Work in the Arur Lab is supported by grants from the National Institutes of Health, NIHGM98200; Cancer Prevention Research Institute of Texas, CPRIT RP160023; the American Cancer Society Research Scholar Award (ACS RSG014-044-DDC); and by the Anna Fuller Funds.

ここで説明するプロトコルは、主に無脊椎動物モデル系Cでありますエレガンス 、そして機関が定めるすべての倫理指針に従います。 1.動物のメンテナンス<ol><li> C.を維持E.を接種した寒天線虫成長培地20,21（NGM、参照材料表 ）上のストック培養作業エレガンス 大腸菌 OP50。 </li><li> 16℃と25℃の間の温度でワームストックを維持します。 注：より速い成長速度、多くの場合、異常な生殖系列発達と下ひなサイズで、より高い温度の結果でワームを培養します。また、温度感受性遺伝子型が異なる温度で異なる表現型を表示します。 </li><li>よく供給されたワームの一定の供給を維持するように、その成長率に応じて3日 - すべての2新NGMプレートにワームを転送します。 注：dpERKレベルを含む任意の実験のために、虫が飢餓や群衆の中から得られるべきではありませんエドプレート。混雑や飢餓の影響インスリンは、ワーム22におけるシグナリング、およびインスリンシグナル伝達は、ERK 12活性を調節します。したがって、飢餓や超満員のプレートからワームは、変数と困難な再現染色パターンになります。 </li></ol>生殖腺を得るための成虫の2解剖<ol><li> 150 WT（N2）または所望の特定の発達段階でのワームの所望の遺伝子型のM9緩衝液100μL中に1.5 mLのマイクロ遠心チューブに- 100ピック（L1、L2、L3、L4、大人、 など 。）。 </li><li> M9バッファー900μLでマイクロチューブを埋める（ 材料表を参照してください）。周囲温度で1分間微量1,000×gでチューブを遠心。 </li><li>静かにM9バッファー900μLを除去し、廃棄します。ワームが誤って削除されないことを保証するために解剖顕微鏡下でバッファを削除してください。 </li><li>各バッファ時間新鮮なM9と2.3 2回以上 - を繰り返して、2.2を繰り返します。これはワームに持ち越された任意の細菌を効果的に洗い流されることを保証します。 </li><li>最終洗浄後、チューブからM9バッファー900μLを除去し、廃棄します。 </li><li>平底ガラス製時計皿に200μL、マイクロピペットチップで150ワーム - 100を含む残りの100μLM9のバッファを転送します。マイクロピペットチップは、使用前に10μLマークで切断されていることを確認してください。先端を切断しないと、ワームのせん断になります。 </li><li> M9バッファーでワームを含むガラスの時計皿に0.1 Mレバミゾールの3μL - 1を追加します。ゆっくりワームは移動を停止するまで混合しても有効にするためにレバミゾールとM9を旋回。 注：レバミゾールストックを長期保存のために-20℃で保存することができます。動物における移動度の急速な損失を得るために、レバミゾールの0.25mMの- 0.2の文献23に記載されているものよりも3mMの-ここでは、1のより高い濃度を使用します。動物はあまりにリットルの周りフレイ場合オング液体懸濁液に、生殖腺におけるdpERKの結果として得られるパターンは、（応力または栄養または両方の不足のために）変数にすることができます。解剖のために3mmのレバミゾール - より再現性の染色パターンは、1で達成されています。 </li><li> 2 1 mLのシリンジに2 25 G針を取り付け（注射器の大きさは重要ではありません、針のゲージは非常に重要です）。それぞれの手で1位のシリンジ（ 図2）。 </li><li> 図2に示すように、解剖顕微鏡下で、下で各ワーム上で各針を置き、はさみのような動きで二咽頭電球の近くにワームに細かいカットを配置します。シャーレ内のすべての動物が少なくとも1回切断されるまで、ワームで1カットした後、次の動物に移動します。 