このプロトコルを開発するために行われた作業は、米国国立衛生研究所(NIH)の支援を受けています[AR072609]。

骨折感受性のための機械的試験の原理とプロトコル

<ol>
	<li>Vesper, E. O., Hammond, M. A., Allen, M. R., Wallace, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+with+rehydration,+preservation+in+ethanol+influences+the+mechanical+properties+of+bone+and+how+bone+responds+to+experimental+manipulation.">Even with rehydration, preservation in ethanol influences the mechanical properties of bone and how bone responds to experimental manipulation.</a> Bone. 97, 49-53 (2017).</li><li>Jepsen, K. J., Silva, M. J., Vashishth, D., Guo, X. E., van der Meulen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+biomechanical+mechanisms+in+mouse+models:+practical+guidelines+for+systematically+evaluating+phenotypic+changes+in+the+diaphyses+of+long+bones.">Establishing biomechanical mechanisms in mouse models: practical guidelines for systematically evaluating phenotypic changes in the diaphyses of long bones.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 30 (6), 951-966 (2015).</li><li>Eds Burr, D. B., Allen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic and Applied Bone Biology. , (2019).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> microCT SkyScan 1272 User Manual. , (2018).</li><li>Kim, Y., Brodt, M. D., Tang, S. Y., Silva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroCT+for+scanning+and+analysis+of+mouse+bones.">MicroCT for scanning and analysis of mouse bones.</a> Methods in Molecular Biology. 2230, 169-198 (2021).</li><li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography.">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Micro-CT specimen scanner, Centre for high-throughput phenogenomics. , (2023).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard test method for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials by four-point bending. , (2020).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Standard test methods for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials. , (2017).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bruker+microCT+NRecon:+An+overview.">Bruker microCT NRecon: An overview.</a> , (2023).</li></ol>

著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

スキャンとテストのプロセス全体を通して、トラブルシューティングと最適化が適切な瞬間があります。1つ目は、μCTで骨をスキャンするときに発生します。多くのシステムには、1つのオブジェクトを保持してスキャンできるホルダーが付属していますが、カスタムホルダーを作成して複数のボーンを同時にスキャンすることができます。複数のボーンをスキャンすることは、最適化のため?...

