この方法により、生物学的細胞全体で超分解能のクライオイメージングが可能になり、細胞構造を正確に同定することができます。また、相関イメージングワークフローの一部として、他のモダリティと組み合わせて使用することもできます。この技術の主な利点は、超分解能イメージングは、従来のフルオロフォアおよび比較的低い光用量を使用して極低温条件で迅速に行うことができるということです。
CyroSIMは、内部または外部の手がかりに応答して細胞の超構造ダイナミクスを理解するための洞察を提供する強力なツールです。そのアプリケーションには、ワクチンの生産とロールアウト、品質管理、市場後の監視、抗体工学と最適化、ならびにナノ粒子の特性評価が含まれます。クライオステージ内の操縦サンプルは、グリッドの安全性を確保するために練習を行います。
また、データ収集の前に「コックピット」ウィンドウのコントロールに慣れるのも最適です。まず、クライオステージの外的なデュワーから蓋を取り出し、約4分の1がいっぱいになるまで濾過した液体窒素を注ぎます。最初の沸騰が沈静化するまで待ってから、より多くを注ぎ、容器を約3分の2に満たします。
液体窒素が沸騰する場合は、ノズルをハンドラから離して慎重に交換します。液体窒素が出口から出て停止したら、出口パイプをステージデュワーの上にクライオステージに置きます。電源を接続し、USBケーブルを接続し、外部デュワーをステージに接続します。
液体窒素の送達後、クライオステージのリリースボタンを押してサンプルチャンバーに入り、システムが冷却して安定するまで30~45分待ってから画像取得を開始します。カセットツールの16進数キーを使用して、サンプル転写カセットの2枚のプレートを開きます。プレートを 2 つのプレートの間にグリッドをドロップするのに十分な幅を開きますが、最大位置には開かないでください。
長い鉗子を使用して、サンプルグリッドボックスを液体窒素から持ち上げます。ノッチがステージ内の保管位置に合うように回し、ステージに配置します。適切なデバイスを使用して、適切なサンプル位置まで保管ボックスの蓋を開きます。
逆鉗子を使用して、サンプルホルダーからTEMグリッドを取り出し、液体窒素の中に浸し、最終的にサンプルブリッジの目的に向き合い、サンプル移送カセットの位置に落とすようにカーボンフィルム側が配置されるようにします。カセットツールの 16 進キーを使用してサンプルカートリッジを閉じます。カセットツールのマグネットポイントを使用して、グリッドを含むカートリッジを持ち上げてサンプルブリッジに取り付けます。
液体窒素に浸すか、または適切な向きに浸してください。カセットをブリッジの位置ピンの内側に平らにして、静かに動かして固定されていることを確認します。残りのサンプルと一緒に保管ボックスを閉じて取り外します。
クライオステージの蓋開口部をイメージング位置に移動し、サンプルチャンバーライトをオフにします。光学系に向かってステージをスライドさせて対物レンズの下に合わせ、レバーを使用して目的をそっと位置に落とし、クライオステージの蓋内に収まるが触れないようにします。不透明な黒いカーテンでステージと光学を覆い、クライオSIM PC上でコントロールソフトウェアコックピットを起動します。各カメラの読み出しモードボタンをクリックし、CONV3メガヘルツに設定します。
各カメラの温度が80°Cであり、カメラファンがオフになっているか確認します。反射したカメラをオンにし、光の下でアンビエントとアンダーリンカムを選択し、コンデンサーをチェックしてからビデオモードボタンをクリックします。[モザイク ビュー] ウィンドウで、グリッドのアウトラインを表示するために縮小表示します。
見ることができない場合は[ステージを見る]をクリックし、円の中央をダブルクリックしてグリッドを中央に配置します。グリッドサポートフィルムまたはその他の関連する機能がフォーカスされるまで、上下キーを使用してサンプルをフォーカスします。Z ステップを変更するには、数値パッドの 9 キーと 3 つのキーを使用します。
ステージが中央揃えになったら、ビデオモードをオフにします。モザイクビューの「実行モザイク」をクリックして可視光モザイクを収集し、中心から外側に向かって渦巻く可視光画像のタイルを生成します。[モザイクを保存]をクリックしてビューを保存します。
周囲光とコンデンサー、ビデオモードをオフにして、以前の蛍光マップ画像と一緒に明るいフィールドモザイクを検査し、必要な励起レーザーをオンにして、対応するカメラとフィルタを選択します。イメージをスナップし、自動コントラストに星を合わせるには、ゼロを押します。または、画像の下部にあるスライダーを使用して、コントラストを手動で調整します。
