションバイアルに入れた。 4mLのシンチレーション液を加え、液体シンチレーションカウンターでカウントする。カウンタが32 Pの正しいエネルギースペクトルウィンドウを監視するように設定されていることを確認します。 注：基質に対応するバンドも、ノンキナーゼ対照レーンから切り出してください。これは、すべてのサンプルシンチレーションカウントから差し引かれるバックグラウンド放射線を計算するために使用されます。 </li></ol> 6.結果の分析注：オートラジオグラムは結果の定性的な視覚化を提供します。正確な定量のために、シンチレーションカウンターを用いて32 P取り込みを測定することができる。データは、通常、 図1Bに示すように、相対的な活動の観点から表現されます。全てのサンプルについて均一な条件が維持されている限り、比活性の相対的な測定は、処置を比較するのに十分である。 <ol><li>絶対的な特定の活動値を計算するときは、厳密に時間経過（ 例えば、 2×[キナーゼ] = 2×比活性）にわたる直線的な活性範囲を確保するために、キナーゼ、基質、および冷ATP濃度を含む、すべての反応条件の最適化。高い比活性を有するキナーゼについては、キナーゼ活性が基質の量によって制限される場合には、基質濃度を増加させてアッセイを行う。 </li><li> 関心のあるキナーゼの特異的活性を、1mg /キナーゼ当たりのナノモルリン酸塩単位の単位で計算する。 <ol><li>カウントされたバンドのcpmから空白を差し引く。 </li><li>熱いATPの減衰を計算する：[（1/2）^（t / t 1/2 ）] x 0.95ここで、 tは基準日からの日数であり、 t 1/2は32 Pの半減期は14.3日であり、0.95はシンチレーションカウンターの効率を反映する。例：28日目の高温ATPを使用する場合、減衰値は0.245でなければなりません。 </li><li> Calcアッセイの容量（μL）×[冷ATP]（μM）=全ATP（pmols）。アッセイ中の全ATPのピコモル（pmol）を測定します（通常、これは反応中の冷ATPの量に等しい）。例：30μL×50μM= 1500pmol </li><li> cpm / pmol ATPを計算する：冷ATPの[高温ATP x（2.2×10 7 ）×減衰係数] / pmolのμL。 注：2.2 x 10 7の値は、0.01 mCi /μLのATPをcpmに変換します。 </li><li>アッセイにおけるキナーゼの量をmgで計算する。組換えキナーゼおよび免疫沈降キナーゼの両方について、BCAアッセイのような標準的方法が出発濃度を決定するのに適している。例：50μLキナーゼ反応におけるwtERK20.0002μg/μLは0.01μg、または1×10 -5 mgです。 </li><li>アッセイで総cpmを計算する。 30μLの反応物を集め、ゲル上の各反応物から20μLを流す。計数されたcpm（ブランク減算後）に、総アッセイ容量/負荷された容量の係数を掛けます。上記を続けるたとえば、すべてのカウントに1.5、または30/20を掛けます。 </li><li>アッセイされたキナーゼの比活性を計算する： アッセイにおける全cpm）/（cpm / pmol ATP）/（アッセイ時間（分））/（キナーゼのmgでの量） 注：上記の値を1000で割ると、比活性はナノモル/分/ mg </li></ol></li><li> 分子量がわかっている限り、どれくらいのモルのリン酸が基質に取り込まれているかを計算する。これは、反応が完了すると、特定のタンパク質上のホスホサイトの数を決定するために使用されます。 アッセイにおける全cpm）/（cpm / pmol ATP）] /（pmol中の基質の量） </li></ol>

