This work was funded by a Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship to Y. F. 100104/Z/12/Z.
We would like to thank Dr. Carl Tucker and the team of the fish facility at the Queen&#8217;s Medical Research Institute, University of Edinburgh. We like to thank Michael Millar of the immunohistology and imaging facility of the MRC Centre for Reproductive Medicine, University of Edinburgh for support.
We thank Prof. Dr. Matthias Hammerschmidt and Dr. Heiko Loehr of the Institute of Developmental Biology, University of Cologne for providing the p5E-krt4 entry vector. We also would like to thank Dr. Dirk Sieger of the Centre of Neuroregeneration, Univerity of Edinburgh for providing the pDestTol2CG destination vector.

以下の実験手順は、動物（科学的処置）法1986年に厳密に従って実施された。 マイクロインジェクションのためのプラスミドDNAの調製<ol><li>製造業者の説明書に従って市販のプラスミドDNA精製キットのeGFPおよび100 ngの/μlの最終原液濃度にプラスミドDNAを希釈：cmlc2; KalTA4-ERのT2：プラスミドpTol2-krt4を精製する。 </li><li>メーカーのプロトコルに従って、BamHI制限消化によって、プラスミドpT3TS / Tol2の14を含むトランスポザーゼを、線形化。このステップは、一晩に拡張することができる。標準的なプロトコルに従って、フェノール/クロロホルム抽出により線状化DNAを沈殿させる。 </li><li> インビトロでは 、メーカーの指示に従ってキャップされた大量のRNAのための商業転写キットと線状プラスミドからトランスポゼースmRNAを転写するように希釈し、アリコートヌクレアーゼフリー水で100 ng /μLでの最終原液濃度。ネイティブ1から2パーセントTAE（40 mMトリス、20 mMの酢酸、1mMのEDTA）アガロースゲル電気泳動（80〜120 V）で精製されたRNAの品質を確保する。 -80℃でRNAを保管してください。 </li></ol>一過性の遺伝子発現のためのプラスミドDNAの2マイクロインジェクション<ol><li>注入中に受精卵を保持するためにアガロース注入プレートを準備します。 90ミリメートルペトリ皿に液3％アガロースを注ぐ。 40〜50℃にアガロースクールをしましょう​​と、液体アガロースの上にくさび形のマイクロインジェクション金型TU-1を追加します。室温で硬化させた後、金型を削除する前に、30分間、4℃でアガロース残りをしましょう​​。 4℃、再利用での店舗マイクロインジェクション金型。 </li><li>注射液の一定量を準備します。氷の上で、次の手順を実行します。ピペットプラスミドDNA（最終濃度10ng /μL）、トランスポザーゼmRNAの2μL（最終濃度20 ng /μLで）、2の1μLへの10mgのμL/μlのローダミンBイソチオシアネート-デキストラン、5×Danieau溶液2μL（290のNaCl、3.5のKCl、2mMのMgSO 4を、3のCa（NO 3）2、25 mMのHEPES、pHは7.6）ヌクレアーゼフリー水で10μlの最終容量。 </li><li>マイクロピペットプラーと反対方向にキャピラリーを引っ張って内側のフィラメントを含む直径1mmのホウケイ酸ガラスキャピラリーから針を準備します。次のプログラムを使用してください：530を加熱し、200、速度80、時間150を引っ張る。 </li><li> （氷上で維持）注射液の2μlの1針を埋める。キャピラリー内に溶液を放出しながら慎重にmicroloader先端を引き出すことによって、気泡を避けてください。慎重にピンセットで針の先端を破る。 </li><li>空気圧ピコポンプで液滴サイズを調節する。ドロップ直径/容積（V = 4/3πR3）を測定し、ジメチルポリシロキサンでステレオスコープの下接眼マイクロメータを用いて液滴サイズを調整します。お勧め100ミクロン、0.5 NLに対応する。これは、各注入された胚あたりの均一かつ再現可能な濃度を保証します。注入された濃度を滴定し、各構築物およびプラスミド調製のために調整します。 </li><li> 3ミリリットルpastetteを使用することにより、射出プレートの型の中にnz50Tg 16（：のeGFP-HRAS G12V UAS）のTg（DsRed2のlysCを）とio006 15 のTgのクロスから得た接合体（ 図1A）を配置します。一方、枯渇及び凝固からソリューションを避けるために、ジメチルポリシロキサンで事前調製された注射針の先端を保つ。 </li><li>事前の最初の切断（ 図1A）の胚盤17内に絨毛膜を通してステレオスコープの下で予め測定された降下（0.5 NLに対応した100μm）を、注入します。 1細胞期への注入は、プラスミドDNAとRNA現像細胞塊および生殖系列伝達の可能性の均一な分布の可能性を増加させる。それはある構築物の発現は、より頻繁にモザイク状になる傾向があることは注目に値する。 </li></ol> 4-ヒドロキシ3.条件付皮膚細胞の形質転換（4-OHT） <ol><li> 0.3X Danieau溶液中に注入した胚を移し、インキュベーター中で28.5℃で保管してください。球ステージ17で皿から未受精卵を削除します。同時注射ローダミンBイソチオシアネートデキストランを蛍光ステレオスコープの下で注入制御として利用することができる。 </li><li> eGFPの心臓の表現のための24 HPF（時間後に受精）の画面の胚。 72 HPFまでEGFP陽性ゼブラフィッシュ胚：cmlcを上げ続けます。慎重に（Danieau 0.3X）の水質を監視する。 </li><li> 72 HPFで鉗子で孵化していないものの胚の絨毛膜を除去します。慎重に1鉗子で絨毛膜を突くと、他を使用して、それを引き離す。 のlysCのための胚を選択：蛍光ステレオスコープを使用してDsRed2の式 。 </li><li> 10 mMの10μlのを追加します。0.3X Danieau溶液20mlに（Z）-4-ヒドロキシタモキシフェン（5μMの最終濃度）の株式。 40-60胚のバッチに1標準ペトリ皿（90ミリメートル）のための4-OHT誘導-ソリューションを使用してください。 </li><li>作りたての誘導溶液20mlを含む新しいペトリ皿に胚を移す。 4-OHTは暗所に保存して処理する必要がある。発現の最初の徴候は、2時間後の誘導開始を検出してもよい。前腫瘍細胞の相互作用は、すでに治療後数時間を発生する可能性があります誘導ステップは、最初の宿主細胞があることを念頭に置いて、一晩拡張することができます。 </li></ol> 4.取付け·ゼブラフィッシュ幼虫のライブイメージング<ol><li> 18〜20ミリメートルの直径を有する穴を導入することにより、60ミリメートルペトリ皿を準備します。 25mmのカバーガラス（ 図1B）を有するペトリ皿の外側の底に穴を覆って密封するために高真空シリコーングリースを使用する。 </li><li> 1％低融点（LMP）アガロースを準備します。 1 1.5mlチューブにしてください加熱ブロック中で37℃でLMPアガロース。 </li><li>蛍光ステレオスコープの下の緑色蛍光皮膚細胞とDsRed2の正の先天性免疫細胞発現のための幼虫、事前選択のTg（DsRed2のkrt4：KalTA4-ERのT2;; UASのlysCのeGFP-HRAS G12V）。 20mlの誘導溶液に0.4％トリカイン18を1mlの添加により幼虫麻酔。 </li><li>液体LMPアガロースにpastetteで事前に選択された幼虫を転送します。幼虫はアガロースLMPに沈むましょうとカバーガラス（ 図1B）にそれらを転送する。ステレオスコープの下で胚を方向付ける。幼虫（6幼虫まで）作動距離を減少させるためにガラス上に直接配置されなければならない。 </li><li>それは（ 図1Bの矢印）を硬化した後に誘導溶液を含むトリカインとLMPアガロースをカバーしています。 </li><li>画像倒立蛍光、レーザースキャニングまたはスピニングディスク共焦点顕微鏡を使用して埋め込まれた幼虫。 40Xや63Xを使用してください長作動距離の目標としての目的は全体の幼虫を通して焦点有効。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

