VMXiビームラインの設計、建設、運用に貢献した多くのダイヤモンド光源の科学者とサポートチームメンバーに感謝します。ビームライン利用者の皆様には、結晶化・データ収集パイプラインの開発にアイデアを寄せていただき、感謝しています。ハーウェルの結晶化施設は、Diamond Light Source Ltd、Rosalind Franklin Institute、およびMedical Research Councilの支援を受けています。

タンパク質の自動結晶化とリアルタイムデータ収集

<ol>
	<li>Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=20+years+of+crystal+hits:+Progress+and+promise+in+ultrahigh-throughput+crystallization+screening.">20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 3), 198-205 (2023).</li><li>Fischer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+room+temperature+crystallography.">Macromolecular room temperature crystallography.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 54, 1 (2021).</li><li>Helliwell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+structural+chemistry+of+the+living+organism+at+its+temperature+and+pressure.">What is the structural chemistry of the living organism at its temperature and pressure.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (Pt 2), 87-93 (2020).</li><li>Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+biomolecular+structures+near+room+temperature+using+x-ray+crystallography:+Concepts,+methods+and+future+optimization.">Determining biomolecular structures near room temperature using x-ray crystallography: Concepts, methods and future optimization.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 1), 78-94 (2023).</li><li>Keedy, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+cryocooling+distorts+conformational+heterogeneity+in+a+model+michaelis+complex+of+dhfr.">Crystal cryocooling distorts conformational heterogeneity in a model michaelis complex of dhfr.</a> Structure. 22 (6), 899-910 (2014).</li><li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+ligand+binding+of+endothiapepsin+by+'temperature-resolved'+macromolecular+crystallography.">Probing ligand binding of endothiapepsin by 'temperature-resolved' macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 8), 964-974 (2022).</li><li>Sanchez-Weatherby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vmxi:+A+fully+automated,+fully+remote,+high-flux+in+situ+macromolecular+crystallography+beamline.">Vmxi: A fully automated, fully remote, high-flux in situ macromolecular crystallography beamline.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 26 (Pt 1), 291-301 (2019).</li><li>Jacquamet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+vapor+diffusion+crystallization+drops+with+an+x-ray+beam.">Automated analysis of vapor diffusion crystallization drops with an x-ray beam.</a> Structure. 12 (7), 1219-1225 (2004).</li><li>Mikolajek, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-to-structure+pipeline+for+ambient-temperature+in+situ+crystallography+at+vmxi.">Protein-to-structure pipeline for ambient-temperature in situ crystallography at vmxi.</a> IUCrJ. 10, 420-429 (2023).</li><li>Douangamath, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Achieving+efficient+fragment+screening+at+xchem+facility+at+diamond+light+source.">Achieving efficient fragment screening at xchem facility at diamond light source.</a> Journal of Visualised Experiments. (171), (2021).</li><li>Delageniere, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ispyb:+An+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography.">Ispyb: An information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li><li>Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., Mcauley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchweb:+A+modern+interface+for+ispyb.">Synchweb: A modern interface for ispyb.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (Pt 3), 927-932 (2015).</li><li>Jenkins, J., Cook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito&#174;:+An+accurate+nanoliter+dispensing+technology.">Mosquito&#174;: An accurate nanoliter dispensing technology.</a> JALA: Journal of the Association for Laboratory Automation. 9 (4), 257-261 (2016).</li><li>Gildea, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xia2.Multiplex:+A+multi-crystal+data-analysis+pipeline.">Xia2.Multiplex: A multi-crystal data-analysis pipeline.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 6), 752-769 (2022).</li><li>Winter, G., Mcauley, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+data+collection+for+macromolecular+crystallography.">Automated data collection for macromolecular crystallography.</a> Methods. 55 (1), 81-93 (2011).</li><li>Jumper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+accurate+protein+structure+prediction+with+alphafold.">Highly accurate protein structure prediction with alphafold.</a> Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).</li><li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dials+as+a+toolkit.">Dials as a toolkit.</a> Protein Science. 31 (1), 232-250 (2022).</li></ol>