骨の機械的試験は、骨の骨折しやすさに関連する機能情報を抽出するための主要な方法です。前臨床試験では、いくつかの検査方法を使用できますが、最も一般的なのは長骨の曲げです。これらの検査は簡単に実施でき、ヒトからマウスまで、さまざまなサイズの骨に使用できます。マウスは前臨床研究で最も一般的に研究されている動物の1つであるため、このプロトコルはマウスの大腿骨と脛骨で実施される曲げ試験に焦点を当てます。
曲げ試験を行う前に、骨を適切に採取して保管する必要があります。最も一般的な保存方法は、伝統的に、生理食塩水に浸したガーゼで骨を凍結するか、生理食塩水のみで凍結するか、エ タノールで骨を脱水するかでした1。エタノールで保存された骨は、凍結保存されたものと比較して、剛性と弾性率が増加し、変形パラメータが減少することが示されています1。検査前に骨を水分補給しても、これらの特性は正常なレベル 1には回復しません。生理食塩水に浸して保管すると、生理食塩水が膨張すると圧力がかかるため、骨に損傷を与える可能性があります。さらに、マイクロコンピュータ断層撮影(μCT)スキャンのために骨を取り除くには、溶液の完全な融解が必要になります。その結果、採取したばかりの骨を生理食塩水に浸したガーゼで冷凍することが標準的な保存方法となっており、このプロトコル全体で推奨されています。
骨の大きさと形状は骨のかさ強度に影響を与え、多くの疾患モデルは骨のサイズと形態を大きく変えるため、工学的原理を使用してサイズの影響を正規化し、組織の挙動を推定する特性を生成します2。このアプローチでは、破損箇所の断面形状が必要であり、これは試験前に骨のスキャンを作成するためにμCTを使用して取得されるのが最も一般的です。μCTは、その可用性と高い画像解像度により広く使用されています。さらに、軟部組織の寄与は含まれておらず、スキャンは骨への化学的固定やその他の修正を必要としません3,4。すべての形態のCTでは、X線源が物体に焦点を合わせ、物体の反対側にある検出器が結果として生じるX線エネルギーを測定します。これにより、画像3,5に変換できるサンプルのX線影が生成される。スキャンされる物体を回転させ(またはX線源と検出器を試料の周りを回転させ)、物体5を表す3次元データセットに再構成することができる画像を生成する。
スキャン解像度、つまり 2 つのオブジェクトがどれだけ接近していても個別に解決できるかは、公称ボクセル サイズまたは結果の画像のピクセル サイズを変更することによって制御されます。一般的には、オブジェクトが識別されるためには、1つのボクセルの少なくとも2倍のサイズでなければならないとされていますが3、比率を高くすると精度が向上します。さらに、ボクセルが大きいほど、部分的な体積効果が生じやすくなり、1つのボクセルにさまざまな密度の組織が含まれる場合、単一の組織の比密度ではなく、これらの密度の平均が割り当てられるため、組織面積と鉱物密度が過大または過小評価される可能性があります3。これらの問題は、より小さなボクセル サイズを選択することで軽減できますが、より高い解像度を使用しても、部分的なボリューム効果が排除されるわけではなく、スキャン時間が長くなる可能性があります3。 ex vivoで骨をスキャンする場合、マウスの骨の小柱構造を正確に評価するために、一般的に6〜10μmのボクセルサイズが推奨されます。皮質骨には10〜17μmのより大きなボクセルサイズを使用できますが、最小の妥当なボクセルサイズを使用する必要があります。このプロトコルは10 μmのボクセルサイズを使用しており、これは主要な小柱特性を区別し、長時間のスキャン時間なしで部分的な体積の影響を最小限に抑えるのに十分な大きさです。
骨組織のミネラル密度と厚さが高いと、透過X線エネルギースペクトルが大幅に減衰および変化するため、X線エネルギーとエネルギーフィルターの設定も慎重に選択する必要があります。一般に、放射されたX線スペクトルは物体6から出るスペクトルと同等であるため、骨などの高密度の物体に低エネルギーX線を使用すると、ビーム硬化7として知られるアーチファクトが発生する可能性があります。これらのアーチファクトの発生率を減らすために、骨サンプルをスキャンするときは、50〜70 kVpのより高い電圧が推奨されます5。さらに、アルミニウムまたは銅のエネルギーフィルタを挿入すると、より集中したエネルギービームが作成され、アーチファクトがさらに最小限に抑えられます4,7。このプロトコルでは、0.5mmのアルミニウムフィルターが使用されます。
最後に、スキャン回転ステップおよび回転長(例えば、180°〜360°)が一緒になって、キャプチャされる画像の数を制御し、これが最終スキャン4におけるノイズの量を決定する。各ステップで複数のフレームを平均化すると、ノイズは低減できますが、スキャン時間が長くなる可能性があります4。このプロトコルでは、0.7 度の回転ステップと 2 のフレーム平均を使用します。
スキャンに関する最後の注意点:ハイドロキシアパタイトキャリブレーションファントムは、減衰係数を鉱物密度(g/cm35)に変換できるように、実験骨と同じスキャン設定を使用してスキャンする必要があります。このプロトコルでは、0.25 g/cm 3 および 0.75 g/cm3 のハイドロキシアパタイトのファントムを使用しますが、異なるファントムが利用可能です。一部のスキャンシステムは、毎日のシステムキャリブレーションの一部として内部ファントムを使用することに注意してください。