胚及び幼虫の発育中に、ゼブラフィッシュ胚の皮膚は2つの上皮層からなる表面層と呼ばれる周皮とその下の基底膜19に取り付けられている基底ケラチノサイトの層（ 図1C、a）である 。ここに提示されたプロトコルは、条件付きゼブラフィッシュ幼虫の表皮層における前新生物細胞の形質転換を誘導するための簡単​​な方法を記載し、ライブイメージングによる自然免疫細胞とのその後の相互作用の分析を可能にする。私たちのプロトコルの基本的な方法論は、十分に確立されたゼブラフィッシュのテクニック9従う- 13、そして私たちのプロトコルが容易に適合し、変更することができます。 ここで使用krt4プロモーター 5が最も外側の表皮層（ 図1C、B）で特異的にKalTA4-ER T2が発現を駆動する。しかし、モジュラーマルチサイトゲートウェイkrt4を生成するために使用されるクローニング戦略：KalTA4-ER T2の構築物（ 図1D、a）が 、単一のクローニング工程でKalTA4-ER T2の前に興味のある任意のプロモーターをクローン化する可能性を提供する。ここに提示された方法の適応は、胚形成および幼虫の段階でほとんどの組織のためのことが可能である。プロモーター配列の利用可能性は、本明細書制限要因である。さらに、UASの後ろにクローン化された興味のあるほとんどすべての遺伝子は、条件付きで、空間と時間的に制御KalTA4-ER T2の表現を使用することによって異なる発生段階で過剰発現させることができる。したがって、我々のプロトコルは、モザイク状に、ゼブラフィッシュの幼生において任意の目的の組織における遺伝子発現の条件を実行するように適合させることができる。一つは、また、肝臓や膵臓などの画像より深い組織を生きるために、設定を顕微鏡を最適化することができます。 我々は、彼プロトコルを使用して一つのアプリケーションを記載している再、同様に、1は1つが、画像中球と候補炎症調節因子の発現の誘導と逮捕、次のマクロファージ行動の変化を簡単に生きることができるように、炎症反応の調節を研究するためにこのプロトコルを使用して他の炎症調節因子を過剰発現することができます。さらに、適合したプロトコルも標的とすることができる他の特定の細胞系統と、自然免疫細胞の相互作用の相互作用、組織の形態形成や器官形成の異なる段階の間、細胞運動や行動変化をトレースしたい人と、最終的には、ライブ画像のために有益であろう誘導性KalTA4-ER T2 / UAS発現系による。 SEとして緑色蛍光陽性の心によって胚のその後の選択を可能にする（A、図1D） のeGFP-PAカセット：cmlc2が含まれている23 -私たちは、ゼブラフィッシュTol2kit 20からpDestTol2CGベクトルを使用F0スクリーニングプロセスを簡素化lectionマーカ20。ゲノムへの関心のトランスポゾン隣接した遺伝子の安定な挿入は、トランスポザーゼmRNAと一緒に、プラスミドDNAの共注射により促進される。マイクロインジェクションのためのプラスミドDNAとトランスポザーゼmRNAの調製は、標準的なプロトコールに従う。しかし、ゲノムへの構築物の統合の成功はTol2のベースの転置14に依存します。これはRNアーゼおよびDNアーゼによる汚染や劣化を避けるために、無菌条件下で氷の上で動作するように支払われる特別の注意を強調しています。 1細胞期胚へのマイクロインジェクションは、ゼブラフィッシュ9,10における機能研究のゲインと損失のための堅牢で十分に確立された技術である。よく訓練された人は簡単に1時間で1,000人以上の胚の卵黄に注入することができますが、胚盤（ 図1A、アスタリスク）への注入は、より多くの経験と訓練が必要です。この手順の間に重要な私針の取り扱いがね。針が損傷することなく細胞に浸透することが非常に薄くなければならないので、唯一の非常にチップを破壊する必要がある。これは、定期的に制御し、各胚に均一な注入を保証するために、注入中に液滴サイズを測定することが重要である。慎重に処理、針が胚を回転させるために使用することができる。これは、多くの場合、胚盤と最適普及角度を見つけるために必要とされる。 ほぼ確実に注射のために使用したDNAとトランスポザーゼmRNAの濃度は、発現効率に影響する。より高用量は、導入遺伝子を発現する細胞の割合が増加するが、DNAのより高い濃度（&gt; 50 ng /μLで）でリードしたmRNA（&gt; 100 ng /μLで）また、注入した胚の中で毒性作用の可能性が発生しないがトランスポザーゼができます。私たちは、10 ng /μLでDNAとプラスミドDNAの50 PGと注入されたEMBあたりのRNAの100 PGに対応して注入するための20 ng /μLでトランスポゼースmRNAの使用を好む亮。これらの濃度を注入した胚の100％が、単一の細胞内への注入効率に応じて、4-OHTの誘導後、正常に発達し、40〜70％の間ショーのeGFP-HRASのG12V式でください。