<ol>
	<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs.">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li><li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Complexity+of+the+ERK/MAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer.">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).</li><li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins.">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li><li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine/threonine-specific+protein+kinases.">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li><li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array-based+fluorescence+assay+for+serine/threonine+kinases+using+specific+chemical+reaction.">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li><li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Phosphorylation:+Selected+Methods+in+Enzymology.">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).</li><li>. Autoradiography Available from: <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011)</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Protein Protocols Handbook. , (2009).</li><li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNK1,+a+novel+mammalian+serine/threonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II.">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li><li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+or+Mutation+of+the+ERK2+Activation+Loop+Alters+Oligonucleotide+Binding.">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li><li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3.">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).</li><li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1/2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions.">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).</li><li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+(ERK5)+Inhibitors.">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

キナーゼは、数多くの状況において広範な機能を発達させたタンパク質の多様なファミリーであり、キナーゼアッセイは、いくつかのシグナル伝達タンパク質の研究に非常に有用であり、細胞通信の現在の理解に大きく貢献しています。特に、同じ基本アッセイを、構造および活性の大きな違いにもかかわらず、2つの異種キナーゼの特徴付けに使用した。 WNK1キナーゼは、臨界リジンが独特?...

プロテインキナーゼは、細胞シグナルの適切な応答への伝達に不可欠な洗練された酵素である1 。ホメオスタシスの維持と病態2の予防または促進における役割を考えると、キナーゼ活性を評価するための生化学的方法は、真核生物のシグナル伝達の詳細を描写するための強力なツールであり続けている3 。リン酸化特異的抗体を用いる戦略は、細胞シグナル伝達状態4に対する異なる治療条件の影響を測定する点で非常に有益であるが、キナーゼアッセイは、異なるキナーゼのキナーゼの酵素活性に関して異なる治療条件の影響を直接測定することを可能にする。関心放射性物質5を使用しない類似のアッセイにはいくつかの選択肢がありますが、我々は結果の堅牢な定量化のためにこの方法に引き続き依存しています。そこ免疫沈降（IP）キナーゼアッセイ（ 図1 ）および組換えタンパク質キナーゼアッセイ（ 図2 ）の2つの典型的な用途である。 IPキナーゼアッセイは、特定のプロテインキナーゼを活性化することができる因子ならびにゲノム阻害性の治療条件を同定するために非常に有用である。簡潔には、目的のエピトープタグ化キナーゼを培養真核細胞にトランスフェクションし、種々の処理を施し、免疫沈降させ、放射性標識ホスフェートをモデル基質（ 例えば、ミエリン塩基性タンパク質（MBP））に取り込む能力についてアッセイする。 IPキナーゼアッセイはまた、内因性タンパク質の免疫沈降または任意の数のゲノム編集技術のいずれかによって、過剰発現に頼らずに行うことができる。治療は培養で行われるので、この方法は複数の上流因子を介して伝達される刺激を検出することができるまたはインビトロでの読取りによる並行経路である 。この方法の1つの大きな利点は、直接的な上流または下流の因子またはその中のリン酸化部位の事前知識を必要としないことである。さらに、興味のあるキナーゼの特異的基質が同定されると、同じキナーゼアッセイプロトコールを組換え成分とともに使用して、天然基質に対する比活性を測定し、質量分析と組み合わせた場合の特異的リン酸化部位を同定することができる。このようにして同定された部位は、基質変異体を利用するキナーゼアッセイによってさらに検証することができる。最後に、この方法は、自己リン酸化を検出および測定するためにも使用することができる。 本明細書で提供されるプロトコルは、最適化されたタンパク質精製スキームまたは培養細胞における目的の親和性タグキナーゼを発現するためのトランスフェクション方法のいずれかを前提とする。トランスフェクション、溶解、免疫沈降、およびタンパク質精製のより詳細な解説については、Cold Spring Harbor Protocols 6を参照することをお勧めします。アッセイの開発および改変に関する詳細については、「タンパク質リン酸化：選択された方法in Enzymology」を参照してください。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protein A Sepharose CL-4B</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0963-03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radiolabeled [&#947;-32P] ATP</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG035C010MC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610737</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Radioactive shielding</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>BR-006</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-250 dye (Coomassie)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20278</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 3 qualitative filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1003-917</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slab gel vacuum dryer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 583 Gel Dryer #1651745&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autorad marker</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>420201</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorescent ruler</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8133</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorescent dots</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L5149</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geiger counter</td>
			<td>Ludlum</td>
			<td>Model 3 with 44-9 detector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax Cassette 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>107 2263</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax MS Film 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>829 4985</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMax MS Intensifying Screen 8x10&#34;</td>
			<td>Carestream Health</td>
			<td>851 8706</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical/X-ray film processor</td>
			<td>Konica Minolta</td>
			<td>SRX-101A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation vials</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>125500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>188245305</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman LS 6500 Scintillation counter</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>LS 6500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying protein kinase activity with radiolabeled atp