スキャンが完了すると、角度投影は、通常、メーカーの付属ソフトウェアを使用して、オブジェクトの断面画像に再構築されます。どのシステムを使用する場合でも、骨全体が再建に取り込まれ、骨と非骨の認識を可能にするために閾値が適切に設定されていることを確認することが重要です。再建後、すべてのスキャンを3次元で回転させて、骨の向きが一貫して横軸と適切に揃うようにすることが重要です。
回転後、分析のための関心領域(ROI)は、皮質特性、小柱特性、または機械的正規化のための骨折形状のいずれが望ましいかに基づいて選択され得る。後者の場合、ROIは、骨折部位から骨の一端までの距離を測定し、ボクセルサイズを使用してスキャンファイル内の対応するスライス位置を決定することにより、テスト後に選択する必要があります。選択された領域は、適切な推定を提供するために、ROIのほぼ中心に破砕点がある長さが少なくとも100μmである必要があります4。
ROI が選択されている場合、機械的な正規化 (曲げ応力とひずみを計算するため) には、中立曲げ軸から破損が始まる表面までの最大距離 (試験セットアップによって決定される引張荷重を受ける表面と仮定) と、中立軸周辺の面積慣性モーメント (これも試験セットアップに依存) の 2 つのプロパティが必要です。このプロトコルでは、カスタムコードを使用してこれらの値を決定することを推奨しています。コードへのアクセスについては、対応する作成者に直接お問い合わせいただくか、https://bbml.et.iupui.edu/ のラボのWebサイトにアクセスして詳細を確認してください。
μCTスキャンが完了すると、機械的試験を開始できます。曲げ試験は、4点または3点構成のいずれかで実行できます。4点曲げ試験は、荷重点間の骨のせん断応力を排除し、この領域で純粋な曲げを発生させることができるため、好まれます3。その後、骨は張力によって骨折し、骨の真の曲げ特性をより代表する破損を引き起こします3。ただし、両方の荷重点で同じ荷重がかかるように骨に荷重をかける必要があります(これは、ピボット式ローディングヘッドで容易に行うことができます)。3点曲げ試験では、荷重点と骨が接する部分でせん断応力が大きく変化し、張力3ではなくせん断によってこの時点で骨が折れます。ASTM規格では、曲げ加工を受ける材料の長さと幅の比率を16:1にすることを推奨しており、これは、せん断の影響を最小限に抑えるために、支持スパンの長さを骨の幅の16倍にする必要があることを意味します8,9。これは、小さなげっ歯類の骨を試験する場合、達成できないことが多いため、荷重スパンは、断面形状の変化をできるだけ小さくして、できるだけ大きくします。さらに、4点曲げを行う場合、下部スパンと上部スパンの長さの比率は~3:18である必要があり、これは通常、脛骨で達成できますが、短い大腿骨では困難です。さらに、大腿骨の皮質壁が薄いため、試験中に骨断面の形状が変化するリング型の変形の影響を受けやすくなります(これは、3点曲げと比較して同じ曲げモーメントを誘発するためにより大きな力が必要になるため、4点試験で強調できます)。したがって、マウス大腿骨には 3 点曲げが利用され、このプロトコル全体で脛骨には 4 点曲げが使用されます。
最後に、統計分析のために研究に適切な電力を供給することが重要です。機械的試験の一般的な推奨事項は、一部の機械的特性、特に降伏後のパラメータが非常に変動する可能性があるため、違いを検出できるように、実験グループごとに10〜12個の骨のサンプルサイズを持つことです。場合によっては、これは、研究中に発生する可能性のある減少を考慮して、より大きな動物サンプルサイズから始めることを意味する場合があります。既存のデータを使用したサンプルサイズ分析は、研究を試みる前に完了する必要があります。
多くの制限と仮定がありますが、曲げ試験は、特にグループ間の相対的な差が重要な場合に、非常に正確な結果を提供できます。これらの特性は、小柱構造と皮質形態の分析とともに、病態と治療計画に関するより良い洞察を提供することができます。私たちが管理できる実験の側面(収穫、保管、スキャン、テストなど)に注意を払えば、正確な結果が得られていると確信できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>CTAn</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Analysis Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DataViewer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Rotation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>NA</td>
			<td>Coding platform used for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NRecon</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>NA</td>
			<td>CT Scan Reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software&#160;&#160;</td>
			<td>Micro Photonics Inc</td>
			<td>SKY-016814</td>
			<td>Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