著者は利益相反がないことを宣言します。

CFへのタンパク質サンプルの到着から、さらなるアプリケーションのためのユーザーによる最終データのダウンロードまでの全手順を説明しました。重要なステップは、市販のスパースマトリックススクリーニングまたは確立された条件に基づく最適化スクリーニングのいずれかを使用して、高品質のタンパク質サンプルと適切なクリスタルスクリーニングを製造することです。このプロセスはCFで行われる場合もあれば、ユーザーが自宅の研究室で結晶化手順を実行し、適切な結晶化プレートをビームラインに持ち込むこともできます。適切なデータ収集パラメータの特定は、特定のサンプル、特に放射線損傷が懸念される場合に重要な場合があります。ほとんどの場合、科学的な疑問に答えるには、自動データ処理で十分ですが、例えば、空間群が曖昧な場合や、放射線障害の影響を最小限に抑えるために収集されたデータの最初の部分のみを使用する場合など、ユーザーはビームラインツールを使用して再処理することができます。
最初の結晶化試験から適切な結晶が生成されない場合は、結晶播種の使用と同様に、タンパク質濃度、純度、または結晶化スクリーニングの変化を調べることができます。結晶がビームラインで有用な分解能に回折しない場合は、減衰していないビームでグリッドスキャンを使用して、結晶固有の回折限界と単位セルを評価し、最適化の取り組みを導くことができます。プレート内のデータ収集には小さすぎる結晶(例:<10 μm)は、代わりに連続結晶構造解析またはナノフォーカス実験(例:ダイヤモンドビームラインVMXm)に適している場合があります。VMXiデータを使用した構造の解析は、特に効果的な検索モデルを提供するAlphafold16 の出現以来、分子置換によって一般的に簡単になりました。これがうまくいかない場合は、従来の単一波長異常回折、多波長異常回折、または長波長位相実験を可能にするために、プレートから結晶を回収して凍結冷却することができます。
この方法の利点は、結晶が成長した環境から結晶を乱すことなく、結晶化プレートから直接迅速で高品質のデータセットとフィードバックを取得できることが含まれます。構造生物学におけるいわゆる「室温ルネッサンス」では、非極低温条件下で得られた構造を重視し、より生理学的関連性とタンパク質動態を探求できるようにしています2。通常、最適化されたクライオ冷却結晶よりもわずかに低い分解能が達成されるが、それは適切なクライオ条件が確立され、結晶が結晶化滴3の機械的取り扱いおよび開口に対して堅牢である場合に限られる。このパイプラインが非常に適している今後のアプリケーションは、創薬における室温でのタンパク質-リガンド複合体またはフラグメントキャンペーンの大規模なスクリーニングです。リガンドまたはフラグメントは、室温でのデータ収集の前に、ピペットまたはアコースティックドロップエジェクションによって共結晶化または添加することができます。また、数百または数千の結晶からのデータを非常に効率的な方法で迅速に測定し、DIALS17 マルチプレックス14 ソフトウェアを使用して、異なる生物学的実体を表す同形クラスターを抽出したり、異なる方法で処理されたり、異なるリガンドやシグナルに曝露されたりした結晶の集団間で統計的に有意な差を確立することも応用できます。