適切な蛍光を有する生物学的に興味深い細胞が見つかったら、モザイクビューのマークサイトボタンを使用して、その位置をマークします。画像取得を開始する前に、すべての候補サイトのマーキングを続行します。[サイトをファイルに保存] をクリックして、マークされたサイトでモザイクを再保存します。
stitchEm ソフトウェアを使用してモザイク画像をステッチするには、テキストモザイクファイルを、BAT という拡張子を持つ stitchEm ファイルにドラッグアンドドロップし、モザイクタイルの組み合わせ TIF 画像を同じフォルダーに保存します。マークされたサイトと一緒に画像を保存するには、モザイクテキストファイルとマーカーテキストファイルを同時にアイコンにドラッグアンドドロップします。カメラビューウィンドウの下部にある蛍光画像の数とダイナミックレンジに基づいて、レーザー露光時間を設定します。
使用する励起光の各波長の設定を適用し、最適化するフィルターを選択し、各レーザーを個別にオンにします。両方のカメラをクリックしてオンにします。マークされたサイトのいずれかに戻り、再び目的の深さに焦点を当てます。
対象領域にフォーカスが置いたら、マクロステージの XY ウィンドウの上矢印キーを使用してフォーカスを外し、取得する Z スタックの高さを選択し、[上に保存] をクリックします。下矢印キーを使用してフォーカスから移動し、[保存] をクリックし、[中央に移動] で、イメージがフォーカスされていることを確認します。[コックピット] ウィンドウで、[単一サイト実験] を選択します。
ドロップダウン リストから[構造化照明]を選択します。Z 高さと 1 マイクロメートルに等しくなるように、スタックの高さを変更します。反射カメラの上列の405および488ナノメートルレーザーの露光時間をミリ秒単位で入力し、送信カメラの下段に561および647ナノメートルのレーザーの露光時間を入力します。
ファイル名を入力し、更新をクリックして、以前のファイルを上書きせずに日時を含む新しいファイルを生成し、[Start]をクリックします。液体窒素デュワーが画像取得中にクライオステージを補充する場合は、コックピットソフトウェアのABORTボタンをクリックしてプロセスを中止します。各位置で、可視光を使用してZスタックを収集し、レーザーのスイッチを切り、周囲光とコンデンサーをオンにします。
[単一サイト実験] で[Z スタック]を選択し、周囲光を 20 ミリ秒の露出に設定し、Z 高さを維持します。マークされたすべてのサイトに対してこの手順を繰り返します。イメージングが終了したら、ステージをアンドッキングし、すべてのサンプルを削除します。
サンプルチャンバーライトをオフにします。外部のデュワーを抜き、残りの液体窒素を別のcryo互換容器にデカン化し、デュワーが安全に正常な温度に戻ることができるようにします。ステージデュワーに液体窒素が残っていない後、クライオステージディスプレイを焼くオプションが利用可能になるまで待ちます。
ベイクアウトボタンを押して、加熱モードに入ります。蓋プラグをクライオステージに置きます。cryoSIMの分解能は、標準的な蛍光顕微鏡の解像度よりも有意に高い。
従来の蛍光顕微鏡から蛍光マップを使用して、画像撮影の対象領域を見つけることができ、対応するcryoSIM画像は、グリッド上の位置から得ることができます。U2OS細胞を含む試料を、緑色の微小管細胞骨格色素と赤ミトコンドリア色素の混合物で染色し、細胞骨格とミトコンドリアの微小管成分を染色した。その後のイメージングは、細胞内のミトコンドリアの局在化と微小管の配置を示し、細胞およびオルガネラ周囲の細胞骨格の組み立てに提供する構造的枠組みを強調した。
SIM再構築プロセスは、SIMCheck、無料のimageJプラグインを使用して識別することができるアーティファクトを生成することができます。この変調コントラストマップは、SIMCheckを用いて生成された、核領域内の低変調コントラストの領域を示し、この領域が再構築アーティファクトの影響を受けやすいことを示している。白い矢印は、再構築アーティファクトを示します。
このプロトコルを試みるとき、サンプルが水没するか、または液体窒素に常に近いままであることを確認して、脱ガラス化を避けてください。また、データの品質に影響を与え、サンプルへのレーザー損傷を回避するため、ダイナミックレンジでの露出時間とカウントにも注意してください。クライオイメージングの後、同じサンプルを、B24ビームラインで行っているクライオソフトX線断層撮影などの他のモダリティと共に画像化することができます。
細胞の構造情報を含む画像とcryoSIM画像を組み合わせることで、細胞の超構造と機能に関する重要な追加の質問に答えることができます。