正の胚の中で、我々は、通常、1〜10個のクローンを有し、約30％、10〜50個のクローンと、50以上のクローンを有する30％、40％を見つける。起因する我々の研究の目的のために、我々はeGFPの-HRAS G12Vを発現している少数のクローンと胚の使用を好む。私たちは、一過性の実験のために10〜50個のクローンを持つ胚を選択します。トランスジェニック創始魚の世代のために、我々は唯一のEGFP陽性心臓マーカーとその表皮におけるEGFP-HRAS G12V陽性クローン多数の両方を持つ胚を選択することをお勧めします。 光24にさらされると（Z）-4-ヒドロキシタモキシフェンは、シス-トランス（EZ）の相互変換を受ける。これは、シス異性体（E）は、そのトランス対応25,26より100倍少ない抗エストロゲンであることが見出された。 Exposurしたがって、点灯する電子は避けなければならない。エタノールに溶解した4-OHTのストック溶液は、長い時間にわたって暗所に-20℃で保存することができる。私たちは、インキュベーターや輸送中の標的遺伝子誘導の間に光からペトリ皿を保護するためのボックスを使用することをお勧めします。イメージングの領域であるが、より長い期間にわたって撮影が最大発現レベルを維持することが推奨されている間2時間毎に非常に小さく、UV光に4-OHTの露出は最小限に抑えられ、誘導溶液の為替。 4-OHTを効果的にゼブラフィッシュ胚発生の間に絨毛膜および最も外側の皮膚層を介して透過性に、したがって、それは非常に迅速に遺伝子発現を誘導することができる。我々は容易に誘 ​​導の2時間後のeGFP発光を観察することができ、標的遺伝子発現の最初の兆候は、治療8の3時間後、1時間後にプラトーに観察することができることが報告されている。違いは、私たちの研究で用いた異なるプロモーターによるものである可能性があります。き広報を有するものeviously 4-OHT処理は用量依存8,27であることを報告し、私たちは、過渡的なアプローチで、堅牢で再現性の発現レベルを達成するために5μmの最高報告濃度を使用することにしました。これは、導入遺伝子を保有する全ての細胞が、標的遺伝子の発現を誘導することを保証すべきである。 それにより、複数のランダムなゲノム挿入事象の可能性をここに提示過渡的なアプローチは、様々な発現レベルにつながる可能性があることを考慮に入れなければならない。また、Tgは（UAS：eGFPを-HRAS G12V）のTol2のトランスジェニックバックグラウンドでトランスポゼースmRNAの使用がio006は、遺伝子サイレンシングまたは混乱の原因となりUAS導入遺伝子の潜在的な転位につながることができます。ここで紹介する方法は、過渡的なアプローチを表ししかし、注入後の胚の事前選択は必須です。多くのラボでは、UAS配列が故にで、トランスジェニック子孫に沈黙される傾向があることを見出したcmlc2は、KalTA4-ERのT2：：eGFPをは（UAS：eGFPを-HRAS G12V）のTgに構築io006胚はTgのへの構築UASを注入するほど効率的ではないかもしれません（krt4：KalTA4-ER T2は 、cmlc2：pTol2-krt4をjecting GFP ）の胚。安定したトランスジェニック線 TGの使用時間に用量依存4-OHTの遺伝子活性化のオン/オフ反応速度の正確なモニタリングが可能になりますio006（krt4：KalTA4-ER T2が ）のTg（EGFP-HRAS G12V UAS）と交配。 幼虫の実装時の重要なステップは、LMPアガロースへとカバーガラス（ 図1B）に転写される。いずれかの熱ショックによって魚を傷つけるまたはゲルが硬化することなく、予め選択された幼虫の安全な転送および配向を可能にする液体LMPアガロース温度短期間のみ存在する。幼虫は、その後顕微鏡ANALYための作動距離を減少させるためにカバーガラス上に直接配向されるべきであるSIS。これは、顕微鏡の間に制限する要因となり得るように、適切な目標の選択が必須です。一度マウントされ、幼虫は数時間から数日を維持することができる。 本明細書で提示モデル系のコンディショナリティは、導入遺伝子の4-OHTの活性化によって繰り返し変換することができます。発現系は、4-OHTの存在に依存するため、目的とする遺伝子のKalTA4制御された発現（ 図1D、b）は、可逆的である。不可逆的なゲノム組換え事象28を容易にCre-ER T2 / Lox系とは対照的に、KalTA4-ER T2 / UASは、活性化非アクティブ4-OHTの追加または除去の際に繰り返し誘導のためのこの可能性は、利点であることができるのCre-ER T2 / Lox系オーバー技法。実験は、数日から数週間から延長する必要がある場合は、4-OHTの一定のレベルの要件は制限がある。

