IBCS-BIPの魚類施設とスクリーニングセンターのサポートスタッフの優れた技術支援に感謝します。この研究は、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムから、助成金契約第965406号(PrecisionTox)に基づく資金提供を受けています。この出力は著者の見解のみを反映しており、欧州連合はそこに含まれる情報の使用について責任を負うことはできません。

すべてのゼブラフィッシュの飼育と取り扱いは、ドイツの動物保護基準に準拠して行われ、ドイツのバーデン・ヴュルテンベルク州政府、Regierungspräsidium Karlsruhe(Aktenzeichen 35-9185.64/BH KIT)によって承認されました。
1. 試験する薬品の原液の調製
<ol><li>ガラスバイアル(または化学アリコート)に、化合物名/略語、在庫濃度、および調製日をラベル付けします。例えば、CdCl2_2.5 g·L-1_210813です。</li>
	<li>化学アリコートを2000 x g で室温(RT)で1分間遠心分離します。</li>
	<li>ドラフトの下で、0.001 gに敏感なスケールで化合物を(必要に応じて)秤量し、ラベル付きバイアルに移します。.コンパウンドが液体の場合は、ピペットとプラスチック製のピペットチップを使用してバイアルに加えます。 注: 例えば、図 2 に示す結果例で使用したトリケインメタンスルホン酸ストックについて、400 mg を標識バイアルに秤量しました。</li>
	<li>溶媒(化合物の物理化学的特性に応じて滅菌純水やジメチルスルホキシド(DMSO)など)を、ピペットとプラスチック製のピペットチップを使用して添加します。可能であれば、水が好ましい溶媒です。 注:例えば、トリケインストックの場合、100 mL の水に 15.3 mM 溶液を調製しました。</li>
	<li>バイアルを密封し、静かに振とうし、沈殿物を確認します。</li>
	<li>希薄なストック溶液(必要な場合)をガラスバイアルにピペットとプラスチック製のピペットチップを使用して調製します。 注:例えば、トリケインストックについては、それ以上の希釈は必要ありませんでした。</li>
	<li>原液は、使用するまで-20°Cで保存してください。</li>
	<li>残りの化学アリコートは、以前と同じ条件で保管してください。</li>
	<li>ラボノートに在庫分注情報を記録します。</li>
</ol>2. ゼブラフィッシュ胚の採取と飼育
<ol><li>10cmの組織培養皿でのグループ交配の自然産卵から、切断段階(2〜8細胞段階)の胚を収集します。</li>
	<li>適切な品質のバッチを選択してください:10%未満の未受精卵/死んだ卵。</li>
	<li>皿をきれいにします(未受精卵、破片、鱗屑などを取り除きます)。</li>
	<li>10 cmの組織培養皿あたり60個の胚を15 mLのE3培地(5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、0.33 mM MgSO4)25に入れます。</li>
	<li>水に浸したペーパータオルを敷いて用意した加湿チャンバーに食器を入れます。</li>
	<li>28.5°Cのインキュベーターで72hpfまで胚を育てます。</li>
</ol>3.試験する化学物質の作業希釈液の準備
<ol><li>原液を-20°Cの冷凍庫から取り出し、解凍します。</li>
	<li>化合物の溶解度が十分に高い場合は、ガラス瓶の E3 培地で段階希釈液を調製し、1 濃度あたり 1 回あたり 1 mL を調製します。濃度が所望の曝露濃度の10倍であることを確認してください。これにより、曝露開始時に胚の培地全体を変更する必要がなくなります。溶解度が低い場合は、所望の曝露濃度(1 回あたり 10 mL、濃度あたり 10 mL)で段階希釈液を直接調製します。</li>
	<li>降水量を確認します(必要な場合)。溶液が沈殿している場合は、これを記録し、さらに希釈して次に高い濃度にします。降水量をもう一度確認してください。降水量がなくなるまで繰り返します。</li>
	<li>曝露溶液のpHを確認してください。pH 7.0-8.5の範囲外の場合は、これを記録し、5 mM HEPES / pH 7.4を含むE3で溶液を調製し、HClまたはNaOHでpHを調整します。</li>
	<li>未使用の露光メディアは、地域の規制に従って廃棄してください。</li>
</ol>4.試験する化学物質に胚を曝露する
<ol><li>72 hpfの古い胚で皿に死んだ/孵化していない胚がないか確認し、それらを取り除きます。胚のバッチに孵化していない卵が5%以上含まれている場合は、バッチを削除します。</li>
	<li>6cmの組織培養皿あたり10個の胚を9 mLのE3培地(エクスポージャープレート)に入れます。</li>
	<li>曝露プレートに化合物名、曝露濃度、および繰り返し数をラベル付けします。例えば、「CdCl2 1mg·L-1 01」です。必要に応じて、十分な E3 専用プレートと溶媒コントロールプレートを含めます(セクション 5 を参照)。</li>