プロテインキナーゼは、複雑な刺激配列に応答して大規模な細胞の変化を制御することができ、その調節のアロステリックな詳細を明らかにするために多くの努力が向けられている。キナーゼは、欠陥がしばしば複数の形態の癌および関連疾患の特徴であり、上流の調節因子の操作および改善された治療法の探索において重要な反応要求の検証に適したアッセイプラットフォームを形成するシグナルネットワークを含む。ここでは、生化学的および薬理学的作用物質の試験、突然変異および欠失などの遺伝子操作、ならびに細胞培養条件およびプローブに対する処理を含むが、これに限定されない特定の実験的問題に適合するように容易に適合させることができる基本キナーゼアッセイを記載する細胞シグナル伝達機構。このアッセイは、定量的な比較および結果の明確な視覚化を可能にする放射性標識[γ- 32 P] ATPを利用し、そしてmod広範囲の反応条件にわたって、免疫沈降または組換えキナーゼ、特異的または典型的な基質と共に使用することができます。

WNK1 IPキナーゼアッセイ Myc標識WNK1をHEK293細胞にトランスフェクトし、抗Myc抗体11で免疫沈降した。免疫沈降物は、モデル基質MBPに向かって、そしてそれ自体に向かってキナーゼ活性を示した（ 図1A ）。 WNK1突然変異体を、同様の方法でMBPに対するキナーゼ活性について試験したが、今回はGSTタ?...

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Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

プロテインキナーゼは高度に進化したシグナリング酵素であり、細胞間および細胞内シグナル伝達にとって重要な足場である。本発明者らは、細胞シグナル伝達調節の解明を助ける信頼できる方法である放射性標識アデノシン三リン酸（[γ- 32 P] ATP）の使用によるキナーゼ活性を測定するためのプロトコールを提示する。

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

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18.2K ビュー.  University of Texas Southwestern Medical Center. プロテインキナーゼは高度に進化したシグナリング酵素であり、細胞間および細胞内シグナル伝達にとって重要な足場である。本発明者らは、細胞シグナル伝達調節の解明を助ける信頼できる方法である放射性標識アデノシン三リン酸（[γ- 32 P] ATP）の使用によるキナーゼ活性を測定するためのプロトコールを提示する。 

ビデオ: Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality for: (1) The identification of related protein structure sets to user specified thresholds of similarity; (2) Their multiple alignment and structure superposition; (3) Sequence and structure conservation analysis; (4) Inter-conformer relationship mapping with principal component analysis, and (5) comparison of predicted internal dynamics via ensemble normal mode analysis. This integrated functionality provides a complete online workflow for investigating sequence-structure-dynamic relationships within protein families and superfamilies.

A protocol for the online investigation of protein sequence-structure-dynamics relationships using Bio3D-web is presented.

