この方法は、膵臓癌中の細胞傷害性T細胞応答に影響を与えるか、または増強する新しい治療薬または戦略を、どのようにアセスするのに使用することができる。この技術により、腫瘍を迅速に消化し、インビトロで刺激することができ、同時にT細胞応答の複数のパラメータの分析を可能にし、他のアプリケーションに容易に適応することができる。まず、鉗子を使用して、腫瘍をシャーレに移します。
酵素活性の発生を防ぐために、50ミリリットルの消化培地を氷上に5ミリリットル保存します。ペトリ皿の腫瘍をカバーするために、この溶液の小さなアリコートを取る。滅菌メスと鉗子を使用して腫瘍を小片に切り、およそ3ミリメートル未満の長さに切ります。
腫瘍片をチューブに削り取り、すべての部分が消化媒体に沈むまでチューブを穏やかに反転させます。チューブを37°Cで20分間揺れる装置に移して消化します。腫瘍のすべての部分が水没し、チューブの端にくっついないようにしてください。
消化ステップの直後に、チューブを氷の上に置いて酵素活性を遅くする。EDTAを加えて20ミリモルの最終濃度を達成し、さらに酵素活性を遅くするためにサンプルを混合する短時間渦を加える。チューブを開き、新鮮なRPMI培地でチューブの蓋から任意の腫瘍消化をすすいでください。
その後、70ミクロンのストレーナーを準備し、氷の上に50ミリリットルのオープンチューブの上に置きます。フィルターを培地で事前に濡らします。消化した細胞を再び懸濁し、25ミリリットル以上のストリペットを使用してチューブの側面を洗います。
ストライプの広い開口部は厚いダイジェストが容易に通過することを可能にする。25ミリリットルのストリペットを使用して、すべてのダイジェストをストレーナーに移します。1ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、フィルターの上の腫瘍を上下にマッシュダウンします。
回転数でストレーナーを通して細胞を連続的に洗浄します。細胞を押し通すのに十分な力で洗うようにしてください。すべての細胞がストレーナーを通過するまで洗浄を続けます。
チューブをGの300倍、摂氏4度で5分間遠心します。細胞ペレットを慎重に再懸濁し、RPMIを完了し、別のフィルターを直接通過して、細胞外マトリックス、または十分に再懸濁できない大きな細胞塊を除去します。刺激が必要ない場合は、すぐにフローサイトメトリー分析のために単離された細胞を染色するか、10%DMSOおよびFBSの凍結培地で再懸濁し、マイナス80°Cで保存します。
刺激を行うために、まず細胞を数える。完全な培地で細胞を希釈し、100マイクロリットルあたり6倍の濃度を達成します。U底96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの細胞をプレートします。
PMAの2X調製物、およびイオノマイシンを含む完全な培地の100マイクロリットルを加える。プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、5%の二酸化炭素を1時間置きます。次いで、ブレフェルディンAの10X調製物の20マイクロリットル、およびモネンシンで、完全な培地で、それぞれ1.06マイクロモル、および2.0マイクロモルの最終濃度を達成した。
プレートをインキュベーターにさらに4時間戻します。1000 TB32048細胞を膵臓に注入した後、正交性腫瘍の発症に約30日かかります。採取された直交性腫瘍の消化および刺激後、蛍光マイナス1を行い、格化のためのバックグラウンド蛍光を決定した。
ブレフェルディンAモネンシンのみ制御が行われ、サイトカインの基礎生産を決定した。ブレフェルディンAおよびモネンシンによるインターフェロンガンマインキュベーションの場合、脾臓および腫瘍サンプルの両方において、FMO対照に対するインターフェロンガンマの増加はなかった。しかし、PMAおよびイオノマイシンを添加すると、脾臓および腫瘍由来CD4陽性およびCD8陽性T細胞の両方で検出可能な細胞内インターフェロンガンマの割合が増加した。
脾臓CD4陽性およびCD8陽性T細胞は、陽性対照として使用され、腫瘍浸潤T細胞サブセットよりも比較的高いインターフェロンガンマ産生を有する。腫瘍内で免疫抑制が起こることを示す。TNF αに対して同じ戦略を用い、細胞内TNFαに対して高い割合の脾臓CD4陽性T細胞が陽性であった。
腫瘍浸潤CD4陽性T細胞と比較した。脾臓および腫瘍浸潤CD8陽性T細胞は、同様のレベルのTNFαを産生した。腫瘍が十分に切り刻まれ、すべての部分が消化媒体に沈めていることを確認してください。
腫瘍をつぶすときは、優しく、細胞を徹底的に洗い流してください。腫瘍消化プロトコルはフローアシスト細胞分類と組み合わせることができ、個々の免疫細胞サブセットを精製して、追加、機能的、または遺伝子発現解析を行うことができます。この方法を用いて、膵臓がん中のB細胞が免疫応答を形成し、B細胞ノックアウトマウスとB細胞枯渇マウスの両方で正腸腫瘍を発生させる方法を特徴付けました。