	<li>各プレートに1 mLの曝露溶液を最低濃度から加え、プレートを旋回させます。溶解度の低い化合物の場合は、プレートの 10 mL 全体を曝露溶液と交換します(ステップ 3.2 を参照)。</li>
	<li>化合物溶液が胚に添加された時間的順序を記録します。</li>
	<li>プレートを加湿チャンバー内のインキュベーターで28.5°C、48時間、120hpfに達するまでインキュベートします。</li>
</ol>5. 振動驚愕アッセイの実施
注:ステップ4.5で記録したのと同じ順序でプレートを分析します。各実行には、E3コントロールプレートを含める必要があります。
<ol><li>コンピュータとバイブレーションデバイスの電源を入れます(青色のLEDライトが点灯しているはずです)。</li>
	<li>図 1D に示すように、スプレッドシートで構成ファイルを準備し、補足ファイル 1 として添付します。5 つのプレート位置(化合物、濃度、繰り返し)のそれぞれの曝露情報を記録します。</li>
	<li>一般的なユーザー インターフェイス (GUI) プログラム (https://git.scc.kit.edu/xk4962/vibration-startle-assay-kit 、プロジェクト ID 43215 で入手可能) を開きます。</li>
	<li>GUIプログラムでさまざまな位置を選択し、カメラの動きを観察して、カメラの動きを確認します。</li>
	<li>測定するサンプルプレートをインキュベーターから取り出します。サンプルプレートを5つの位置に置き( 図1A「スピーカー」を参照)、胚を数分間落ち着かせます。</li>
	<li>[記録]をクリックします。構成ファイルを選択するためのウィンドウが開きます。</li>
	<li>この実行のために手順 5.2 で準備した適切な構成ファイルを選択します。</li>
	<li>サンプルの説明が各位置(1-5)のサンプルに対応していることを確認します。</li>
	<li>測定は自動で行われます(10秒/位置)。プログラムによって音波パルスが印加されると、LEDが点灯します。10秒/位置の記録により、刺激を加える前と後の両方で遊泳速度と移動距離を推定するのに十分なデータを取得でき、その後の刺激に慣れるのを防ぐことができます。</li>
	<li>録画が完了すると、カメラは位置1に戻り、ソフトウェアはファイルの圧縮を開始します。この間に、サンプルを測定が必要な次のセットと交換します。</li>
	<li>手順 5.2 に進みます。をクリックして、次の実行を記録します。</li>
	<li>すべてのプレートを測定したら、曝露溶液を回収します。ふるいを使用して胚を保持します。</li>
	<li>氷/イソプロパノール(5%)浴で急冷して胚を安楽死させます。</li>
	<li>曝露溶液と死んだ胚は、地域の規制に従って廃棄してください。</li>
</ol>6. データ解析
<ol><li>VirtualDub(1.10.4)で動画データを開きます。</li>
	<li>音波パルスに反応する胚の数を視覚的にスコアリングします(制御LEDが点灯している場合)。</li>
	<li>スプレッドシートにデータを入力します。化合物名、複製数、化合物の濃度、および不動性胚の割合を、図 2C に示すサンプルデータセットを含む補足ファイル 2 に記載されているテンプレートに従って記録します。 注:テンプレートは柔軟な構造を持ち、主に他の生物やエンドポイントのデータに適用できます。各濃度の応答を記述し、エンドポイントの説明と、その後の濃度-応答モデリングで生成されるパラメータの定義も提供します。</li>
	<li>埋め込まれた R スクリプト (R バージョン 3.6、R パッケージ plotrix、drc、bmd27、28) を備えた KNIME ワークフロー (KNIME analytics 4.626) を使用して、ベンチマーク濃度 (BMC) 分析を実行します。 注: 原則として、評価は R で直接実施することもできます。ただし、便宜上、また Web ベースのサービスとして評価できるように、分析は KNIME サーバー準拠のワークフローで編成されています。KNIME ワークフローの出力は、 補足ファイル 3 で提供されます。KNIME ワークフローによって生成される統計パラメータの詳細については、このテンプレートを参照してください。適合度を推定するための統計的パラメータと、決定されたBMC値を受け入れるための閾値を 表1に示す。KNIME ワークフロー自体は、GitHub (https://github.com/precisiontox/range-finding-drc) から入手できます。濃度-応答は、4 パラメーターの対数ロジスティック モデルを使用してモデル化されます。カーブフィットのパラメータのうち2つは固定できます。通常、パーセンテージ データの場合、最大値を 100 に固定します。背景効果が観察されない場合は、最小値を0%に固定できます。</li>
</ol>

