ストレスにさらされると、タンパク質の凝集を引き起こし、細菌の現象の挙動に重大な変化をもたらす可能性があります。このビデオで説明した手順は、ストレス処理後のタンパク質凝集体の抽出と可視化を可能にします。他の公表された手順とは対照的に、このプロトコルは、より低い細胞数を必要とし、複雑な物理的破壊プロセス、ならびに時間のかかる洗浄およびインキュベーションステップを控える必要があります。
このプロトコルは、グラム陰性およびグラム陽性菌の多種多様なタンパク質凝集を研究するために使用することができます。また、遺伝子欠失の効果を分析したり、タンパク質毒性化合物の有効性を比較することもできます。大腸菌株MG1655および泌尿器病性大腸菌株CFT073の単一コロニーを、それぞれ5ミリリットルのリソゲニーブロス(LB)培地に接種することから始めます。
2つのスープ培養物を摂氏37度、300rpmで14~16時間インキュベートします。各株を600ナノメートル(OD600)の光学密度に希釈し、0.1の70ミリリットルのMOPS-g培地を含む500ミリリットルのフラスコにします。中対数相に達するまで37度と300rpmでフラスコをインキュベートします。
インキュベーション後、各培養物20ミリリットルを3つの事前に温めた125ミリリットルのフラスコに移し、摂氏37度と300rpmで2分間培養します。MOPS-g培地で2ミリグラム/ミリリットルの抗菌化合物溶液を調製する。各培養液にこの溶液を加え、所望の濃度に達し、未処理の制御に必要な量のMOPS-g培地を加える。
45分間のストレス処理の後、各培養のOD600を決定する。各サンプルについて、15ミリリットルの遠心分離管に1つのOD600を有する4ミリリットルの培養物をアリコートする。細胞ペレットを氷冷ライシスバッファーの 50 マイクロリットルに再懸濁します。
氷の上で30分間サンプルをインキュベートします。360マイクロリットルの氷冷バッファーAをサンプルに加え、ピペットで軽く混ぜます。サンプルを0.5ミリメートルのガラスビーズの約200マイクロリットルで2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。
1400 rpmで振るサーモミキサーで8°Cで30分間チューブをインキュベートします。ガラスビーズを落ち着かすために振ることなく、氷の上にチューブを5分間インキュベートします。その後、200マイクロリットルの細胞ライセートを1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。
細胞を16,000倍gと摂氏4度で20分間遠心分離します。後で可溶性タンパク質サンプルとして使用される上清を収集します。ピペットを使用して、16,000グラム、摂氏4度の氷冷バッファーA.遠心分離機の200マイクロリットルのペレットを20分間再懸濁させます。
その後、慎重に上清を完全に削除します。ピペットを使用して、200マイクロリットルの氷冷バッファーB.遠心分離機でペレットを慎重に再懸濁し、上清を慎重に取り除きます。その後、バッファーA.1x低減SDSサンプルバッファーの100マイクロリットルでペレットを再懸濁し、95°CでThermoMixerで5分間沸騰させます。
100%TCAの1つのボリュームを、先に採取した可溶性タンパク質サンプルの4つのボリュームと混合し、タンパク質沈殿のために摂氏4度で10分間インキュベートします。試料を21,000倍gと摂氏4度で5分間遠心し、沈殿物を得て、上清を除去する。200マイクロリットルの氷冷アセトンを使用してペレットを洗浄し、細胞の破片を除去します。
試料を再び遠心分離し、沈殿物を得て、上清を除去した。残りのアセトンをペレットから取り除くには、サーモミキサーのマイクロ遠心チューブを蓋を開けたまま摂氏37度に保ちます。その後、1x減らすSDSバッファーの100マイクロリットルを加え、ペレットを完全に溶解し、サンプルを摂氏95度で5分間沸騰させます。
分離のためにSDSポリアクリルアミドゲルにサンプルをすぐにロードするか、後で進むためにマイナス20°Cでサンプルを保存します。テキスト原稿に記載されているように、2つの分離ゲルを準備します。ガラス板の間に1ミリリットルのピペットを使用してゲルを注ぎ、上の2センチメートルに混合物が含まれないようにします。
分離ゲルの上に70%エタノールを加え、2つの層の間に均一な界面を作り出す。分離ゲルが重合したら、テキスト原稿の指示を使用して積層ゲルを調製します。次いで、分離ゲルからエタノールを取り出し、スタッキングゲル溶液を添加する。
気泡を入れずに必要な数のポケットを持つ櫛を慎重に挿入し、ゲルを20〜30分間重合させます。各サンプルの4マイクロリットルとタンパク質ラダーを別々の井戸に積み込みます。その後、室温で45分間144ボルトでトリスグリシンランニングバッファでゲルを実行します。
事前に温められたフェアバンクス溶液Aを使用してロッカーのゲルを30分間染色し、事前に温めたフェアバンクス溶液Dを使用して、所望の背景が達成されるまでロッカーのゲルを脱色させます。細胞を1ミリリットル当たり175マイクログラム、抗菌菌1ミリリットル当たり200マイクログラムで処理した場合に形成されたタンパク質凝集体の量の増加が、未処理細胞と比較して観察された。不溶性タンパク質画分の増加は、より敏感なMG1655株でより顕著であった。
未治療細胞と比較して、細胞を1ミリリットル当たり175マイクログラム、抗菌菌1ミリリットル当たり200マイクログラムで処理した場合、可溶性タンパク質の量が減少することが観察された。このプロトコルを試みる際には、サンプル中のタンパク質凝集の程度を比較するためには、600ナノメートルでの光学密度への正規化が重要であることを覚えておいてください。