そうでなければ、正常な上皮シート内新生物発生前の細胞子孫の異常増殖が強く、その微小環境との相互作用に依存します。その宿主組織との相互作用は、前新生物細胞は、さらに本格癌に発展するクローンニッチを確立することができるかどうかの主要な決定因子である可能性が高い。開発におけるその重要性にもかかわらず、癌の進行のこの初期段階では、生体内で 、最も一般的に使用されるモデル系でアクセスできない。 ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは 、理由の開発を通じてその透明性、水溶性薬物のための遺伝子操作の可能性、およびアクセシビリティのライブイメージング研究のための十分に確立モデル生物である。上皮細胞を形質転換するために過剰発現する、ヒト癌遺伝子HRAS G12Vを幼虫のゼブラフィッシュモデルを用いた最近の研究では、宿主細胞は、特定のH 2 O 2のリードには、信号を導出することを示した先天性免疫細胞の動員。興味深いことに、動員された免疫細胞、好中球およびマクロファージは、前新生物細胞増殖2,3を支える栄養の役割を有することが示された。 腫瘍の開始と進行の初期の事象、ならびに炎症反応の寄与を理解するためには、以降最も早い時点から、これらのイベントの画像にできる必要がある。したがって、時間的および組織特異的な様式で細胞の変換を制御する必要がある。我々は成功して条件付きで皮膚特異的プロモーターケラチン4（krt4）の制御下にヒト癌遺伝子HRAS G12Vを表現するために、ショウジョウバエ 4から適応されたGAL4 / UASシステムを5利用する。転写活性化因子Gal4の修正バージョン、すなわちKalTA4 6は 、上流活性化配列（UASの制御下HRAS G12Vの発現を可能）。条件付き転写活性化因子の発現を誘導するために、KalTA4は特に4-ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）1に結合するヒトエストロゲン受容体α（ERのT2）7の変異体のリガンド結合ドメインに融合されている。 4-OHTの非存在下でのER T2は、熱ショックタンパク質により細胞質に結合される。 4-OHTの際に関心8の遺伝子を制御するUASのKalTA4-ER T2の核移行およびその後の活性化を可能にするタンパク質は、解離熱ショックを結合（ 図1Cを、b）のこの発現系は、4-OHTの存在に依存するので、関心対象の遺伝子のKalTA4制御された発現は可逆的である。不可逆的組換え事象をもたらすのCre-ER T2 / Lox系とは対照的に、KalTA4-ER T2による転写活性化の誘導は、追加又は4-OHTの除去により可逆的である。 以下のプロトコルアロ<html>ゼブラフィッシュ幼生における皮膚細胞の条件付き転換と蛍光タンパク質発現による自然免疫細胞との相互作用のその後のモニタリングWS。 13 -このプロトコルで用いられる基本的な方法論は、ゼブラフィッシュコミュニティ9内のいくつかの一般的に使用される技術と類似している。 世代と一緒にトランスジェニックコンストラクトのマイクロインジェクションによるトランスジェニック系統のコンビナトリアル使用は、モザイク的に単一の細胞を形質転換するための過渡的なアプローチを可能にします。胚および幼生ゼブラフィッシュの皮膚の酸素透過性は、数時間から数日から高解像度の顕微鏡によるタイムラプスライブイメージング研究のための可能性を高める。さらに、水溶性薬物へのアクセスは、将来の機構研究と癌発生の初期段階のより良い理解につながる可能性があり、生体内での細胞の生物学的事象のモニタリングが可能になります。 _content &quot;&gt;このプロトコルは、モザイク状に、ゼブラフィッシュの幼生において任意の目的の組織における遺伝子発現の条件を実行するように適合させることができる。一つは、皮膚以外の画像より深い組織を生きるための設定顕微鏡を最適化することができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1104">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:197px;">Company</td>
			<td style="width:124px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:467px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">(Z)-4-Hydroxytamoxifen&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H7904</td>
			<td>dilute in ethanol and store in the dark at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>20x/0,5 Ph2 &#8734;/0,17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>40x/1,2W Korr &#8734;/0,14-0,18</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">63x Objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>63x/1.4 Oil Ph3 &#8734;/0,17</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 510 META</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0171</td>
			<td>Diameter 25mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethylpolysiloxane</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>DMPSV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dow Corning high-vacuum silicone grease&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MKBL4135V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>P-97</td>
			<td>Program: heat 530, pull 200, velocity 80 and time 150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescent stereoscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>M205 FA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microinjection mold TU-1</td>
			<td>Adaptive Science Tools</td>
			<td>TU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microloader tip</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Axiovert 200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mMESSAGE mMACHINE Kit</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM1348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic pico pump</td>
			<td>World Precision Instruments&#160;</td>
			<td>PV820&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pneumatic pico pump</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>PLI-90A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td>27106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rhodamine B isothiocyanate-Dextran</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R8881</td>
			<td>10mg/&#956;l in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>M80</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>BMC developmental biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PloS one 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine/MS-222</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Low Melting Point Agarose&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15593-031</td>
			<td>25:24:1, v/v</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live imaging of innate immune and preneoplastic cell interactions using an inducible gal4/uas expression system in larval zebrafish skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