注：手順2.8ことを注意して - 2.9時間に敏感です。再現性のdpERKパターンのための5分の下に皿の中のすべてのワームを解剖。長い解剖時間が特にZで、dpERK信号のオフにすることになります1 1.割り当てられた時間枠内にとどまることを解剖（ すなわち 、50ワーム対 150）、必要に応じてのラウンドあたりのワームの数を調整します。 <ol><li>場合に押し出された生殖腺は、解剖時に表示されていない、同じ動物内の別のカットを行わないでください。通常、それは唯一の動物を剪断し、生殖腺の押し出しにはなりません。代わりに、次の動物に移動します。生殖腺が押し出していないワームは、セクション6に説明すると、撮影時に無視することができ、スライド上のような表示されます。 注：解剖および処理工程の全てを通じ、それは生殖腺が体/カーカスに付着したままになります念頭に置くことが重要です。生殖腺と離れて針で体を強制しないでください。体から生殖腺を切断しようとする試みで、しばしば生殖腺組織における異常な涙は、スプリアス抗体シグナルをもたらすことができます。ボディ/カーカスは、撮像ステップ（セクション6）の間に無視することができ、かつ唯一の生殖腺を画像化しました。さらに、ソム腸の細胞は、抗体のための内部統制/体細胞のコントロールがアッセイされるとしての役割を果たすことができるetimes。 </li></ol></li></ol> 3.生殖腺固定<ol><li>解剖が完了した後、M9の100μLを含むガラス時計皿や解剖動物に直接、3％パラホルムアルデヒド（PFA）の2ミリリットルを追加し、パラフィルムでカバーしています。化学ヒュームフードで覆われた時計ガラス皿を置きます。 注意：PFAは、危険な化学物質です。従って、固定は、化学ヒュームフード内で行われるべきです。 </li><li>室温で10分間インキュベートします。 </li><li>使い捨て9「ガラスパスツールピペットを使用して、解剖した動物を含む時計ガラス皿に3 mLの1×PBS-T（参照材料表 ）を追加します。ミックスをパスツールに解剖動物とPFA溶液および1×PBS-Tを描くことによってピペットとバック時計ガラス皿に静かに放出される。洗浄の間にチューブをボルテックスしないでください。 </li><li> FREを使用しましたshのガラスパスツールピペットは、パスツールピペットに時計ガラス皿から液体の5mLの（解剖ワームを含む、PFAおよび1×PBS-T）を描画し、新鮮な5mLのガラス製コニカルチューブに内容を転送します。 </li><li>遠心分離機千×gでの臨床遠心分離機で30秒間コニカルチューブ。解剖生殖腺がプラスチックに固執するように、ガラスパスツールピペットとコニカルチューブを使用してください。 </li><li>解剖の動物を邪魔しないように注意しながら、上清を除去し、廃棄します。解剖生殖腺に影響を与えないように、解剖顕微鏡下での円錐管から各洗浄後に液体を削除し、その損失を最小限に抑えます。 </li><li>新鮮なパスツールピペットを使用して、コニカルチューブに1×PBS-Tの5 mLを加え。遠心分離機千x gで30秒のための臨床遠心分離機で円錐管。解剖の動物を邪魔しないように注意しながら、上清を除去し、廃棄します。 </li><li> 3回の合計を繰り返し手順3.7。 </li><li>新たなパスツールピペットを使用して、100％の2 mLを加えチューブにメタノール、ゆっくりパスツールピペットに引き上げることにより、メタノールで生殖腺を混ぜます。最低1時間-20℃でチューブをインキュベートします。 注：解剖生殖腺はdpERK染色の場合は最大2日間メタノール中で保存することができます。以上の2日間、2週間までのストレージはなく、dpERK抗体と、抗ラミン抗体などの他の抗体染色のアプリケーションと互換性があります。 </li><li>希望のインキュベーション時間の後、生殖腺を洗浄するために3回の合計のためのステップ3.7を繰り返します。洗浄液中にチューブをボルテックスしないでください。最終洗浄後5 mLコニカルチューブに1×PBS-Tの500μLを残します。 </li><li>新たなパスツールピペットを使用して新鮮な1mLのガラス管（×50から6mm mm）の中に円錐形のガラス管の内容物を移します。 10分 - 解剖動物は5のために、重力によって解決することができます。 </li><li>新鮮なパスツールピペットを使用し、解剖顕微鏡下で、1 mLのガラス管のウィットから可能な洗浄の限りを削除解剖生殖腺を乱すハウト。 </li></ol> 4.ブロッキングと一次抗体治療<ol><li> 1 mLのガラスチューブ内の解剖動物に1×PBS-Tで希釈した30％正常ヤギ血清（NGS）（ 材料表を参照）の100μLを加えます。 30％NGSは、ブロッキングバッファーとして機能します。液体の蒸発を回避するために、パラフィルムでチューブをカバーしています。 1時間または4℃で一晩室温でインキュベートします。 </li><li>インキュベーションの所望の期間が経過した後、できるだけ多くの液体を除去、新鮮なパスツールピペットを用いてブロッキング緩衝液を除去します。生殖腺をパスツールピペットでアップ描かれていないことを確認するために解剖顕微鏡を使用してください。 </li><li> 30％NGSで400：1で（dpERKとして、この方法で参照される材料の表を参照してください）MAPKYT抗体を希釈します。チューブあたり100μLを使用するのに十分な抗体希釈を準備します。未使用の、希釈した抗体は、週に4℃で保存することができます。 </li><li>そのように希釈した抗dpERK抗体の100μLを追加解剖した動物を含む1mLのガラス管にリューション。パラフィルムでチューブを密封します。 4°Cで一晩チューブをインキュベートします。 </li><li>一晩インキュベーションした後、室温で試験管に1×PBSTの800μLを追加します。 </li><li>新鮮なガラスパスツールピペットでサンプルを描画し、生殖腺が均等に1×PBS-T中に懸濁されることを保証するためにそっと放し。生殖腺が重力で底に沈殿してみましょう。上清を取り除きます。これは、解剖生殖腺を洗浄したが、プロセス中に損傷されないようにします。 </li><li>合計3回の洗浄のための4.6 - を繰り返して、4.5を繰り返します。洗浄液中にチューブをボルテックスしないでください。 3回目の洗浄後解剖動物を乱すことなく、できるだけ多くの上清を除去し、廃棄してください。新鮮なパスツールピペットを毎回使用されていることを確認してください。 </li></ol> 5.二次抗体治療<ol><li>一次抗体の間、洗浄は二次抗体のための希釈液を準備します。抗マウスSEを希釈1でcondary抗体：30％NGSで500。一次抗体と同様に、チューブあたり100μLを使用します。未使用の抗体は、週に4℃で保存することができます。 </li><li>解剖の動物を含む1 mLのガラス管に100μLの二次抗体溶液を追加します。パラフィルムで各チューブをカバーし、その後、暗闇の中で、管の内容物を維持するためにアルミホイルでチューブを包みます。 2時間、室温で管をインキュベートし、あるいは4℃で一晩。 </li><li>インキュベーションの所望の期間が経過した後、チューブに1×PBS-Tの800μLを追加し、繰り返しは4.5手順 - 3回の合計4.6。最終洗浄後、新鮮なパスツールピペットを用いて、解剖顕微鏡下で可能な限り上清をできるだけ多く除去し、廃棄します。 </li><li>二次抗体のための洗浄中にDAPI溶液を調製します。 1×PBST 1mLのIN-（-20℃で保存の1mg / mLのの1,000倍ストックから）DAPIの1μLに希釈します。 </li><li>含有するチューブに希釈したDAPI溶液を800μLを追加解剖した動物。パラフィルムでチューブの口を覆い、アルミ箔で各チューブを包みます。 RTで20分間インキュベートします。 </li><li>解剖の動物を邪魔しないように、DAPIとのインキュベーションの後、解剖顕微鏡下で、新鮮なパスツールピペットでできるだけDAPIソリューションの多くを削除します。 </li><li>チューブに取り付け、溶液の1滴を追加します。アルミ箔で各チューブを包みます。 注：dpERK染色を可視化するために、染色された生殖腺は直ちに顕微鏡検査のためにマウントする必要があります。このようなリン酸化セリン10ヒストンH3などの他の抗体の用途については、生殖腺は、暗所で4℃で最大2週間、培地を取り付けるに保つことができます。 </li></ol> 6.スライドとイメージングの組み立て<ol><li> 図3に見られるように、2つのガラス顕微鏡スライド（25ミリメートル×75ミリメートル×1ミリメートル）の、上に、長さ方向ラボテープの層を配置します。2テーピングスライド間で新鮮なクリーンなガラス顕微鏡スライドを置きます。 