ゼブラフィッシュ胚の毒性評価のための驚愕アッセイ

開示するものは何もありません。

特注のゼブラフィッシュ胚振動驚愕アッセイセットアップを使用した化合物評価のワークフローとデータ解析を紹介します。このワークフローでは、ベンチマーク濃度/用量(BMC/BMD)など、化合物の毒性を指定する一般的なパラメーターを計算できる堅牢なデータが生成されます。セットアップのモジュール性により、スループットとスペース要件のさまざまなニーズに適応できます。このシステムは、比較的簡単なセットアップで低コストの基礎コンポーネントから作られているため、一般的に一度に複数のアッセイタイプ用に設計され、プロプライエタリなソフトウェアに依存し、比較的コストがかかる既存の商用システムに代わる安価な代替手段を提供します。
これらの商用システムと他のカスタムメイドシステムの両方で、マルチウェルプレート(例えば、12ウェル34、16ウェル32、35、24ウェル20、33、36、48ウェル37、96ウェル38、39、40、41、42、さらには384ウェル[4x96ウェルとして]43)で単一の胚または幼虫を評価することができます。)ですが、井戸の空間的制限により、脱出応答の一部のデータパラメータ(移動距離など)の分析がより困難になります。さらに、これらのセットアップのいくつかでは、イメージングはプレートのウェルのサブセットに制限され、スループットを低下させる36、39。ディッシュ内の胚をイメージングすることで、脱出応答パラメータをより適切に評価でき、一度に複数の胚の行動を記録できます(たとえば、6cmのディッシュで最大30個)。通常、ディッシュベースのイメージングは、ランごとに1つのディッシュに制限されます44、45、46、47、48(例外は、それぞれ1匹の幼虫を持つ6つのディッシュで並行してイメージングを実行する49、または2つの分割ディッシュ50で4匹の幼虫でイメージングを実行します)、私たちの場合のような並列設計によって解決できる欠点です。この研究で使用されたシステムおよびその他の商用およびカスタムメイドのソリューションのいくつかの特徴を表2にまとめました:20、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、 51,52。
この方法の利点の1つは、致死率と行動の変化の両方を捉えた読み出しであり、毒性評価のパフォーマンスを向上させることができます。例えば、ゼブラフィッシュ胚急性毒性試験(FET)5 は、成魚急性毒性試験53 において毒性をかなりよく予測することが示されているが、その予測精度は、行動測定値54を含めることによって改善された。その理由は、魚類の胚に見られる神経活性化合物による死亡率の低下であり、おそらく稚魚または成魚の毒性を高める呼吸不全症候群の欠如によるものです。しかし、神経活動は行動の評価によって特定することができます。さらに、行動の読み出しは、筋毒性および耳毒性の影響、および生理機能に対する他のより微妙な毒性効果も捕捉できます。
アッセイを実施する際には、化合物を適切に取り扱うことと、ゼブラフィッシュの胚を均一に発育させることが非常に重要です。したがって、化合物の保管にガラスバイアルを使用すると、プラスチック材料への吸光度による化学物質、特に疎水性化合物の濃度の低下を最小限に抑えることができます。「プラスチック」ポリスチレンへの吸収性が高い化合物の場合、ガラス板もインキュベーションに使用できます。死んだ胚の採取と除去に使用される組織培養皿内の卵子の洗浄は、標準開発を確実にするための重要なステップです。発達の遅れは、評価された行動の根底にあるニューラルネットワークの成熟度に影響を与える可能性があるため、通常の発達速度が重要である14,33。また、複合効果の比較を可能にするために、異なる菌株は異なる行動プロファイルを示すことが報告されているため、卵は同じ菌株に由来する必要があります38,55,56,57。曝露中は、試験した濃度を変化させるE3培地の過度の蒸発を避けるために、加湿チャンバー内で胚をインキュベートすることが重要です。