X線結晶構造解析は、タンパク質の構造と機能を理解するための重要なツールであり、タンパク質やその複合体と基質や薬剤候補などの高分解能構造を提供します。しかし、多くの場合、望ましい特性(回折性が高く、浸漬に適し、双晶などの結晶病理を伴わない結晶形態)を得ることは、依然としてかなりのボトルネックとなっています1。タンパク質結晶を製造するのに適した化学条件は一般に予測できないため、何千もの潜在的な化学混合物を探索する結晶化スクリーニングが標準であり、多くの場合、記録された結晶化滴画像を監視するためのスクリーニングとクリスタルホテルを設定する自動化/ロボット工学の支援を受けます。
結晶が現れたら、通常、ナイロンまたはカプトンループを使用して結晶化環境から回収し、凍結保護剤を含む液滴に移してから、液体窒素に沈没凍結する必要があります。結晶化とX線データ収集の間のこれらの追加ステップには、密閉環境が破壊されたときの結晶化滴の脱水、取り扱い時の結晶への機械的ストレス、および結晶格子への凍結保護剤による損傷(通常、モザイク拡散の増加)などの要因が含まれる可能性があります2.さらに、結晶の採取には時間と労力がかかり、特に採取プロセス中に液滴に皮膚が形成された場合、サンプル間の不均一性につながる可能性があります。VMXiビームラインは、プレートに付着した結晶から、データ収集のために廃棄される使用可能なデータへのアクセスを提供します。
X線の結晶構造の大部分は、上記のアプローチを使用して100Kで決定されるため、結晶の輸送と取り扱いが容易になり、X線ビームの結晶寿命が桁違いに長くなります。しかし、非極低温条件下、つまりタンパク質機能に関連する生理学的条件にはるかに近い下で構造を決定することへの関心が高まっています2,3,4。これにより、タンパク質の動的構造をよりよく理解し、機能的に関連性のない状態で凍結するアミノ酸コンフォメーションやループを回避し5、細胞や生物内のタンパク質の自然環境6にはるかに近い条件下でリガンド結合を探索することができます。
英国のダイヤモンド光源シンクロトロンの多用途高分子結晶構造解析in situ(VMXi)ビームラインで実施されている別のアプローチは、結晶が成長した環境(つまり、結晶化プレート内)で、周囲条件下で、外乱なしに結晶から直接回折データを測定することです7,8。.これにより、結晶化スクリーニングと最適化からの非常に迅速なフィードバックが可能になり、ユーザーを要件に最適な結晶形に導きます。また、高品質の室温構造を自動化して製造することもできます9。
このプロトコルは、ユーザーが結晶化の準備ができている高純度のタンパク質サンプルを持っていることを前提としています。本稿では、ハーウェルの結晶化施設にアクセスしてタンパク質結晶を作製し、ビームラインVMXiを使用してデータ収集を行うユーザーエクスペリエンスについて説明します(図1)。
ハーウェルの結晶化施設
ハーウェル(CF)の結晶化施設は、ダイヤモンド光源に隣接するハーウェル(RCaH)の研究施設にあります。この施設は、結晶化スクリーニング、結晶最適化、結晶イメージング、および特性評価にロボットを使用して、高分子結晶化のためのハイスループット自動ラボをユーザーに提供します。高度に自動化されたVMXiビームラインとの緊密な統合により、室温構造の決定ペースが大幅に加速し、非極低温条件下で、新しいタンパク質構造、タンパク質-リガンドおよびDNA-リガンド複合体の特性評価、および自動フラグメントスクリーニング(図1)が可能になりました。
CFパイプラインは、可溶性タンパク質および膜タンパク質の結晶化のためのナノリットル結晶化ロボット9 、市販の結晶化スクリーニングおよび複雑なカスタム最適化スクリーニングを調製するためのリキッドハンドリングロボット、および結晶化プレートのイメージング用の4つのイメージング装置(4°Cで1台、20°Cで3台)を含む一連の装置です( 材料表を参照)).1台のイメージャーは脂質立方晶相(LCP)ガラス板のイメージングが可能で、もう1台のイメージャーは多蛍光光学系(いずれも20°C)を備えています。
この施設は現在、膜タンパク質研究所(MPL;https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html)、XChemフラグメントスクリーニング施設 10、MXビームライン、XFELハブ、ならびにRosalind Franklin Institute(RFI)。この確立され最適化されたパイプラインにより、幅広い構造生物学プロジェクトで結晶化実験を実施することができました。このホワイトペーパーでは、VMXiでのデータ収集を目的とした結晶のパイプラインについて説明しますが、結晶を採取してクライオ冷却したり、XChemパイプラインに送ったりすることもできます。
ユーザーアクセスはダイヤモンドMXプロポーザルシステム(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html)を通じて割り当てられ、産業ユーザーはダイヤモンド業界リエゾングループを通じてサポートされます。すべてのユーザーは、手作業で輸送できるサンプルまたはプレートを持って現場に来ることができます。私たちの経験では、液滴が分配された場所から遠ざかったり、結晶化リザーバーによって滴が損傷したりする可能性があるため、宅配便でプレートを送ることはお勧めしません。また、ユーザーは、タンパク質サンプルをCFに送り、スタッフが代理で結晶化実験を行うこともできます。実験は、CFの場合はRock Maker Webにログオンするか、VMXiの場合はISPyBを介して、ユーザーがリモートで監視できます。CFへのアクセスは、Diamondで収集されたX線回折結果に基づいて反復的に実行できます。
ダイヤモンド光源ビームラインVMXi
ビームラインVMXi(以下、ビームライン)は、室温で高度に自動化されたX線結晶構造解析装置で、適切な結晶化プレート内の結晶からのデータ測定に重点を置いた、最近開発されたユニークな装置です。このビームラインは、マイクロフォーカス(10 x 10 μm)、ピンクビーム(バンドパス<5 × 10-2ΔE/E)で、~2 ×10 13 光子/秒(16 KeV時)の高フラックスを提供します7。この高フラックスビームは、高速検出器と相まって、サンプルの非常に高いスループットと、10 μm以上のサイズのサンプルからのデータ収集を可能にします。
結晶化プレートは、ISPyB11 インターフェースSynchWeb12を使用してプレートを登録しながら、サンプルストレージシステムに保管され、ユーザーから提供されたスケジュールに基づいてイメージングされることでビームラインに入ります。通常、ユーザーはイメージング用の時点のフィボナッチ数列(0、12、24、36、60...プレートがシステムに挿入されてから7,320時間)。プレートが画像化されると、ユーザーに電子メールで通知されます。可視光とUV光の両方のイメージングは、ユーザーがオンデマンドで利用できます。サンプルストレージシステムによって撮影された画像は、機械学習アルゴリズムによって分析されます。これにより、結晶に似たオブジェクトの関心のあるポイントが自動的に特定され、ユーザーがデータ収集のためにキューに追加できる関心のあるポイントが登録されます。ユーザーは、可視光画像を手動でクリックして関心のあるポイントを登録したり、ラスタースキャンで分析する領域をクリックしてドラッグしたりすることもできます。これらのポイントは、自動的に配置されたポイントと一緒にキューに追加できます。
すべてのサンプルがデータ収集に適したパラメーターを持つと、プレートはキューに入ります。プレートがキューの一番上に到達すると、自動的にビームラインに分注されます。結晶化プレートは、ロボットアームによって結晶ホテルからビームラインに自動的にロードされ、画像マッチングに続いて、ユーザー定義の指示に従って、選択した各結晶から最大60°回転の結晶学的データセットが測定されます。プレート内のすべての液滴は、ビームライン上でのこれらの実験に使用できます。複数の結晶からデータをマージして、同型で最適にマージされたデータセットを自動化された方法で生成します7,9。キューに入れられたすべてのデータセットが収集されると、他のDiamond MXビームラインと同様に、ISPyB11でデータセットを表示するためのリンクが記載された電子メールがユーザーに送信されます。また、ビームラインのWebページ(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html)にも移動します。