注：厚さテープの真ん中のスライド上のアガロースパッドを生成するのに役立ちます。テープは、アガロースパッドを作成するためのスペーサとして機能するようにアガロースパッドの厚さは、テープとほぼ同等です。 </li><li>途中で顕微鏡スライド上にドロップ溶融した2％アガロースの〜200μL（蒸留水で作られました）。迅速アガロース、に垂直な上に、新鮮なきれいなスライドを配置します。 </li><li> （ - 2分1）アガロースが固化してみましょう。 </li><li>アガロースパッドが破壊されないように、非常に軽くトップ顕微鏡スライドを削除します。アガロースパッドは、上下どちらのスライドに付着したまますることができます。アガロースパッドは限りそれはアガロースの滑らかな表面であるように付着したままスライドしている問題ではありません。 </li><li>パスツールピペットを使用してアガロースのパッド上に解剖した動物を移します。解剖顕微鏡下でパスツールピペットを用いてスライドから余分な液体を除去します。 </li><li>まつげの毛または細かく描かれたキャピラリーを用いて、生殖腺と腸Aをプッシュスライド上に生殖腺を広げるために、互いに方法。 </li><li> 24ミリメートル×50mmのサイズのカバーガラスと顕微鏡スライドをカバーしています。カバースリップをカバースリップとスライドの間に形成されている最小の気泡でスライド上に静かに下げられることを保証するために注意してください。 </li><li>過剰な液体が蒸発すると、生殖腺が（による生殖腺に対するカバーガラスの重量に）やや偏平になることを可能にするスライドボックス中で一晩4℃で保存（平らにスライドを使って、不透明なスライドボックス、アップカバースリップ）。生殖腺のわずかな平坦化は、そうでなければ、ラウンド性腺管の優れたイメージングを可能にします。 <ol><li>カバーガラスがマウントされると、指でカバースリップの上部に圧力を適用しません。多くの場合、これは生殖腺とdpERK信号の損失の歪みが生じます。 </li><li>唯一のより効果的なイメージングのために一晩生殖腺を平らに。スライドは、すぐに彼らが組み立てられていると見ることができる状態になります。すぐに画像を撮るために、穏やかに吸収カバーガラスとクリーンラボ組織を使用して、コーナーからのスライドの間に過剰な液体。 </li></ol></li><li>一晩の期間の後、カバースリップとスライド境界の四隅に透明なマニキュアトップコート付きスライドとカバーガラスをシール。マニキュア/カバースリップシールはカバーガラスは、撮像しながら移動していないことを保証し、サンプルの破壊から保護します。 </li><li>画像63Xでの化合物の顕微鏡による生殖腺。しかし、対物レンズと顕微鏡は顕微鏡やユーザアプリケーションの可用性に基づいて変化させることができます。卵母細胞の増殖領域から全体の生殖腺の大きさが一つの画像内に捕捉することができるよりも大きいので、 図4。11-14、18に示すように 、画像が重複する境界とモンタージュとして取られます。 <ol><li>多くの場合、限りは大きな変化は、生殖細胞系列の画像に行われないように、最終的なイメージングおよび組立後に死体を編集します。ストアトン「前」組立/編集や画像の組立/編集」の後」の比較を可能にするために組み立てられた画像に沿って彼の生の画像。 注：顕微鏡画像は、モンタージュの組み立て中に信号強度または飽和に変更することはできません。 </li></ol></li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptionally+repressed+germ+cells+lack+a+subpopulation+of+phosphorylated+RNA+polymerase+II+in+early+embryos+of+Caenorhabditis+elegans+and+Drosophila+melanogaster.">Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster.</a> Development. 124, 2191-2201 (1997).</li></ol>

The authors declared that no competing interests exist.