E3コントロールは、テストシリーズで使用される胚の特定のバッチのベースライン応答レベルを決定するために、各実行に組み込む必要があります。通常、5 つの測定の各セットに沿って 1 つのプレートのコントロールを実行します。図2Dに示すように、このアプローチでは、発生の遅延や遺伝的背景効果などの他の理由により、最適でない応答を示すバッチを検出することもできます。刺激に対する予期せぬ反応の欠如の場合、トランスデューサの故障の可能性にも注意してください。通常、驚愕応答は、対数ロジスティック モデルを使用した曲線近似を可能にするシグモイド集中応答動作を示します。ただし、二相性応答を伴うまれなケースでは、ガウスモデルやセダーグリーンモデルなど、他のモデルを採用する必要があります。これらは、R パッケージ drc および bdm27,28 内で使用できます。
振動刺激に対する応答の欠如は、単に胚の死亡または一般的な細胞毒性による重度の生命機能障害を示している可能性がありますが、刺激の知覚、統合、および自発運動出力の神経回路を標的とするより特異的な毒性を反映している可能性もあります。他の考えられる複合効果は、神経筋界面または筋肉の構造と機能への干渉です。これらの可能性を区別するには、さらなるアッセイが必要です。例えば、筋肉の構造的完全性は、複屈折アッセイ58,59で評価することができ、トランスジェニック系統は、筋肉および神経機能の摂動を評価するために利用可能である60,61。しかし、記録されたビデオデータは、胚の形態および行動応答のより詳細な分析をすでに可能にしており、最初の追加情報を提供することができる。Cベンドだけが損なわれているのか、それともすべての運動性が損なわれているのか?尾の動きが弱くなったり震えたりすることで示されるように、神経筋活動の名残がまだ存在していますか?このような行動の変化は、浮腫や体の湾曲の増加などの形態の変化に伴って起こるのでしょうか?さらに、Cベンドまでの待ち時間やエスケープ応答中の移動距離などのパラメータを評価できます(例えば、文献44を参照)。
ここで説明するスクリーニングプロトコルは、非致死性の神経毒性、耳毒性、および筋毒性化合物を特異的に検出するという付加価値を備えた、迅速かつ堅牢な化合物毒性評価を可能にします。提供される分析ワークフローは実装が簡単で、堅牢な読み出しを提供します。振動驚愕アッセイで使用された刺激プロトコルの修正は、プリパルス阻害(PPI)39,44や馴化32,33など、驚愕行動のより複雑な側面に対する複合効果に対処するためにも使用されており、この研究で使用された電気力学的トランスデューサベースの刺激設定に適応できる可能性があります。
驚愕反応に基づくスクリーニングシステムの主な用途は、化学的スクリーニングにおける化合物効果の評価であり、これはヒト毒性評価と医薬品開発の両方に関連しています1,4,62。同時に、水生生物の初期のライフステージをテストすることにより、得られた結果は生態毒性学的リスク評価に直接関連しています63,64。さらに、驚愕反応系は、遺伝子スクリーニング65、66、67、68、69における行動表現型に用いることができる。当社の簡単に実装可能で適応性の高いシステムは、これらのさまざまなアプリケーション領域で独自のスクリーニングプロジェクトを実施することを意図している小規模なラボに手頃な価格のセットアップを提供します。

