インビボFPOPタンパク質-タンパク質相互作用とC-エレガンスにおけるタンパク質構造変化.これらの動物は、ヒトの病気を研究するためのモデルシステムとして広く使用されています。生体内FPOPを質量分析に結合させることで、生きている動物の異なる細胞および体のコンパートメント内のタンパク質とタンパク質の相互作用を、特定のタンパク質を単離することなくプローブすることができます。
流れシステムアセンブリを開始し、フッ素化エチレンプロピレンまたはFPPチューブの2センチメートルの部分を切断することによって。きれいな解剖針を使用してチューブの一端の内径を広げ、長さ約15ミリメートルの小さなクレーターを作成します。流れシステムの注入ラインを作成するには、セラミックカッターとシリカを融合した250マイクロメートル内径の15センチメートルの部分にカットします。
そして、2つの毛細血管を自己粘着テープと一緒にテープで貼り付け、端部が100%フラッシュされていることを確認します。2 つの毛細血管を FPP チューブのクレーターに挿入し、端まで押し上げます。きれいな表面にエポキシ樹脂の小さなドットを置き、解剖針と混ぜます。
同じ針を使用して、注入する毛細血管の端に、FPPチューブと接続し、樹脂が数分間排出口側を乾かすようにします。一方、流れシステムの出口毛細管となる新しい250マイクロメートル内径キャピラリーを切断します。樹脂が乾燥したら、FPPチューブ出口の端に新しいキャピラリーを挿入します。
出口毛細管の内側の端と2つの注入毛細血管は、混合茶を作成し、互いにフラッシュする必要があります。先に述べたように新鮮なエポキシ樹脂で毛細管およびFPPチューブに結合し、フローシステムを一晩乾燥させます。4つの磁気スターラーを1つの5ミリリットルシリンジの中に挿入すると、インビボでタンパク質の高速光化学酸化または生体内FPOP中にこの注射器にワームが沈着するのを防ぎます。
これをM9で5ミリリットルのシリンジを追加して、泡を作らないようにしてください。下のアダプターを各シリンジに接続し、指がしっかりと固定されていることを確認します。次に、各シリンジを1つの3-2バルブの中央ポートに取り付けます。
各シリンジをデュアルシリンジポンプに固定し、プッシャーブロックからの過圧を防ぐために機械的な色を調整します。FEPスリーブとスーパーフランジリスト変数ではなくスーパーフランジリストを使用して、以前に作られたマイクロ流体システムの各注入キャピラリー端を各3-2バルブの上ポートに取り付けます。最後に、10センチメートル450マイクロメートル内径キャピラリーをバルブの底面ポートに取り付け、引き出しサンプル毛細管として機能します。
ポンプの流れを開始し、すべての接続に漏れが発生していないか視覚的に検査します。実験流量を用いて少なくとも3つのシリンジボリュームを流す。流路は3-2バルブハンドルの矢印でマークされ、各シリンジは、バルブハンドルを排出から引き出し位置に移動することで手動で補充することができます。
マイクロ流体流動システムを点検した後、実験ベンチに移動し、ステンレス鋼の組合で放射段階に出口の毛細管を固定する。レーザー照射窓で融合したシリカのコーティングを燃やし、焼けたコーティングを糸くず組織とメタノールで洗浄するために、長い範囲のライターを使用してください。磁気攪拌機でスポイトの上に磁気攪拌機ブロックを配置し、速度を調整して、攪拌がゆっくりと常に回転するようにします。
クリプトンフッ化物エキシマレーザーをオンにし、甲状腺トロンがウォームアップできるようにします。光センサをビーム出口ウィンドウに配置して、少なくとも100パルスの50ヘルツの周波数でレーザーエネルギーを測定します。500マイクロリットルの約10,000個のワームをサンプルシリンジに手動で引き出します。
その後、気泡を避けるために、M9バッファーの2.5ミリリットルでそれを充填します。10,000 以上のワームのサンプル サイズを持つことは重要です。サンプルサイズが小さいほど、下流のプロテオーム解析でのタンパク質収率が低くなります。
2番目の注射器に200ミリモル過酸化水素を3ミリリットル充填します。出口毛細管の終わりに、40ミリモルDMTU、40ミリモルPBN、および1%時間のリンゴソース酸化物の6ミリリットルを有する15ミリリットル円錐管を置く。ソフトウェアウィンドウからエキシマレーザーを開始し、最初のパルスを待ち、デュアルシリンジからサンプルフローを開始します。
サンプル全体を15ミリリットルチューブに集め、視覚的な漏れがないかサンプルの流れを積極的に監視します。インビボFPOP後、2分間805回gで遠心分離によりワームをペレット化する。クエンチ溶液を吸引し、250マイクロリットルのライセンスバッファーを追加します。
きれいなマイクロ遠心チューブにサンプルを移し、フラッシュはそれを凍結し、サンプル消化までマイナス80°Cで保存します。ワーム回復は、2つの異なる内径の毛細血管を使用してin vivo FPOP後に比較された。250マイクロメートルの内径キャピラリーを使用した場合、2つの生物学的複製で63〜89%の間でサンプルの全回収が達成されました。
150マイクロメートルの内径キャピラリーを使用すると、わずか21〜31%の回復をもたらしました。より大きな内径毛細血管の使用は、インビボFPOP中のより良いワームの流れにつながり、小さな毛細管は単一のワームフローを可能にせず、複数のワームがレーザー放射ウィンドウで一緒に流れ、ワームあたりのレーザー暴露量が減少する。FPOP改変および未修飾ペプチドの代表的な抽出イオンクロマトグラムは、ヒドロキシルラジカルが酸化修飾ペプチドの化学を変化させ、それらをより極性にすることを示した。
逆相クロマトグラフィーでは、in vivo FPOP修飾ペプチドは、未修飾ペプチドよりも早期に保持時間を有する。単離されたペプチドのMS断片化は、酸化的に改変された残基の同定を可能にする。In vivo FPOPは、C-エレガンス内の2つの生物学的複製にわたって合計545個のタンパク質を酸化的に改変しました。
このタンパク質フットプリント法の1つの利点は、ワーム内の様々な身体系におけるタンパク質を修飾する能力である。タンデムMS分析は、生体内でのFPOPプローブ溶媒の入手可能性を確認する。ヒートショックタンパク質90の酸化パターンをミオシンシャペロンタンパク質UNC45と複合体で、4個の酸化的に改変残基と分析したところ、発見された。
インビボFPOPのためのC-エレガンスの使用は、疾患の病因におけるタンパク質相互作用およびタンパク質構造の役割を研究する可能性を提供する。