アクティブERK（dpERK）はCのステレオタイプの空間的および動的局在パターンを次のエレガンス生殖細胞系列。大人C.で、このステレオタイプdpERK空間パターン（ 図5）、および振幅エレガンスの性腺には、効果的にERKの調整多くの生物学的プロセスと相関させることができます。ゾーンで減数分裂の前期における卵母細胞で逮捕中2の結果、精子を指定していない、したがって、成熟した卵母細胞（ 図5）におけるERKを活性化しない女性の生殖系列で観察された表現型をERKを活性化させる。例えば、できないこと。卵成熟と排卵の発症に結合された女性の生殖系列11,13、中ゾーン2でdpERKの効果的な蓄積の男性」の結果と交配。したがって、空間パターンと（例えば、RNA干渉を介した遺伝子不活性化など）特定の遺伝的摂動または化学的処理の際にdpERKの一時的な活性化の分析はのRegu因子の同定を可能にします後半ERKシグナル、したがってERK依存する生物学的プロセス。このような分析はまた、シグナル伝達経路間の小説の遺伝的相互作用の発見を可能にします。 任意の画像ベースの分析のための重要なボトルネックは、アプリケーションに特異的な抗体等の機能性試薬の可用性です。そのような試薬は、次に存在する場合、このような上記のものなどの方法を容易に目的の任意のタンパク質のための局在化パターンの分析のために適合させることができます。アプリケーションは、このような機能抗体の利用可能性によって制限されます。この方法は、所定の発生時に解剖し、染色を記述しているのでさらに、それだけで1時間枠内の情報の取り込みを可能にし、リアルタイムまたはタンパク質の代謝回転率のダイナミクスやタンパク質調節に光を当てるしません。 上記の方法は、フランシスらから適応される。23、Seydouxとダンメートルとは区別されます生殖腺の押出および抗体染色のために24を ethod。フランシスらに基づく方法は 、「懸濁法」と呼ぶことにするとSeydouxとダンの方法は、比較のための&quot;メソッドをクラッキング凍結」と呼ばれます。懸濁法は、本質的に過酷な取り扱い条件に対してより敏感であるようなdpERKなどのシグナル伝達分子の再現性の局在パターンを得るために私たちの手で非常に有効でした。 dpERKローカリゼーションの場合には、私たちの経験では、ゾーン1内の信号は、凍結割れの方法と実質検出不可能です。さらに、多くの場合、凍結割れの方法で発生する可能性がある試料乾燥、スプリアス抗体シグナルの結果。生殖腺は、プロセス全体を通して、液体中に懸濁されているので、懸濁法は、試料の乾燥を最小限に抑えます。我々は、懸濁法は、単一のスライド上に複数の異なる遺伝子型を撮像するために有用であることも見つけます。例えば、雌雄同体のような場合は2つの遺伝子型、 対女性は直接dpERKのローカライズのために比較される、2つの遺伝子型を混合して処理することができます。表現型は別個であり、DAPIの形態を介して識別することができるので、これは可能です。同じスライド上のイメージングに続いて同じチューブ内染色は、異なる遺伝子型から生殖腺間の直接比較を可能にします。 DAPIの形態が識別可能でない場合あるいは、2つの段階の抗体染色を採用することができます。まず、各個々の遺伝子型は、二つの異なる抗体、変異体について、WTおよび抗体Bのための抗体A（両方の抗体がdpERKの抗体とは異なるホストに上昇させる必要がある）で処理されています。 2つの遺伝子型は、一次抗体で染色し、洗浄された後、それらは、1つのチューブ中で一緒に混合することができ、現在チューブ内の全ての抗体を可視化するために二次抗体を処理することにより、dpERK抗体で染色しました。単一のスライド上の異なる遺伝子型を比較す​​る能力、特にときD活性化パターンのeductionsは、明確な染色条件の影響を受けない正確な解釈を確実に行われています。 有利な一方で、慎重な操作を必要と懸濁法全体の複数のステップがあります。解剖は時間効率的な方法で発生することが重要です。重要なのは、切開は、5分間にわたって服用してはいけません。長い解剖時間は、多くの場合、ERKの活性化における規制の変化、としてではなく、技術的な障害と誤解されることができる可変dpERK信号をもたらします。様々な洗浄を通じて生殖腺が簡単に分注誤差による管から失われる可能性がステップため、各解剖のための150の動物 - 100以上で開始することが重要です。生殖腺の損失がいずれかの複数の小さなバッチで解剖することによって低減することが可能に組み合わせることができる（例えば50匹ずつの3つのバッチとして）、または150の一つの大きなバッチを解剖することにより、別の課題は、十分に間隔をあけにあると生殖腺を得ています形成スライド上全体遠位生殖腺を画像化することができるようになっています。これを有効にするには、マッチ棒上まつげや性腺外空間へ引っ張らピペットを使用しています。このプロセスの間に生殖腺を損傷しないようにしかし、注意が必要です。多くの場合、これらの技術では、スライド上に複数の解剖を習得しようとする試みと同様に生殖腺の配置をとります。 この技術は、習得された後、それは多様な生物学的分析のための強力な方法として機能し、単にdpERKレベル以上を研究するために使用することができます。例えば、この方法は、活性p38のレベル、または活性なCDKレベル、または抗体試薬が存在する任意のタンパク質を可視化するために使用することができます。さらに、この方法は、dpERKレベルについてのアッセイを経由して 、経路の新規阻害剤または活性化をアッセイするために動物全体での化学阻害画面と結合することができます。これは、int型があり、任意の阻害剤に対する反応性と感度の両方の生体内における読み出しを可能にしますRTK-RAS-ERKシグナル伝達経路とeract。また、この方法は、すべての使用と同時に可視化することができる複数の信号出力を持つ抗体を組み合わせて使用​​することができます。複数の抗体を使用して、複数の経路との間の相関を可能にするそれらの活性化状態、およびすべて同じ組織内の成果、これらの相互作用のより良い理解を可能にします。これらはこの方法の更なる用途のほんの一例であるが、このシステムは、複数の研究対象を研究するために修飾することができます。