<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Formulator</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>on request</td>
			<td>Liquid handling robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formulatrix imager</td>
			<td>Formulatrix</td>
			<td>on request</td>
			<td>Crystallisation plate imager</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner CrystalQuick X&#160;</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>Z617644</td>
			<td>Crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gryphon&#160;</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>620-1000-10&#160;</td>
			<td>Crystalisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiTeGen Insitu-1</td>
			<td>Mitegen</td>
			<td>InSitu-01CL-40</td>
			<td>Crystallisation plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito LCP&#160;</td>
			<td>(SPT Labtech)</td>
			<td>on request</td>
			<td>Crystallisation robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock Imager &#38; Maker</td>
			<td>Formualtrix</td>
			<td>on request</td>
			<td>
			Software for Imager 
 [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scorpion</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>640-1000-10&#160;</td>
			<td>
			Liquid handling robot 
			https://www.artrobbins.com/scorpion
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

crystallization and in situ room temperature data collection using the crystallization facility at harwell and beamline vmxi, diamond light source

ハーウェルの結晶化施設を使用したロボットタンパク質結晶化のプロトコルと、ダイヤモンド光源ビームラインVMXiの結晶化プレートからの その場 室温データ収集について説明します。このアプローチにより、複数の結晶から高品質の室温結晶構造を簡単に決定でき、結晶化試験の結果を非常に迅速にフィードバックできるだけでなく、連続結晶構造解析が可能になります。タンパク質の構造、リガンド結合、およびダイナミクスを理解する上での室温構造の価値は、構造生物学のコミュニティでますます認識されるようになっています。このパイプラインは、複数のアクセスモードを使用して、世界中のユーザーがアクセスできます。セットアップされた結晶化実験は、機械学習ツールを使用して自動的に識別された結晶を使用して、リモートで画像化および表示できます。データは、プレート内のユーザーが選択した結晶から最大60°回転するデータセットを備えたキューベースのシステムで測定されます。特定のウェルまたはサンプルグループ内のすべての結晶からのデータは、xia2.multiplexを使用して自動的にマージされ、出力はWebブラウザインターフェイスを介して直接アクセスできます。