io006及びTg（lysCを：DsRed2の）のTg（eGFPを-HRAS G12V UAS）との間の相互の接合体nz50Tgは 1細胞期胚を得るために、10〜15分後に受精（ 図1A）を回収した。注入後、胚を4-OHTと誘導し、ライブイメージング（ 図1B）のためにマウントする前に、3 DPFまで提起された。 2-6取り付けられた胚は、倒立蛍光顕微鏡下でのどちらかに置かれた時間の誘導後（ 図2A）または倒立共焦点顕微鏡（ 図2B-C）、1.5分間隔で2〜3時間に結像。新生物発生前の表皮細胞は、正常ケラチノサイト、同様のeGFP-HRAS G12V局在化膜の緑色蛍光発光と比較して、それらのより丸みを帯びた形態学によって同定することができる。イメージングの領域は新生物発生前の皮膚細胞と自然免疫細胞（ 図2Aの矢印）の共局在のために選択した。速いMIGによるタイムラプス間隔は最大強度投影（ 図2、ビデオ1）を得るために0.7から1.7ミクロンのZスタックステップサイズで1.5分の間であるように選択された好中球の比プロセス。ライブイメージングしながら観察することができる行動の広い範囲があります：好中球は、次の前腫瘍細胞（ 図2C、ビデオ1）にし、下移動する細胞（ 図2BおよびC）への直接接触を形成する、受ける前腫瘍細胞の残留物を除去アポトーシス（ビデオ1）、または積極的に前新生物細胞（図示せず）の一部を巻き込む。相互作用の完全なスペクトルをキャプチャするためには、タイムラプスライブイメージングによって彼らの行動に従うことをお勧めします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" width="700px" /> 図1：ゼブラフィッシュ幼生の条件皮膚細胞の形質転換のための回路図。 （A） のTg（UASの受精卵の画像：eGFPを-HRAS G12V;のlysC：10分後に受精（MPF）でDsRed2の）ゼブラフィッシュ。受精卵は、絨毛膜（矢印）に囲まれています。注射のためのサイトでは、胚の動物極を定義卵黄（矢印）から細胞質ストリームによって形成され、胚盤（アスタリスク）です。ゼブラフィッシュ幼生の（B）取付。 25mmのカバーガラスで封止されている18〜20ミリメートル穴（矢印）と60ミリメートルのペトリ皿。ゼブラフィッシュの幼生を固定し、1％LMPアガロースによってカバーガラス上に搭載されている。 5μM4-OHTを含む0.3X Danieau溶液（矢印）は、LMPアガロースをカバーするために使用されている。（C）4-OHT表皮細胞の変換。幼虫皮膚の（a）は概略断面プロファイルを誘導した。胚および幼虫皮膚二つの上皮細胞層、表面細胞層および下層の基底膜（BM）に接続されたケラチノサイトの基底細胞層から構成されている。（b）は、一過性発現系トンO表皮細胞間の新生物発生前の細胞クローンを誘導する。 KalTA4-ER T2はもっぱらkrt4プロモーター （黄色）により駆動される最も外側の皮膚層で発現される。