Morhardt Labでは、ゼブラフィッシュを動物モデルとして使用して、膀胱の発達と機能を研究しています。私たちは、ゼブラフィッシュで満たされたり空になったりする機能的な膀胱を特定しました。ゼブラフィッシュは小型ですが、その大きさを活かして、空間的トランスクリプトーム技術や脊椎動物の膀胱の理解を経済的に活用することを目指しました。
空間的トランスクリプトーム技術は、試薬や機器が最適化されていないと、すぐに高価になる可能性があります。このプロトコルは、ゼブラフィッシュを使用してこれを達成するための実証済みの技術を提供し、期待される結果と、技術の結果として発生する可能性のある問題の軽減に関する洞察を提供します。高価な空間トランスクリプトーム技術を経済的に利用するだけでなく、この研究により、バッチ効果を最小限に抑えながら、複数の年齢にわたって本質的に全身の臓器の大規模な空間トランスクリプトーム分析を行うことが可能になりました。
まず、クライオスタットを摂氏22度に冷却し、必要なアイテムをすべて集めます。サンプルの位置合わせ用に使い捨てのプラスチック金型を準備します。ベースモールドの内側にラボテープを敷き、油性マーカーを基準点として直線を引きます。
クライオセクショニング中にサンプルの適切な向きを確保するために、ベースモールドの内側に印を付けます。凍結媒体ボトルのノズルをプライミングした後、必要な量をベースモールドの1つのコーナーに分配します。ベースモールドをゆっくりと傾けて、メディウムを均等に分散させます。
次に、ベース型を凍結培地と一緒に氷浴に入れ、少なくとも10分間インキュベートして培地を冷却します。次に、ドラフトの下のアイスバケツにドライアイスの一部に100%エタノールの一部を追加します。使い捨てのアルミ皿またはボートを氷浴に入れ、バケツを5〜10分間覆います。
安楽死させた魚を摂氏4度の水に10分間沈めた後、魚を集めます。先端の細い鉗子を使用して、尾びれをつかんで魚を取り除き、糸くずの出ない吸収性のワイプにそっと押し付けて乾かします。準備したベースモールドを10倍の倍率の実体顕微鏡の下に置きます。
サンプルを金型内の基準点に沿って正しい方向に配置します。サンプルを別の薄い凍結媒体の層で優しく覆います。解剖学的な基準点を使用して、魚をベースモールド内のマークされた線に正確に位置合わせし、先端の細い鉗子を使用して向きを調整し、気泡を避けます。
サンプルの下のベースモールドの底にドライアイスを塗布し、所定の位置に局所的に凍結します。完全に凍結する前に、サンプルのミスアライメントを防ぐために、水平面を水平に保ちます。次に、サンプルを入れたベースモールドを、ドライアイスとエタノール浴のアルミボートまたは皿に置きます。
ボートが水面に浮いたままで、ベースモールドが乾いたままであることを確認してください。浴に蓋をして、サンプルを10分間凍結させます。次に、凍結したベース型をホイルで包み、切片化の準備が整うまで摂氏80度の冷凍庫で保管します。
凍結したベースモールドを予冷したクライオスタットに持ってきてクライオセクショニングを行い、クライオスタットチャンバーに入れます。空間イメージングスライドを保管場所から取り出した後、事前に冷やしたスライドホルダーに入れます。空間イメージングスライドを装着したスライドホルダーは、切片収集の準備が整うまで摂氏22度のクライオスタットチャンバーに保管します。
次に、凍結したサンプルをベース型から取り出し、新鮮な凍結媒体を入れたチャックに入れ、切断面がミクロトームブレードに面するようにします。次に、新しい細かいミクロトームブレードをクライオスタットに入れます。金型をブレードに位置合わせした後、推奨厚さ20〜50マイクロメートルで対象領域をトリミングします。
金型内のマーキングが凍結ブロックに転写され、サンプルの向きが適切であることを確認してください。トリミング中に金型を調整して、切断面が凍結媒体の参照マーキングと平行になるようにします。凍結したブロックから切片をスライスし、標準的な正に帯電した顕微鏡スライドに集めます。
切片を明視野顕微鏡で確認し、トリミングが完了したことを確認します。次に、空間イメージングスライドをクライオスタットチャンバーから取り出し、スライドホルダー内に保持したまま、摂氏4度の氷浴に入れます。10〜14マイクロメートルの推奨厚さで凍結切片を開始します。
関心領域に到達するまで、正に帯電したスライドに切片を収集します。次に、アイスバスからシングルセル空間イメージングスライドを取り出し、スライドをホルダーから取り外します。転がりを防ぐために、先端の細い絵筆を使用してセクションを行ごとに収集します。
次に、空の凍結媒体の角を、絵筆の裏側を使用してナイフステージに押し付けます。スライドの上部をピボットポイントとして使用し、スライドをゆっくりとセクションに下げて、持ち上げる前に3秒間接着させます。スライド上のスペースを最大化するために、シリアルセクションを互いに平行に並べます。
対象領域から切片を収集した後、スライドをスライドホルダーに戻します。これ以上サンプルが不要な場合は、スライドを摂氏80度で最大2週間保存してから分析してください。対象領域の前後の切片を標準的な正電荷の顕微鏡スライドに集め、ヘマトキシリンとエオシンの染色を行ってサンプルのアライメントと切片の品質を評価してから、分析を進めます。
複数のセクションの整列は、同じカット内のセクション間で構造を比較することにより検証されました。埋め込みと収集のステップを調整することで、空間トランスクリプトームスライドのイメージング領域内により多くのセクションを収めることができました。空間的トランスクリプトームのシグナル品質は、組織領域内では高かったが、シグナルの複雑さが低かったため、空のスライド領域では低かった。