X-ray crystallography remains a key tool for understanding protein structure and function, providing high-resolution structures of proteins or their complexes with, for example, substrates or drug candidates. In many cases, however, obtaining crystals with desirable properties - highly diffracting, crystal form amenable to soaking and without crystal pathologies such as twinning - remains a considerable bottleneck1. As suitable chemical conditions to produce protein crystals cannot, in general, be predicted, crystallization screening exploring thousands of potential chemical mixtures is standard, often aided by automation/robotics in setting screens and crystal hotels for monitoring, often remotely, the crystallization drop images that are recorded.
When crystals appear, typically they must be harvested from the crystallization environment using a nylon or Kapton loop and then, transferred to a droplet containing a cryoprotection agent (the search for which is an additional variable) before plunge-freezing into liquid nitrogen. These additional steps between crystallization and X-ray data collection can involve dehydration of the crystallization drop when its sealed environment is broken, mechanical stresses on the crystal when it is handled, and damage from the cryoprotection agents to the crystal lattice (typically resulting in increased mosaic spread) amongst other factors2. In addition, crystal harvesting is time- and labor-intensive and can lead to inhomogeneity between samples, especially when skin forms on drops during the harvesting process. The VMXi beamline gives access to useable data from crystals that are stuck to the plate, which would otherwise be discarded for data collection.
The vast majority of X-ray crystal structures are determined at 100K using the above approach, enabling straightforward crystal transport and handling and increasing crystal lifetime in the X-ray beam by orders of magnitude. There is increasing interest, however, in determining structures under non-cryogenic conditions, that is, much closer to the physiological conditions relevant to protein function2,3,4. This enables a much better appreciation of the dynamic structure of proteins, avoids amino acid conformations or loops being frozen out in functionally non-relevant states5, and enables ligand binding to be explored under conditions much closer to those in the protein&#39;s natural environment within the cell and organism6.
An alternative approach, implemented at the Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline at the Diamond Light Source synchrotron, UK, is to measure the diffraction data directly from crystals within the environment in which they have grown (i.e., within the crystallization plate), under ambient conditions and without disturbance7,8. This enables very rapid feedback from crystallization screens and optimizations to guide a user to an optimal crystal form for their requirements. It also enables high-quality room-temperature structures to be produced in an automated manner9.
This protocol assumes that a user has a highly pure protein sample ready for crystallization. We describe the user experience accessing the Crystallization Facility at Harwell to produce protein crystals and then use beamline VMXi for data collection (Figure 1).
The Crystallization Facility at Harwell
The Crystallization Facility at Harwell (CF) is located in the Research Complex at Harwell (RCaH) adjacent to the Diamond Light Source. The facility offers users a high-throughput automated laboratory for macromolecular crystallization, using robotics for crystallization screening, crystal optimization, crystal imaging, and characterization. Through close integration with the highly automated VMXi beamline, the pace of determining room temperature structures has greatly accelerated and enables the characterization of novel protein structures, protein-ligand and DNA-ligand complexes, as well as automated fragment screening (Figure 1), all under non-cryogenic conditions.
The CF pipeline is a suite of instrumentation encompassing nanoliter crystallization robots9 for the crystallization of soluble and membrane proteins, liquid handling robots to prepare commercial crystallization screens and complex custom optimization screens, and four imaging instruments (one at 4 &#176;C and three at 20 &#176;C for the imaging of crystallization plates (see the Table of Materials). One imager is capable of imaging lipid cubic phase (LCP) glass plates and one imager is equipped with multi-fluorescence optics (both at 20 &#176;C).
The facility is now used widely by a broad spectrum of academic and industrial users, including the Membrane Protein Laboratory (MPL;https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), the XChem fragment screening facility 10, MX beamlines, the XFEL-hub, as well as the Rosalind Franklin Institute (RFI). This well-established and optimized pipeline has enabled crystallization experiments to be performed across a wide spectrum of structural biology projects. This paper describes the pipeline for crystals intended for data collection at VMXi, although crystals may also be harvested and cryo-cooled or directed to the XChem pipeline.
User access is allocated through the Diamond MX proposal system (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) and industrial users are supported through the Diamond Industry Liaison group. All users can come to the site with their sample(s) or plates, which can be transported by hand. It is not recommended to send plates by courier as our experience suggests that drops can move away from the location in which they were dispensed, or drops may be damaged by the crystallization reservoir. Alternatively, by arrangement, users can send their protein samples to the CF, where members of staff set up crystallization experiments on their behalf. The experiments can be monitored remotely by the user by either logging on to Rock Maker Web in the case of CF or via ISPyB in the case of VMXi. Access to the CF can be carried out in an iterative fashion based on the X-ray diffraction results collected at Diamond.
Beamline VMXi at Diamond Light Source
Beamline VMXi (hereafter referred to as &#34;the beamline&#34;) is a unique and recently developed instrument fully dedicated to room-temperature, highly automated X-ray crystallography with a focus on measuring data from crystals within suitable crystallization plates. The beamline offers a micro focus (10 x 10 &#181;m), pink beam (band pass of &#60;5 &#215; 10-2&#916;E/E) with a high flux of ~2 &#215; 1013 photons/s (at 16 KeV)7. This high-flux beam, coupled with a fast detector, enables very high throughput of samples and collection of data from samples upwards of 10 &#181;m in size.
Crystallization plates enter the beamline by being stored in a sample storage system and imaged based on the schedule provided by the user while registering the plates using the ISPyB11 interface SynchWeb12. Typically, users are advised to select a Fibonacci sequence of time points for imaging (0, 12, 24, 36, 60&#8230;7,320 h from the plate being entered into the system). The user is informed by email once a plate has been imaged. Both visible light and UV light imaging are available to users on demand. The images taken by the sample storage system are analyzed by a machine learning algorithm; this automatically locates and defines points of interest of objects that resemble crystals and registers the points of interest ready for the user to add to a queue for data collection. Users may also manually click on the visible light images to register points of interest or can click and drag a region to be analyzed by raster scan. These points are available to users to add to the queue alongside the automatically located points.
Once all samples have appropriate parameters for data collection, the plate enters a queue. When the plate reaches the top of the queue, it is automatically dispensed to the beamline. The crystallization plates are loaded from the crystal hotels into the beamline automatically by a robotic arm, and following image matching, crystallographic data sets of up to 60&#176; rotation are measured from each selected crystal as per user defined instructions. All drops within a plate may be used for these experiments on the beamline. Data are merged from multiple crystals to produce isomorphous, optimally merged data sets in an automated manner7,9. Once all of the queued data sets are collected, the user is sent an email with a link to follow to view the data sets in ISPyB11, as in other Diamond MX beamlines. Users are also directed to the beamline web page (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html).&#160;