近年、ゼブラフィッシュは化合物効果評価のモデル生物として非常に人気が高く、創薬から環境毒性学まで幅広い研究分野を網羅しています1。脊椎動物であるゼブラフィッシュは、その遺伝的構成と全体的な生理機能の多くの側面を人間と共有しています2,3。したがって、このモデルで得られた結果は、多くの場合、人間の健康に直接関連しています。現在臨床試験中のいくつかの薬剤候補は、ゼブラフィッシュ4を用いた化合物スクリーニングで同定されています。
毒性評価は、ゼブラフィッシュの胚期を用いた試験が注目される主要なアプリケーションの1つです。経済協力開発機構(OECD)には、ゼブラフィッシュを環境毒性試験に使用するためのさまざまな試験ガイドラインが存在します5,6。ゼブラフィッシュの胚はサイズが小さく、発育が速いため、中程度からハイスループットスケールでのスクリーニングアプローチに非常に適しています1,3,4。このようなスクリーニングの対象となる毒性学的評価項目には、胎児の奇形と致死性7、内分泌かく乱8、臓器毒性9、および神経毒性を示す行動評価が含まれます10,11。ゼブラフィッシュの胚は、発生段階に応じて異なる刺激に対して様々なタイプの自発運動反応を示すため、行動アッセイが可能です。例えば、受精後1日(dpf)の胚は、自発的な尾部コイル12を示し、典型的な一連の動き、いわゆる光運動反応(PMR)10を伴う一連の光パルスに応答する。孵化後、典型的には受精後48〜72時間(hpf)前後に発生し、自由に泳ぐエゾウコギ胚13は、4dpf頃から振動刺激に対する驚愕および逃避反応を徐々に発達させる14。これらの応答は、刺激の方向と反対の方向への特徴的な曲がり(いわゆるCベンドまたはCスタート)を特徴とし、その後、より小さなカウンターベンドと水泳行動が続きます14、15、16、17。特に、胎児の行動は、さまざまな神経伝達物質系を使用する神経回路によって制御されており、これらの系を標的とする化合物効果を調べることができます。例えば、PMRアッセイでは、コリン作動性、アドレナリン作動性、およびドーパミン作動性シグナル伝達を妨害する化合物の影響が明らかになり10、驚愕応答にはコリン作動性、グルタミン酸作動性、およびグリシン作動性ニューロンが関与する16,18。さらに、筋肉や神経と筋肉の界面を損傷する化合物も、内耳/側線有毛細胞に有毒な化合物と同様に、これらの行動に影響を与えます19,20。したがって、刺激に反応したゼブラフィッシュの自発運動行動を観察することは、神経毒性だけでなく、耳毒性や筋毒性も同様に評価するための適切な手段です。自発運動行動のスコアリングは、死んだ胚が動かないため、一般的な毒性/致死性評価の代理としても機能します。これにより、胚の移動行動は、1つのセットアップで致死的および神経筋化合物の影響を示す第1層毒性スクリーニングアプローチの統合的な読み出しを表しています。エゾウコギ胚がすでに化合物を代謝する能力を持っていることを考えると、このアプローチは代謝変換生成物の影響も検出できるかもしれない7,21,22。重要なことに、ゼブラフィッシュの胚は、120 hpf13 以降の自由給餌の段階まで、一部の動物保護法の下で保護されたライフステージとは見なされません。そのため、動物毒性試験の代替として考えられています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig01.jpg"> 図1:振動驚愕応答システムのセットアップ。 (A)システムの概要。試験化合物に曝露された胚を含むプレートは、電気力学的トランスデューサーアレイ(「ラウドスピーカー」)に配置されます。カメラは、ベルト駆動のリニアドライブによって、ターゲットのトランスデューサの上の記録位置に順次移動します。(B)組織培養皿を上部に挿入したトランスデューサー/ラウドスピーカーの詳細図。プレートは、4000〜5000ルクスのLEDライトシートで下から照らされます。刺激が与えられている間、スピーカーの横のLEDライトが点灯します。(C)胚を刺激した際にカメラで撮影した動画の静止画。(D) 設定ファイルのスクリーンショット。(E)録音ソフトウェアのインターフェースのスクリーンショット。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
ここでは、組織培養皿23内の自由に動くいくつかの胚の自動ビデオ記録と組み合わせた電気力学的トランスデューサによって生成された振動刺激に基づく社内製の簡易試験装置を使用して、振動驚愕応答に対する複合効果を評価するための試験プロトコルについて説明する。このシステムはモジュール式で、複数の組織培養皿から並行して連続して記録することができます。現在使用されている装置では、5つの電気力学的トランスデューサが振動刺激(500Hz、持続時間1ms)を、その上に20個の胚が置かれた組織培養皿に供給します(図1)。プレートは、LEDライトシートで4000〜5000ルクスで下から照らされます。各トランスデューサの横のLEDライトは刺激の印加周期を示し、オシロスコープは印加された刺激の波形と周波数を示します(詳細は 文献23を参照)。胚の挙動は、高速カメラ(資料表)によって毎秒1000フレーム(fps)で記録され、ベルト駆動のリニアドライブによってターゲットスピーカーの上方に移動します。この記録速度は、驚愕応答を確実に解決するために必要です。このシステムは、現在の商用システムに代わる低コストで個別に適応可能な代替手段を提供します。以下に詳述する正確なワークフローは、現在、選択された毒物で処理されたゼブラフィッシュ胚からのOMICSデータ取得に適した曝露条件を決定するために、精密毒物学イニシアチブ24 の枠組みで実施されています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 &#956;m</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z289744-1EA</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed camera</td>
			<td>XIMEA</td>
			<td>&#160;MQ013MG-ON USB 3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap</td>
			<td>VWR</td>
			<td>215-3261</td>
			<td>Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 10 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3010.210</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 1000 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3050.100</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 20 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3020.210</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tip, working volume: 200 &#181;L</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>70.3030.100</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 10 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1254.001</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 25 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette 5 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1253.001</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>628102</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene)</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.3902.500</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette 6 mL</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>86.1175</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.5472.54</td>
			<td>Or comparable material</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system