一過性発現系のKalTA4-ER T2は前腫瘍細胞（緑）のクローンにつながる、制御UAS（青）表層細胞におけるEGFP-HRAS G12V発現を活性化する。（D）回路図のモザイク表現。の（a）の Tol2のカセットpTol2-krt4：KalTA4-ERのT2; cmlc2：一過使用eGFP発現ベクターの転写活性化因子の発現の（b）の条件付き誘導。 KalTA4は、特に4-ヒドロキシタモキシフェン（4-OHT）に結合するヒトエストロゲン受容体α（ERのT2）の変異体のリガンド結合ドメインに融合される。 4-OHTの非存在下でのER T2は、熱ショックタンパク質（Hsp90の）によって細胞質に結合される。 4-OHTが結合するとHsp90はKalTA4-ERの核移行を可能に解離するT2とのeGFP-HRAS G12V発現制御UASのその後の活性化。スケールバーのA = 500程度である。 <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" width="700px" /> 図2：生物発生前と、自然免疫細胞の相互作用のライブイメージング。 （AC）4 Tgが DPFの画像（UAS：eGFPを-HRAS G12V;のlysC：DsRed2の）：; 1細胞期のEGFPおよびトランスポザーゼmRNAのpTol2-krt4を注射されている胚、cmlc2 KalTA4-ER T2を 。画像は、4-OHT誘導の6時間後に採取した6時間後の尾翼地域の（A）側面図皮膚細胞（矢印）を発現するのeGFP-HRAS G12Vのパッチを示す、治療後、及びlysC：。DsRed2の+好中球（矢印）。 （BC）代表的な画像TA皮膚細胞（緑）を発現するのeGFP-HRAS G12Vと好中球（赤）の相互作用を示す共焦点タイムラプス映画、から県。（B）前新生物細胞を接触させ、好中球（矢印）との短い糸状仮足の拡張を形成している。（C）好中球（赤）は、新生物発生前の皮膚細胞（緑色）のクローンに密着している。 Aのスケールバー=100μmの。 B / C =50μmである。 <a href="/files/ftp_upload/52107/52107fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52107/Video_1.mov" target="_blank">ビデオ1</a> ： 生物発生前と、自然免疫細胞の相互作用のタイムラプスライブイメージング 。 1細胞期のEGFPおよびトランスポザーゼmRNAの：;胚、pTol2-krt4を注入しcmlc2 KalTA4-ERのT2：;：4 TgはDPF（DsRed2のlysCのeGFPを-HRAS G12V UAS）のタイムラプス。 HO 6から9の共焦点タイムラプスムービーDsRed2の+の好中球（赤）のeGFP-HRASのG12Vを発現する皮膚細胞（緑）との相互作用：URSのlysCを示す4-OHT誘導後。好中球は、次の前腫瘍細胞へと下に移動して、アポトーシスを受ける前腫瘍細胞の残骸を削除します。 1.3ミクロンのZスタックステップ·サイズで3時間かけて1.5分のタイムラプス間隔。

