膵臓癌マウスモデルにおける腫瘍浸潤リンパ球のフローサイトメトリーに基づく単離と治療的評価

私たちは、膵臓がんモデルで腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を分離し、養子縁組に移す方法の開発に焦点を当てています。私たちは、TILのサブセットがin vivoで膵臓腫瘍を効果的に標的にして殺すことができるかどうか、そしてT細胞を将来の臨床試験にどのように最適化できるかに答えようとしています。TILの単離および発現技術の強化、TILの緩やかな修飾による標的化の改善、TIL療法とチェックポイント阻害剤や標的療法などの他の免疫療法との併用による抗腫瘍効果の向上など、養子細胞療法の最近の開発。

私たちは、膵臓がんモデルから腫瘍反応性TILを単離および拡大するための堅牢な方法を確立しました。養子移植された腫瘍反応性T細胞の抗腫瘍効果の向上を実証しました。私たちのプロトコルは、他の特異性の低い方法と比較して腫瘍特異的TILの分離と選択を可能にすることにより、養子細胞療法へのより的を絞ったアプローチを提供します。

また、非侵襲的な腫瘍モニタリングのために生物発光イメージングによっても使用されます。私たちの調査結果は、TIL治療の有効性を評価し、膵臓がんのT細胞サブセットの治療パラメーターを最適化するための標準化された前臨床モデルを提供することにより、この分野を前進させます。マウスで同所性膵臓腫瘍を誘導するためのKPC-ルシフェラーゼ細胞懸濁液を調製するには、KPC-ルシフェラーゼ細胞株を摂氏37度で1分間トリプシンします。

トリプシン処理後、PBSを添加し、細胞を移し替えてから、細胞懸濁液を遠心分離します。細胞をカウントし、30%基底膜マトリックスを含むPBS中に10×10の6細胞の累乗で再懸濁します。麻酔をかけたマウスを手術台に置きます。

左腹部を0.5〜1センチ切開した後、鉗子で脾臓を押さえ、膵臓を露出させます。KPC-ルシフェラーゼ細胞と基底膜マトリックス混合物を調製した後、29ゲージの針を使用して、50,000個の細胞を含む細胞懸濁液を50マイクロリットルを膵臓に注入します。膵臓を腹腔に戻します。

腹膜と皮膚を順次縫合します。マウスが完全に起動するまで、暖かいパッドで回復させます。7日後、マウスに60マイクロリットルのD-ルシフェリンカリウム塩溶液を腹腔内に注入して、ライブイメージングを行います。

麻酔後、マウスを生体内イメージングシステムに配置して、生物発光を検出します。イメージング後、マウスをシステムから取り外し、麻酔から自然に回復させます。まず、ドナーの安楽死させたマウスを手術台に置きます。

75%エタノールで全身を滅菌します。滅菌フードで、はさみと鉗子を使用して腹腔を開きます。腫瘍を切除し、氷上のPBSに入れます。

バーニア口径で腫瘍のサイズを測定します。次に、画面上の式を使用して腫瘍の体積を計算します。コラゲナーゼ、ディスパーゼII、およびRPMI 1640中のDNAse Iを用いて1X消化溶液を調製した後、12ウェルプレートにウェルあたり1〜2ミリリットルの溶液を加えます。

はさみを使って腫瘍を細かく刻みます。腫瘍片を12ウェルプレートの各ウェルに移し、摂氏37度で70RPMで30分間振とうしながら消化します。消化を終了するには、1〜2ミリリットルの10%ウシ胎児血清を追加し、細胞懸濁液を収集チューブに移します。.

12ウェルプレートのウェルをPBSで2回洗浄し、残っている細胞を回収します。70 μメートルの細胞ストレーナーで細胞懸濁液をろ過し、組織片をミンチして粉砕し、シリンジプランジャーの平らな端を使用して単一細胞を放出します。濾液を400 Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、ペレットを5%ウシ血清アルブミンに再懸濁してフローサイトメトリー染色を行います。

まず、担がんマウスから単離した細胞を、非担腫瘍マウスの脾臓または末梢血単核球とともに作業プラットフォームに置きます。FCブロッカーおよびフロー抗体を用いて細胞を1〜100希釈で染色します。チューブを氷の上で暗闇で30分間インキュベートします。

インキュベーション後、細胞をPBSで2回遠心分離して洗浄し、PBS中の1%ウシ血清アルブミンに再懸濁します。フローサイトメーターでCD45+CD3+細胞を選別するために、FSC-AおよびSSC-Aに基づいて生細胞をゲートし、ゲートP1を作成します。次に、FSC-AおよびFSC-Hに基づいてP1からシングルセルをゲートし、ゲートP2を作成します。CD45およびCD3ゲーティングを使用して、P2からCD45 + CD3 +細胞を選別します。選別した細胞を採取チューブに集めます。

遠心分離機でCD45+CD3+細胞を400Gで5分間、摂氏4度で選別しました。マウス血清中の細胞を10×10の濃度で6細胞/mLの累乗で再懸濁し、氷上に置く。腫瘍誘発性レシピエントマウスを手術台に置きます。

29ゲージの1/2インチインスリン注射器を使用して、選別された免疫細胞を腹腔内に注入します。次に、インターロイキン-2を3日間連続して腹腔内投与します。