practical considerations for the design, execution, and interpretation of studies involving whole-bone bending tests of rodent bones

骨折につながる骨格の脆弱性は、毎年150万人の骨折と180億ドルの直接的な医療費をもたらす米国の公衆衛生上の危機です。骨疾患の根底にあるメカニズムと治療への反応を理解する能力は、望まれるだけでなく、重要です。骨の機械的試験は、骨の骨折しやすさを理解し、定量化するための貴重な技術として役立ちます。この方法は簡単に実行できそうに見えますが、ユーザーがガバナンスの仮定と重要な手順を無視すると、不適切で不正確な結論に達する可能性があります。これは、方法の誤用や結果の誤った解釈を伴う研究が発表され続けているため、分野を超えて観察されています。このプロトコルは、サンプルサイズの考慮から組織の採取と保存、データ分析と解釈まで、これらの技術の適用とともに機械的試験に関連する原則の入門書として機能します。これにより、骨の骨折しやすさに関する貴重な情報が得られ、学術研究と臨床ソリューションの両方の理解が深まります。

CTスキャンが完了すると、ほとんどの不十分なスキャンが再構成で捕捉されます。多くの場合、スキャンが不十分な場合、スキャン中のエラーの明確な指標である高いミスアライメント補正が発生します。ただし、他の手順でエラーが発生し、データが不正確になる可能性もあります。これらのエラーは、計算された個々のアーキテクチャ プロパティを調べるときに発見されることがよくあ?...

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著者スポットライト:全骨曲げ試験における精度と再現性の向上 

げっ歯類の骨の機械的試験は、骨の骨折しやすさに関する情報を抽出するための貴重な方法です。適切な実践的理解を欠いていると、結果が過剰に解釈されたり、妥当性に欠けたりする可能性があります。このプロトコルは、機械的試験が正確に実施され、有効で機能的なデータを提供するためのガイドとして機能します。

げっ歯類の骨の全骨曲げ試験を含む研究の設計、実施、および解釈に関する実践的な考慮事項

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care ...

曲げ試験の現在の実験上の課題には、同じ向きに骨を一貫して配置すること、試験中の骨の破断の進行状況を文書化すること、および複雑な結果の解釈が含まれます。当社のプロトコールは、全骨曲げ試験の試験手順とデータ解析だけでなく、サンプルの調製と保管のためのガイドも提供します。そして、これはプロトコル全体が提示された最初の例です。全骨機械的試験は、他の試験方法と比較した場合の骨折感受性の測定値を取得するための迅速で簡単な方法です。

practical-considerations-for-design-execution-interpretation-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Practical Considerations for the Design, Execution, and Interpretation of Studies Involving Whole-Bone Bending Tests of Rodent Bones

599 ビュー.  Indiana University-Purdue University Indianapolis. 曲げ試験の現在の実験上の課題には、同じ向きに骨を一貫して配置すること、試験中の骨の破断の進行状況を文書化すること、および複雑な結果の解釈が含まれます。当社のプロトコールは、全骨曲げ試験の試験手順とデータ解析だけでなく、サンプルの調製と保管のためのガイドも提供します。そして、これはプロトコル全体が提示された最初の例です。全骨機?...