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Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin | Developmental Biology | Video

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

前新生物細胞進行及び先天性免疫細胞相互作用の最も初期の事象を研究することは理解して癌を治療するために極めて重要である。ここでは、条件付きで上皮細胞の変換とHRAS G12Vは 、ゼブラフィッシュの幼虫に皮膚細胞を発現する、自然免疫細胞の相互作用のその後のライブイメージングを誘導する方法を説明します。

幼虫ゼブラフィッシュスキンにおける誘導GAL4 / UASの発現系を用いて自然免疫と前癌細胞の相互作用のライブイメージング

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

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11.8K ビュー.  The University of Edinburgh. 前新生物細胞進行及び先天性免疫細胞相互作用の最も初期の事象を研究することは理解して癌を治療するために極めて重要である。ここでは、条件付きで上皮細胞の変換とHRAS G12Vは 、ゼブラフィッシュの幼虫に皮膚細胞を発現する、自然免疫細胞の相互作用のその後のライブイメージングを誘導する方法を説明します。 

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3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

髄質胸腺上皮細胞の増殖、分化および無差別遺伝子発現を支える3D器官共培養モデル

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

発生生物学

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Photoconvertible PSmOrangeシステムを用いたGFPトランスジェニックゼブラフィッシュで細胞を追跡

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

調査cruzi トリパノソーマの原因運動In Vivo動物モデルとしてのゼブラフィッシュ稚魚の確立

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

ブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズの定量化

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with development, tissue homeostasis, and disease processes. Drosophila spermatocytes undergoing meiosis are ideal for this analysis because (1) whole Drosophila testes containing spermatocytes are relatively easy to prepare for microscopy, (2) the spermatocytes&#8217; large size makes them well suited for high resolution imaging, and (3) powerful Drosophila genetic tools can be integrated with in vivo analysis. Here, we present a readily accessible protocol for the preparation of whole testes from Drosophila third instar larvae and early pupae. We describe how to identify meiotic spermatocytes in prepared whole testes and how to image them live by time-lapse microscopy. Protocols for fixation and immunostaining whole testes are also provided. The use of larval testes has several advantages over available protocols that use adult testes for spermatocyte analysis. Most importantly, larval testes are smaller and less crowded with cells than adult testes, and this greatly facilitates high resolution imaging of spermatocytes. To demonstrate these advantages and the applications of the protocols, we present results showing the redistribution of the endoplasmic reticulum with respect to spindle microtubules during cell division in a single spermatocyte imaged by time-lapse confocal microscopy. The protocols can be combined with expression of any number of fluorescently tagged proteins or organelle markers, as well as gene mutations and other genetic tools, making this approach especially powerful for analysis of cell division mechanisms in the physiological context of whole tissues and organs.

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

The goal of this protocol is to analyze cell division in intact tissue by live and fixed cell microscopy using Drosophila meiotic spermatocytes. The protocol demonstrates how to isolate whole, intact testes from Drosophila larvae and early pupae, and how to process and mount them for microscopy.

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control over gene expression timing, location, and amplitude using light as the inducing agent. In this protocol, an optogenetic expression system is used to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos. This system relies on an engineered transcription factor called TAEL based on a naturally occurring light-activated transcription factor from the bacterium E. litoralis. When illuminated with blue light, TAEL dimerizes, binds to its cognate regulatory element called C120, and activates transcription. This protocol uses transgenic zebrafish embryos that express the TAEL transcription factor under the control of the ubiquitous ubb promoter. At the same time, the C120 regulatory element drives the expression of a fluorescent reporter gene (GFP). Using a simple LED panel to deliver activating blue light, induction of GFP expression can first be detected after 30 min of illumination and reaches a peak of more than 130-fold induction after 3 h of light treatment. Expression induction can be assessed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and by fluorescence microscopy. This method is a versatile and easy-to-use approach for optogenetic gene expression.

Optogenetics is a powerful tool with wide-ranging applications. This protocol demonstrates how to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos using the blue light-responsive TAEL/C120 system.

光遺伝学的TAEL/C120系を用いたゼブラフィッシュ胚における光誘導GFP発現

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...