標準的なサンプル調製は、微小結晶のX線回折実験中に良好な信号対雑音を達成することを困難にします。このプロトコルは、制御された方法で形成された結晶の背景のソースを減らすことを目的としています。パンチ凍結ロボット工学とクライオテムグリッドの使用は、マイクロクリスタルを繰り返し操作し、周囲の液体量を減らし、サンプルの急速なガラス化を提供するための堅牢なプラットフォームを提供します。
グリッドを処理するために必要な器用さは、従来の結晶収穫に必要な器用さと同様です。もう一つの重要な要因は、結晶化溶液を用いた初期ブロッティングパラメータの決定であり、これはサンプル使用量を減らす鍵となる。まず、メーカーの指示に従って自動プランジ冷凍庫をセットアップして冷却します。
使用直前に、グローは15ミアンペア電流と0.39ミリバール圧で25秒間クライオTEMグリッドを排出し、覆われたペトリ皿にグロー放電グリッドを保持します。サンプルチャンバの相対湿度を90%、ブロッティング時間を5秒に設定します。プランジ冷凍庫が、ブロッティングが完了した後にサンプルを自動的に突っ込むように設定されていることを確認します。
結晶化ウェルとリザーバーのシールを開きます。水滴に2~5マイクロリットルのリザーバー溶液を素早く加えて、滴の体積を維持します。リザーバー溶液の10マイクロリットルを0.5ミリリットルのチューブに移して後で使用し、結晶化の低下が乾燥するのを防ぐために井戸を再密封します。
プランジ凍結鉗子を使用して、単一のグロー放電グリッドを選択し、ブロットアームから離れた側に向けたカーボン側を持つ機器にグリッドをロードします。グリッドを保持する鉗子を回転させて、カーボン側がブロッティングアームに向かるようにします。2.5マイクロリットルのピペットを使用して、2マイクロリットルのリザーバ溶液をcryoTEMグリッドの非支持側に塗布します。
炭素側をブロッティングアームから離してグリッドを回転させ、リザーバー液をグリッドの炭素膜支持側に慎重に塗布します。ブロッティングプロセスを開始し、グリッドの表面を横切って飛び出す波が見えるまで、炭素表面から引き出された液体を観察します。飛び出す波が見えない場合は、ブロッティングアームがグリッドから引き込む前に、ブロッティング時間を1~2秒長くします。
結晶化プレートを光顕微鏡の下に置き、視野内にターゲットを十分に配置します。プランジフリーザーに新しいグロー放電グリッドを配置し、前述のように、グリッドの非支持側にリザーバー液を適用します。プランジフリーザーのサンプルポートに面したカーボンフィルム支持側でグリッドを回転させます。
結晶板から一時的なシールを剥がし、2マイクロリットルに設定されたピペットを使用して、結晶化液を繰り返し軽く吸引します。吸気したマイクロクリスタルスラリーの2マイクロリットルをプランジフリーザーに移し、すべてのサンプルをクライオテムグリッドのカーボン側に塗布します。ブロッティングを開始し、飛び出す波を観察し、すぐにプランジ凍結を開始します。
液体エタンから液体窒素に浸したグリッドボックスにグリッドを素早く移します。グリッドを吸い込んで突っ込んだ後、プランジ冷凍庫をリセットして、液体エタンから突っ込んだグリッドを引き込む。グリッドを保持している鉗子をプランジフリーザーから取り出し、グリッドを光顕微鏡の下に置きます。
細かい焦点を調整し、グリッド全体の結晶の密度を評価します。SEMにクライオテムグリッドをロードした後、サンプルを整列させ、電子ビームをオンにします。最初に45倍の倍率でグリッド全体を評価し、画像を記録し、個々の結晶が明確に観察されるまで、個々のグリッドの正方形の詳細な検査のための拡大を増加させます。
グリッドの周りを移動し、静止画像をキャプチャし、グリッドが平らで、炭素支持フィルムが大部分が無傷であることを確認します。結晶を取り囲むガラス化された液体の狭いハローを持つ多数の単結晶があることを確認し、穴は、炭素支持膜に見えます。グリッドの画像を観察してキャプチャしている間、ガラス化された液体の大きな領域が存在せず、六角形の氷や表面氷がグリッド全体に散らばっていないか、そして結晶が重なり合って支持体全体に均等に分布していないことを確認してください。
大きな泡のデュワーで、サンプルカートリッジにロードされたVMXmサンプルホルダーの必要数を冷却します。サンプルローダーのサンプル位置の上に液体窒素を加えます。マイクロクリスタルを搭載したグリッドボックスをサンプルローダーのグリッドボックスの凹部に素早く移し、蓋を緩めて回転可能に保つために蓋を少し緩めます。
グリッドボックスからグリッドを持ち上げ、グリッドを回転させて、グリッドをサンプルホルダーに平らに配置します。グリッドの開口部のグリッド上に冷却されたサークリップツールを素早く配置し、ボタンを押してサークリップをインストールします。サンプルホルダーの上に約1.5センチメートルの液体窒素を加えます。
VMXm サンプル鉗子を使用して、ロードされたサンプルホルダーを慎重に持ち上げて、サンプルカートリッジに戻します。カートリッジの蓋を交換し、カートリッジの上部にあるピンが蓋の穴にかかっていることを確認します。クライオテムグリッド上で調製された微結晶の走査電子顕微鏡写真は、最小背景散乱を示した。
グリッドは過剰な液体から解放され、結晶を取り巻く液体の狭いハローが観察された。多面体結晶は、束の中で同様に個別に観察された。わずかに大きいインスリン結晶はまた、単離された結晶と一緒にいくつかの凝集を示した。
非常に大きなマイクロクリスタルもクライオテムグリッドに取り付けられ、成功しました。炭素支持膜の穴ははっきりと見え、強いブロッティングを示した。多くのサンプルは、ブロッティング時間とマイクロ結晶の濃度の変動のために、さらなる最適化が必要でした。
結晶で過負荷の格子は、ブロッティング効率を低下させ、複数の格子は、単一の回折画像に記録されました。高粘性結晶化溶液の短いブロッティング時間は、過度に湿ったサンプルをもたらすことができます。低粘度結晶化液の場合、短いブロッティング時間は、グリッドの片側の微結晶の盗難につながります。
最適なサンプル調製により、VMXmの全機能を活用して、高い信号対雑音比で可能な限り最高の解像度で高品質のX線回折データを収集することが可能になります。結晶化溶液の初期ブロッティングを決定することは、最小限のサンプルを使用する鍵です。サンプルが非常に限られている場合は、密度評価をスキップします。
最終的には、希釈されたサンプルを持っている方が良いです。これらのサンプルは、マイクロEDの前にVMXmビームライン、マイクロ結晶電子回折、または集光イオンビーム粉砕でのX線回折実験の準備が整いました。