ビデオ: 著者スポットライト:全骨曲げ試験における精度と再現性の向上 

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

生物工学

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, phosphorus, sulfate and trace elements that plants acquire from the soil. If we want to develop sustainable approaches to producing high crop yield, we need to better understand how the root develops, takes up a wide spectrum of nutrients, and interacts with symbiotic and pathogenic organisms. To accomplish these goals, we need to be able to explore roots in microscopic detail over time periods ranging from minutes to days.
We developed the RootChip, a polydimethylsiloxane (PDMS)- based microfluidic device, which allows us to grow and image roots from Arabidopsis seedlings while avoiding any physical stress to roots during preparation for imaging1 (Figure 1). The device contains a bifurcated channel structure featuring micromechanical valves to guide the fluid flow from solution inlets to each of the eight observation chambers2. This perfusion system allows the root microenvironment to be controlled and modified with precision and speed. The volume of the chambers is approximately 400 nl, thus requiring only minimal amounts of test solution.
Here we provide a detailed protocol for studying root biology on the RootChip using imaging-based approaches with real time resolution. Roots can be analyzed over several days using time lapse microscopy. Roots can be perfused with nutrient solutions or inhibitors, and up to eight seedlings can be analyzed in parallel. This system has the potential for a wide range of applications, including analysis of root growth in the presence or absence of chemicals, fluorescence-based analysis of gene expression, and the analysis of biosensors, e.g. FRET nanosensors3.

This article provides a protocol for cultivation of Arabidopsis seedlings in the RootChip, a microfluidic imaging platform that combines automated control of growth conditions with microscopic root monitoring and FRET-based measurement of intracellular metabolite levels.

RootChipを使用して、ルート環境の急激な操作によるシロイヌナズナの根の成長のタイムラプス蛍光イメージング

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

Design of a Biaxial Mechanical Loading Bioreactor for Tissue Engineering

We designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for transplantation. While the device primarily functions as a bioreactor that mimics the native mechanical strains, it is also outfitted with a load cell for providing force feedback or mechanical testing of the constructs. The device subjects engineered cartilage constructs to biaxial mechanical loading with great precision of loading dose (amplitude and frequency) and is compact enough to fit inside a standard tissue culture incubator. It loads samples directly in a tissue culture plate, and multiple plate sizes are compatible with the system. The device has been designed using components manufactured for precision-guided laser applications. Bi-axial loading is accomplished by two orthogonal stages. The stages have a 50 mm travel range and are driven independently by stepper motor actuators, controlled by a closed-loop stepper motor driver that features micro-stepping capabilities, enabling step sizes of less than 50 nm. A polysulfone loading platen is coupled to the bi-axial moving platform. Movements of the stages are controlled by Thor-labs Advanced Positioning Technology (APT) software. The stepper motor driver is used with the software to adjust load parameters of frequency and amplitude of both shear and compression independently and simultaneously. Positional feedback is provided by linear optical encoders that have a bidirectional repeatability of 0.1 &mu;m and a resolution of 20 nm, translating to a positional accuracy of less than 3 &mu;m over the full 50 mm of travel. These encoders provide the necessary position feedback to the drive electronics to ensure true nanopositioning capabilities. In order to provide the force feedback to detect contact and evaluate loading responses, a precision miniature load cell is positioned between the loading platen and the moving platform. The load cell has high accuracies of 0.15% to 0.25% full scale.

We designed a novel mechanical loading bioreactor that can apply uniaxial or biaxial mechanical strain to a cartilage biocomposite prior to transplantation into an articular cartilage defect.

組織工学のための二軸メカニカルローディングバイオリアクターの設計

We  designed a loading device that is capable of applying uniaxial or biaxial  mechanical strain to a tissue engineered biocomposites fabricated for  ...

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the first, synthesis of ultra-small copper nanoclusters is described. The second example provides their utility for investigating time resolved kinetics of chemical reactions by analyzing gold nanoparticle formation using in situ X-ray absorption spectroscopy. The final example demonstrates continuous flow catalysis of reactions inside millifluidic channel coated with nanostructured catalyst.

Millifluidic devices are utilized for controlled synthesis of nanomaterials, time-resolved analysis of reaction mechanisms and continuous flow catalysis.