ゼブラフィッシュ胚の神経筋毒性および一般毒性を評価するための簡便なスクリーニングシステムを開発しました。モジュラーシステムは、胚の入った組織培養皿をその上に置くことができる電気力学的トランスデューサで構成されています。このようなラウドスピーカ−組織培養皿のペアを複数組み合わせることができる。電気力学的トランスデューサーによって生成された振動刺激は、胚に特徴的な驚愕と脱出応答を誘発します。ベルト駆動のリニアドライブは、各スピーカーの上にカメラを順番に配置して、胚の動きを記録します。このようにして、化合物の致死性や神経筋毒性による驚愕反応の変化を可視化し、定量化することができます。本システムを用いた化合物スクリーニングのワークフローの一例として、胚や処理液の調製、記録システムの操作、アッセイに活性のある化合物のベンチマーク濃度値を算出するためのデータ解析などを紹介します。市販のシンプルなコンポーネントをベースにしたモジュラーアセンブリにより、このシステムは経済的で、特定のラボのセットアップやスクリーニング目的のニーズに柔軟に適応できます。

In recent years, zebrafish have become highly popular model organisms for the evaluation of chemical compound effects, encompassing research areas from drug development to environmental toxicology1. As vertebrates, zebrafish share many aspects of their genetic makeup and overall physiology with humans2,3. Therefore, results obtained in this model often are directly relevant to human health. Several drug candidates currently in clinical trials have been identified in compound screens using zebrafish4.
Toxicity assessment is one major application where tests using zebrafish embryonic stages are of interest. Various Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guidelines exist for the use of zebrafish in environmental toxicity testing5,6. The small size and rapid development of zebrafish embryos make them highly suitable for screening approaches on a medium to high throughput scale1,3,4. Toxicological endpoints targeted by such screens include embryonic malformations and lethality7, endocrine disruption8, organ toxicity9, and behavioral assessments indicative of neural toxicity10,11. The behavioral assays are possible because zebrafish embryos show various types of locomotor responses to different stimuli depending on their stage of development. For example, 1 day post fertilization (dpf) embryos show spontaneous tail coiling12 and respond to a sequence of light pulses with a typical sequence of movements, the so-called photomotor response (PMR)10. After hatching, typically occurring around 48-72 hours post fertilization (hpf), the freely swimming eleutheroembryos13 gradually develop startle and escape responses to vibrational stimuli starting around 4 dpf14. These responses are characterized by a distinctive bend to the direction opposite the direction of the stimulus (the so-called C-bend or C-start), which is followed by a smaller counter bend and swimming behavior14,15,16,17. Notably, embryonic behaviors are governed by neural circuits using various neurotransmitter systems, allowing for probing chemical compound effects targeting these systems. For example, the PMR assay revealed the effects of compounds interfering with cholinergic, adrenergic, and dopaminergic signaling10, while the startle response involves cholinergic, glutamatergic, and glycinergic neurons16,18. Furthermore, compounds that damage the muscles or the neuro-muscular interface will also affect these behaviors, as will compounds toxic to the inner ear/lateral line hair cells19,20. Observing zebrafish locomotor behavior in response to a stimulus is thus a suitable means to assess not only neurotoxicity but equally ototoxicity and myotoxicity. Scoring locomotor behavior also serves as a proxy for general toxicity/lethality assessment since dead embryos do not move. Thereby, embryonic locomotion behaviors represent an integrative readout for a first-tier toxicity screening approach, which indicates lethal and neuromuscular compound effects in one setup. Given that the eleutheroembryos are already capable of metabolizing compounds, the approach may also detect the effects of metabolic transformation products7,21,22. Importantly, zebrafish embryos are not considered as protected life stage under some animal protection legislations until the stage of free feeding after 120 hpf13. Therefore, they are regarded as an alternative to animal toxicity testing.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig01.jpg" /> 
Figure 1: Vibration startle response system setup. (A) Overview of the system. Plates with embryos exposed to the test compounds are placed on the electrodynamic transducer array (&#34;loudspeakers&#34;). The camera is sequentially moved by the belt-driven linear drive into the recording position above the targeted transducer. (B) Detailed view of the transducer/loudspeaker with tissue culture dish inserted on top. The plates are illuminated from below by an LED light sheet at 4000-5000 lux. An LED light next to the speaker lights up while the stimulus is given. (C) Still image of video recorded by the camera upon stimulation of the embryos. (D) Screenshot of the configuration file. (E) Screenshot of the recording software interface. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Here, we describe a testing protocol for the evaluation of compound effects on the vibration startle response using an in-house build simple testing device based on vibration stimuli generated by electrodynamic transducers coupled with an automated video recording of several freely moving embryos in a tissue culture dish23. The system is modular and allows for sequential recording from several tissue culture dishes in parallel. In the setup currently used, five electrodynamic transducers provide a vibrational stimulus (500 Hz, duration 1 ms) to tissue culture dishes containing 20 embryos placed on top of them (Figure 1). The plates are illuminated from below at 4000-5000 lux with LED light sheets. An LED light next to each transducer indicates periods of stimulus application, and an oscilloscope indicates waveforms and frequency of the applied stimulus (for details, see Ref. 23). The behavior of the embryos is recorded by a high-speed camera (Table of Materials) at 1000 frames per second (fps), which is moved above the targeted speaker by a belt-driven linear drive. This recording speed is required to reliably resolve the startle response. The system provides a low-cost, individually adaptable alternative to current commercial systems. The precise workflow detailed below is currently performed in the framework of the Precision Toxicology initiative24 in order to determine suitable exposure conditions for OMICS data acquisition from zebrafish embryos treated with a selected set of toxicants.