著者スポットライト:医薬品開発のためのタンパク質構造解析の進歩 

Harwellの結晶化施設とダイヤモンド光源Beamline VMXiを用いた結晶化とその 場 室温データ収集

Understanding the three dimensional structures of proteins underpins drug design, biotechnology, and our understanding of many different diseases. VMXI determines protein structures without cryo cooling, so much closer to their natural temperatures. VMXI also measures diffraction data from protein crystals while still in their crystallization plates, avoiding any damage from mechanical handling.In the future, we really want to exploit the incredible throughput of VMXI to explore large populations of crystals to identify lots of different structural states rather than the single structure people often obtain now. We also want to push towards drug development and carrying out fragment screening and optimization within crystallization plates. A new approach that shows enormous promise.

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Protein Structure Analysis for Drug Development at JoVE.com

ハーウェル研究施設の結晶化施設を使用したタンパク質の結晶化のプロトコルと、その後のダイヤモンドの多用途高分子結晶構造解析in situ(VMXi)ビームラインでのプレート内の結晶からのその場X線結晶学的データ収集を紹介します。サンプル要件、結晶化プロトコル、およびデータ収集ガイドラインについて説明します。

Protocols for robotic protein crystallization using the Crystallization Facility at Harwell and in situ room temperature data collection from ...

タンパク質の3次元構造を理解することは、医薬品設計、バイオテクノロジー、そしてさまざまな疾患の理解を支えています。VMXIは、クライオ冷却なしでタンパク質の構造を決定するため、自然温度にはるかに近い温度になります。また、VMXIは、結晶化プレート内のタンパク質結晶からの回折データも測定し、機械的な取り扱いによる損傷を回避します。将来的には、VMXIの驚異的なスループットを利用して、大量の結晶を探索し、現在よく得られる単一の構造ではなく、多くの異なる構造状態を特定したいと考えています。また、創薬や結晶化プレート内のフラグメントスクリーニングや最適化にも力を入れていきたいと考えています。大きな可能性を秘めた新しいアプローチです。

crystallization-situ-room-temperature-data-collection-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source

2.2K ビュー.  Harwell Science and Innovation Campus. タンパク質の3次元構造を理解することは、医薬品設計、バイオテクノロジー、そしてさまざまな疾患の理解を支えています。VMXIは、クライオ冷却なしでタンパク質の構造を決定するため、自然温度にはるかに近い温度になります。また、VMXIは、結晶化プレート内のタンパク質結晶からの回折データも測定し、機械的な取り扱いによる損傷を回避します。将来的に?...