化学合成時間分解機構の研究のためのMillifluidics

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the additional advantage of short development and production times, but expression levels can vary significantly between batches thus giving rise to regulatory concerns in the context of good manufacturing practice. We used a design of experiments (DoE) approach to determine the impact of major factors such as regulatory elements in the expression construct, plant growth and development parameters, and the incubation conditions during expression, on the variability of expression between batches. We tested plants expressing a model anti-HIV monoclonal antibody (2G12) and a fluorescent marker protein (DsRed). We discuss the rationale for selecting certain properties of the model and identify its potential limitations. The general approach can easily be transferred to other problems because the principles of the model are broadly applicable: knowledge-based parameter selection, complexity reduction by splitting the initial problem into smaller modules, software-guided setup of optimal experiment combinations and step-wise design augmentation. Therefore, the methodology is not only useful for characterizing protein expression in plants but also for the investigation of other complex systems lacking a mechanistic description. The predictive equations describing the interconnectivity between parameters can be used to establish mechanistic models for other complex systems.

We describe a design of experiments approach that can be used to determine and model the influence of transgene regulatory elements, plant growth and development parameters, and incubation conditions on the transient expression of monoclonal antibodies and reporter proteins in plants.

ケーススタディとして、タバコにおける一過性タンパク質発現：実験アプローチのデザインを使用した複雑系のキャラクタリゼーション

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Design and Fabrication of an Elastomeric Unit for Soft Modular Robots in Minimally Invasive Surgery

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in unstructured environments. At the same time, new procedures and techniques have been developed to reduce the invasiveness of surgical operations. Minimally Invasive Surgery (MIS) has been successfully employed for abdominal interventions, however standard MIS procedures are mainly based on rigid or semi-rigid tools that limit the dexterity of the clinician. This paper presents a soft and high dexterous manipulator for MIS. The manipulator was inspired by the biological capabilities of the octopus arm, and is designed with a modular approach. Each module presents the same functional characteristics, thus achieving high dexterity and versatility when more modules are integrated. The paper details the design, fabrication process and the materials necessary for the development of a single unit, which is fabricated by casting silicone inside specific molds. The result consists in an elastomeric cylinder including three flexible pneumatic actuators that enable elongation and omni-directional bending of the unit. An external braided sheath improves the motion of the module. In the center of each module a granular jamming-based mechanism varies the stiffness of the structure during the tasks. Tests demonstrate that the module is able to bend up to 120&#176; and to elongate up to 66% of the initial length. The module generates a maximum force of 47 N, and its stiffness can increase up to 36%.

This paper describes the design and fabrication of a soft unit for surgical manipulators. The base module includes three flexible fluidic actuators to achieve omnidirectional bending and elongation, and a granular jamming-based mechanism to enable stiffness control. A complete mechanical characterization is also reported.

低侵襲手術でのソフトモジュラーロボットのエラストマーユニットの設計と製作

In recent years, soft robotics technologies have aroused increasing interest in the medical field due to their intrinsically safe interaction in ...

Outer-Boundary Assisted Segmentation and Quantification of Trabecular Bones by an Imagej Plugin

Micro-computed tomography (micro-CT) is routinely used to assess bone quantity and trabecular microstructural properties in small animals under different bone loss conditions. However, the standard approach for trabecular analysis of micro-CT images is slice-by-slice semi-automatic hand-contouring, which is labor intensive and error prone. Described here is an efficient method for automatic segmentation of trabecular bones according to the bone's outer boundaries, where trabecular bones can be identified and segmented automatically with accuracy with less operator bias when appropriate segmentation parameters are set. To profile satisfactory segmentation parameters, an image stack of segmentation results is displayed, where all possible combinations of the segmentation parameters are changed one by one in sequence, and segmentation results with associated parameters can easily be visually checked. As a quality-control feature of the plugin, simulated standard objects are quantified where the measured quantities can be compared with theoretical values. Layer-by-layer quantification of trabecular properties and trabecular thicknesses are reported by such a plugin, and the distributions of such properties within the selected regions can be profiled easily. Although layer-by-layer quantification retains more information about trabecular bones and facilitates further statistical analysis of structural changes, such measures are unavailable from the output of current commercial software, where only a single quantified value for each parameter is reported for each sample. Therefore, the described workflows are better approaches for analyzing trabecular bones with accuracy and efficiency.