著者スポットライト:ゼブラフィッシュ胚驚愕反応アッセイを用いたハイスループット毒性スクリーニング

ゼブラフィッシュ振動驚愕応答スクリーニングシステムを用いた化学物質の毒性評価

When screening chemicals for toxicity, a current experimental challenge is the determination of toxic effects in vivo, taking into account the complexity of a whole organism, and to do this in a rapid high-throughput manner. By using a behavioral readout that monitors the escape response of zebrafish embryos to a vibration stimulus, our system allows us to identify compounds that interfere with neural or muscular function. Because dead embryos don't move, we also capture compounds that cause lethality by unspecific toxicity.The system we present can be built for a modest price and is customizable. It is also easy to maintain and all pieces can be replaced. We are currently employing the startle assay system within the PrecisionTox Consortium to determine a chemical compound dose for OMICS data acquisition.The data are generated across five model organisms and human cell lines. They will be used to derive toxicity pathways and biomarkers for human toxicity prediction.

図2A は、未処理の野生型胚(AB2O2株)の48クラッチにおける不動胚の割合を示しています。平均して、未処理の野生型胚の14.33%は振動刺激に反応しません。4クラッチでは、不動幼虫の割合は50%に達しましたが、クラッチの75%は不動幼虫の割合が20%未満でした。
図 2B、C は、現在 PrecisionTox コンソーシアム24 内で実施されている、振動驚愕アッセイワークフローによる運動性に対する化合物の影響に関するベンチマーク濃度/用量(BMC/BMD29,30)の典型的な計算の例を示しています。BMC10、BMC25、およびBMC50の値は、胚の10%、25%、および50%がそれぞれバックグラウンドよりも高い運動性レベルを示す濃度に対応します。この計算には、完全に不動の胚のみが含まれ、その後の脱出遊泳のないCベンドのみ、または尾の動きのみなど、部分的な応答を示す胚は含まれません(図2B)。胚は、魚の麻酔に頻繁に使用される8濃度のナトリウムチャネル阻害剤トリケインメタンスルホン酸に曝露された31。データは、振動刺激に応答して約25%の運動性がバックグラウンドレベルであることを示しています。1%トリカインから始まり、運動性は低下し、2.5%を超えると停止します。.KNIME ワークフローでは、BMC50 を 164.9 μM と計算し、これは 1.07% のトリカインと 75% の運動レベルに相当します(図 2C)。95%信頼区間が小さい(曲線の灰色の陰影で示されている)ことは、このアッセイにおける運動性値の頑健な再現性を示しています。
図2Dは、BMC計算にデータを使用すべきではない、最適ではないアッセイランの例を示しています。同じクラッチに由来する異なる胚を持つ5つのE3処理対照群が示されています(AB2O2 [野生型株]は1〜5を複製します)。図2Aに示すように、最初のグループのみがほぼ正常な反応を示し、文献値32および本稿で記載のアッセイで得られたものと一致する約25%の運動性を示すが、他のすべてのグループは、減少および/または不完全な行動反応を示す(例えば、水泳活動が続いていないCベンドのみを示す、または最初に明確なCベンドのない運動性を示す)。このような反応は、胚が適切に発達せず、発達の遅れのために未熟な状態にある場合に起こる可能性があり、これは驚愕反応の頑健性に影響を与える14,33。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66153/66153fig02v2.jpg"> 図2:ベンチマーク線量計算を含む典型的な結果の例。 (A)48クラッチの野生型未処理幼虫の音波パルス後の非応答性胚の割合(クラッチあたりn = 10)。平均値(14.33%)と標準偏差(±16.19%)は赤で示されています。(B) E3 培地中の示された濃度のトリカインまたはコントロールとして E3 のみで処理された胚 (条件ごとに n=20) の驚愕反応行動の評価。行動は、グラフの右側に示されている配色と漫画に従って分類され、各胚は次のクラスの1つだけに割り当てられます。 「不動」:胚は動きを見せません。「尾が動く」:胚は尾の動きを示すが、C曲げも遊泳行動も示さない。「運動性」:胚は遊泳運動を示すが、振動刺激に反応してC-ベンドを示さない。「Cベンドのみ」:胚はCベンドを示しますが、泳ぎを逃れることはありません。「Cベンド+運動」:胚は典型的なCベンド行動を示し、その後脱出遊泳(典型的な完全な驚愕反応)を示します。異なる行動は、各治療の胚の総数に対する割合として表示されます。(C)KNIMEワークフローによって生成されたBMC計算グラフで、各処理濃度に対する「不動」胚の割合を示します。青、赤、黒の線は、BMC10、BMC25、およびBMC50の値、つまり、胚の10%、25%、および50%がそれぞれバックグラウンドよりも高い運動性レベルを示す濃度を示します。(D)廃棄されたアッセイランの例。同じクラッチに由来する異なるAB2O2野生型胚を用いた5つのE3処理対照が示されています(複製1〜5)。反復1のみがほぼ正常な反応を示し、残りのランの胚は典型的なCベンド+エスケープスイミング反応を示さない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/66153fig02largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
表1:適合度を推定するための統計的パラメータと、決定されたBMC値を受け入れるための閾値。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表2:振動驚愕応答アッセイシステムの特性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Table%202.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:設定ファイル用のExcelテンプレート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 2: サンプル・データ・セットを含む KNIME 入力テンプレート。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル3:KNIME出力ファイルの例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66153/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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本稿では、ゼブラフィッシュ胚の振動驚愕応答に基づく化合物毒性評価のためのスクリーニングシステムのワークフローとデータ解析について述べる。振動刺激を受けたゼブラフィッシュの胚の動きを記録し、一般毒性・致死性および神経筋毒性を総合的に評価することができます。