Bio3D-webとのタンパク質配列構造ダイナミクスの関係の研究

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

生化学

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 mutations result in hyperactivation of its kinase function. Here, we describe an easy and robust assay to quantify LRRK2 kinase pathway activity in human peripheral blood neutrophils by measuring LRRK2-controlled phosphorylation of one of its physiological substrates, Rab10 at threonine 73. The immunoblotting analysis described requires a fully selective and phosphospecific antibody that recognizes the Rab10 Thr73 epitope phosphorylated by LRRK2, such as the MJFF-pRab10 rabbit monoclonal antibody. It uses human peripheral blood neutrophils, because peripheral blood is easily accessible and neutrophils are an abundant and homogenous constituent. Importantly, neutrophils express relatively high levels of both LRRK2 and Rab10. A potential drawback of neutrophils is their high intrinsic serine protease activity, which necessitates the use of very potent protease inhibitors such as the organophosphorus neurotoxin diisopropylfluorophosphate (DIFP) as part of the lysis buffer. Nevertheless, neutrophils are a valuable resource for research into LRRK2 kinase pathway activity in vivo and should be considered for inclusion into PD biorepository collections.

Mutations in the leucine rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) cause hereditary Parkinson&#8217;s disease. We have developed an easy and robust method for assessing LRRK2-controlled phosphorylation of Rab10 in human peripheral blood neutrophils. This may help identify individuals with increased LRRK2 kinase pathway activity.

Rab10リン酸化を評価してパーキンソン病関連LRRK2キナーゼ経路を尋問するためのヒト末梢血好中球分離

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. Y-27632 is a highly potent inhibitor of Rho-associated, coiled-coil-containing protein kinase (RhoA/ROCK) and is used to prevent dissociation-induced cell apoptosis (anoikis). We demonstrate that Y-27632 pretreatment for human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs+RI) prior to implantation results in a cell engraftment rate improvement in a mouse model of acute myocardial infarction (MI). Here, we describe a complete procedure of hiPSC-CMs differentiation, purification, and cell pretreatment with Y-27632, as well as the resulting cell contraction, calcium transient measurements, and transplantation into mouse MI models. The proposed method provides a simple, safe, effective, and low-cost method which significantly increases the cell engraftment rate. This method cannot only be used in conjunction with other methods to further enhance the cell transplantation efficiency but also provides a favorable basis for the study of the mechanisms of other cardiac diseases.

In this protocol, we demonstrate and elaborate on how to use human induced pluripotent stem cells for cardiomyocyte differentiation and purification, and further, on how to improve its transplantation efficiency with Rho-associated protein kinase inhibitor pretreatment in a mouse myocardial infarction model.

Rhoキナーゼ活性の一過性阻害によるヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞の増着増強

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the dissection and manipulation of biological pathways. Currently, only a limited number of chemically induced dimerization (CID) systems exist and engineering new ones with desired sensitivity and selectivity for specific small-molecule ligands remains a challenge in the field of protein engineering. We here describe a high throughput screening method, combinatorial binders-enabled selection of CID (COMBINES-CID), for the de novo engineering of CID systems applicable to a large variety of ligands. This method uses the two-step selection of a phage-displayed combinatorial nanobody library to obtain 1) &#34;anchor binders&#34; that first bind to a ligand of interest and then 2) &#34;dimerization binders&#34; that only bind to anchor binder-ligand complexes. To select anchor binders, a combinatorial library of over 109 complementarity-determining region (CDR)-randomized nanobodies is screened with a biotinylated ligand and hits are validated with the unlabeled ligand by bio-layer interferometry (BLI). To obtain dimerization binders, the nanobody library is screened with anchor binder-ligand complexes as targets for positive screening and the unbound anchor binders for negative screening. COMBINES-CID is broadly applicable to select CID binders with other immunoglobulin, non-immunoglobulin, or computationally designed scaffolds to create biosensors for in vitro and in vivo detection of drugs, metabolites, signaling molecules, etc.

Creating chemically induced protein dimerization systems with desired affinity and specificity for any given small molecule ligand would have many biological sensing and actuation applications. Here, we describe an efficient, generalizable method for de novo engineering of chemically induced dimerization systems via the stepwise selection of a phage-displayed combinatorial single-domain antibody library.