We present a workflow for segmenting and quantifying trabecular bones for 2D and 3D images based on the bone&#39;s outer boundary using an ImageJ plugin. This approach is more efficient and accurate than the current manual hand-contouring approach, and provides layer-by-layer quantifications, which are not available in current commercial software.

外側境界セグメンテーションと Imagej のプラグインで海綿骨の定量化を支援

Micro-computed tomography (micro-CT) is routinely used to assess bone quantity and trabecular microstructural properties in small animals under different ...

Biaxial Mechanical Characterizations of Atrioventricular Heart Valves

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive models, which provide a mathematical representation of the mechanical function of those structures. This presented biaxial mechanical testing protocol involves (i) tissue acquisition, (ii) the preparation of tissue specimens, (iii) biaxial mechanical testing, and (iv) postprocessing of the acquired data. First, tissue acquisition requires obtaining porcine or ovine hearts from a local Food and Drug Administration-approved abattoir for later dissection to retrieve the valve leaflets. Second, tissue preparation requires using tissue specimen cutters on the leaflet tissue to extract a clear zone for testing. Third, biaxial mechanical testing of the leaflet specimen requires the use of a commercial biaxial mechanical tester, which consists of force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation testing protocols to characterize the leaflet tissue&#39;s mechanical properties. Finally, post-processing requires the use of data image correlation techniques and force and displacement readings to summarize the tissue&#39;s mechanical behaviors in response to external loading. In general, results from biaxial testing demonstrate that the leaflet tissues yield a nonlinear, anisotropic mechanical response. The presented biaxial testing procedure is advantageous to other methods since the method presented here allows for a more comprehensive characterization of the valve leaflet tissue under one unified testing scheme, as opposed to separate testing protocols on different tissue specimens. The proposed testing method has its limitations in that shear stress is potentially present in the tissue sample. However, any potential shear is presumed negligible.

This protocol involves characterizations of atrioventricular valve leaflets with force-controlled, displacement-controlled, and stress-relaxation biaxial mechanical testing procedures. Results acquired with this protocol can be used for constitutive model development to simulate the mechanical behavior of functioning valves under a finite element simulation framework.

房室弁の二軸の機械特性

Extensive biaxial mechanical testing of the atrioventricular heart valve leaflets can be utilized to derive&#160;optimal parameters used in constitutive ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

皮膚における遺伝的にタグ付けされたレポーター細胞の生体内2色2光子イメージング

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Cantilever Bending of Murine Femoral Necks

Fractures in the femoral neck are a common occurrence in individuals with osteoporosis. Many mouse models have been developed to assess disease states and therapies, with biomechanical testing as a primary outcome measure. However, traditional biomechanical testing focuses on torsion or bending tests applied to the midshaft of the long bones. This is not typically the site of high-risk fractures in osteoporotic individuals. Therefore, a biomechanical testing protocol was developed that tests the femoral necks of murine femurs in cantilever bending loading to replicate better the types of fractures experienced by osteoporosis patients. Since the biomechanical outcomes are highly dependent on the flexural loading direction relative to the femoral neck, 3D printed guides were created to maintain a femoral shaft at an angle of 20&#176; relative to the loading direction. The new protocol streamlined the testing by reducing variability in alignment (21.6&#176; &plusmn; 1.5&#176;, COV = 7.1%, n = 20) and improved reproducibility in the measured biomechanical outcomes (average COV = 26.7%). The new approach using the 3D printed guides for reliable specimen alignment improves rigor and reproducibility by reducing the measurement errors due to specimen misalignment, which should minimize sample sizes in mouse studies of osteoporosis.

The present protocol describes the development of a reproducible testing platform for murine femoral necks in a cantilever bending set-up. Custom 3D printed guides were used to consistently and rigidly fix the femurs in optimal alignment.

マウス大腿骨首のカンチレバー曲げ

Fractures in the femoral neck are a common occurrence in individuals with osteoporosis. Many mouse models have been developed to assess disease states and ...