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of ...

化学物質の毒性をスクリーニングする場合、現在の実験上の課題は、生物全体の複雑さを考慮して、生体内で毒性効果を決定し、これを迅速でハイスループットな方法で行うことです。振動刺激に対するゼブラフィッシュ胚の脱出応答をモニターする行動読み出しを用いることで、神経機能や筋肉機能に干渉する化合物を特定することができます。死んだ胚は動かないため、非特異的な毒性によって致死性を引き起こす化合物も捕捉します。私たちが提示するシステムは、手頃な価格で構築でき、カスタマイズ可能です。また、メンテナンスも簡単で、すべての部品を交換できます。現在、PrecisionToxコンソーシアム内の驚愕アッセイシステムを使用して、OMICSデータ取得用の化合物の投与量を決定しています。データは、5つのモデル生物とヒト細胞株にわたって生成されます。これらは、ヒト毒性予測のための毒性経路とバイオマーカーを導き出すために使用されます。

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Research

JoVE Journal

Biology

Evaluating Toxicity of Chemicals using a Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

799 ビュー.  Karlsruhe Institute of Technology - Campus Nord. 化学物質の毒性をスクリーニングする場合、現在の実験上の課題は、生物全体の複雑さを考慮して、生体内で毒性効果を決定し、これを迅速でハイスループットな方法で行うことです。振動刺激に対するゼブラフィッシュ胚の脱出応答をモニターする行動読み出しを用いることで、神経機能や筋肉機能に干渉する化合物を特定することができます。死んだ胚は動かない?...

ビデオ: 著者スポットライト:ゼブラフィッシュ胚驚愕反応アッセイを用いたハイスループット毒性スクリーニング

We developed a simple screening system for the evaluation of neuromuscular and general toxicity in zebrafish embryos. The modular system consists of electrodynamic transducers above which tissue culture dishes with embryos can be placed. Multiple such loudspeaker-tissue culture dish pairs can be combined. Vibrational stimuli generated by the electrodynamic transducers induce a characteristic startle and escape response in the embryos. A belt-driven linear drive sequentially positions a camera above each loudspeaker to record the movement of the embryos. In this way, alterations to the startle response due to lethality or neuromuscular toxicity of chemical compounds can be visualized and quantified. We present an example of the workflow for chemical compound screening using this system, including the preparation of embryos and treatment solutions, operation of the recording system, and data analysis to calculate benchmark concentration values of compounds active in the assay. The modular assembly based on commercially available simple components makes this system both economical and flexibly adaptable to the needs of particular laboratory setups and screening purposes.

We describe a screening system's workflow and data analysis for evaluating chemical compound toxicity based on the zebrafish embryo vibration startle response. The system records the movements of zebrafish embryos upon exposure to a vibration stimulus and allows for an integrated evaluation of general toxicity/lethality and neuromuscular toxicity.