受容体チロシンキナーゼ（RTK）-RAt肉腫（RAS）-Extracellular信号調節キナーゼ（ERK）経路は、ERK 1-3のリン酸化および活性化をもたらす保存されたキナーゼカスケードを介して細胞外の信号を中継します。 ERKタンパク質は、保存されたプロリン指向性セリン/スレオニンMAP（マイトジェン活性化タンパク質）キナーゼファミリーのメンバーであり、直接保存さTEYモチーフのトレオニン（T）及びチロシン（Y）上の二重リン酸化を介して、MEKによって活性化されます。 （二リン酸化ERK、またはdpERKとも呼ばれる）アクティブERKは、その後、下流基質1-3の電池のそのリン酸化を介して、多くの細胞や発達過程を調節します。このように異常なERK活性は、多くの細胞や発達障害4-7につながります。 ERK活性の厳しい規制は正常な発達のために重要である：哺乳動物系であまりにも多くのERKの活性が過剰な細胞増殖リーディングにつながります発癌性成長へ。過少活性は細胞死4,6に至ります。さらに、ERK活性の持続時間の変化はまた、異なる結果をもたらすことができる：PC12細胞で、30分以下誘導する細胞増殖のためのERKの活性化が、60分以上ERKの活性化は、神経分化8,9を誘導します 。 ERK活性の厳しい規制は、このように正常な発達と恒常性のために明らかに必須です。 C.エレガンスは、RTK-RAS-ERKシグナル伝達経路3,10-15の機能と規制を分析するための強力な、そして遺伝的に可鍛性モデル系です。 RASおよびERK、Cの複数の遺伝子が含まれている哺乳動物系への相対この経路3,10-14の機能を分析するには、遺伝的に、より容易なシステムを、それをレンダリング、 - エレガンスは、1 RAS遺伝子（ せ-60）と1つのERK遺伝子（1 MPK）が含まれています。 C.エレガンスの生殖細胞系は、本質的に、有糸分裂で構成されてい管でありますその近位端部（ 図1）16にその遠位端部での細胞および成熟した卵母細胞を生じます。生殖細胞は、彼らが最終的に、近位領域16に卵成熟を受けて、ループ領域に卵母細胞を形成し始める後、遠位分裂ゾーンのすぐ近位減数分裂を開始し、拡張減数分裂前期（太糸期）を経て進行。 私たち自身を含む複数の研究室からの遺伝学的研究は、RTK-RAS-ERK経路は、Cの生殖系列発達に不可欠であることを示していますエレガンス 12,13,15,17-19。具体的には、そのERKコントロールを発見し、そのような卵母細胞の成長11,18のような生物学的プロセスをセルにこのような生殖細胞のアポトーシスなどの発達のスイッチに至るまで、生殖細胞系の開発中に、少なくとも9の異なる生物学的プロセスを調整します。多くの哺乳動物系、Cであまりにも多くのERK活性のようなあまりにも李ながら、複数の小さな卵母細胞の生産に生殖細胞系列結果エレガンス一つの大きな卵母細胞11内ttle活動実績。したがってdpERKの厳しい規制は、通常の生殖系列発達に不可欠です。 dpERK半ば太糸期の間に高いです（ ゾーン1、図1）、ループ領域における低および高再び成熟中：ERKの活性型は、dpERKに特異的な抗体によって可視化されるように、ステレオタイプ、ダイナミック、二峰性の局在パターンを表示します卵母細胞（ ゾーン2、図1）。最近、我々は、栄養ゾーン1 12でERKを活性化するためにインスリン様成長因子受容体1（DAF-2）を介して作用することを見出しました。従来の研究は、（エフリン受容体チロシンキナーゼを介して ）精子信号はゾーン2 13でERKを活性化することが示されました。 卵母細胞の成長、空間的および時間的局在化、ならびにdpERKの振幅を調節するための生殖細胞系列における可変抵抗器のような活性ERK機能することを考えると、その正常なシグナル伝達の結果を理解する鍵です。の変化をここで記載された方法を用いてdpERKのステレオタイプの局在化が容易に監視することができ、予測はERK活性て、関数への環境や遺伝的摂動の影響に導出しました。したがって、dpE​​RKについてのアッセイは、生殖系列発達の間の役割の包括的な理解を可能にします。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Inc.</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td style="width:255px;">Dissolve 2 g in 100 ml to make the 2% agarose</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Flat bottom glass watch dish</td>
			<td style="width:159px;">Agar Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AGL4161</td>
			<td style="width:255px;">We use glass, because dissected gonads often stick to plastic</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">25 gauge needles</td>
			<td style="width:159px;">BD PrecisionGlide</td>
			<td style="width:119px;">305122</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Syringes (could be 1 or 5 ml)</td>
			<td style="width:159px;">BD Syringes</td>
			<td style="width:119px;">1 ml: BD 309659</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope slides (25mm x 75mm x 1.0mm)</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-343</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Coverslips (24x50mm)</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">2935-245</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">5ml glass conical tube</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">8060-5</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">9&#34; disposable Pasteur pipette</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">13-678-20D</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Clinical bench top centrifuge</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glass&#160; tubes (6x50mm)</td>
			<td style="width:159px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">14-958-A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">*M9 solution</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9756</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">3% Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:159px;">Electron microscopy services</td>
			<td style="width:119px;">17500</td>
			<td style="width:255px;">Obtained as 16% solutions in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">**PBS</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">1X PBST</td>
			<td style="width:159px;">1X PBS with 0.1% Tween 20&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:159px;">Electron microscopy services</td>
			<td>18510</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Normal goat serum (NGS)</td>
			<td style="width:159px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:119px;">5425</td>
			<td style="width:255px;">Diluted to 30% in 1x PBST</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">MAPKYT (dpERK) antibody&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Inc.</td>
			<td style="width:119px;">M9692</td>
			<td style="width:255px;">Dilution 1:400 in 30% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Secondary antibody</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11005</td>
			<td style="width:255px;">Dilution 1:500 in 30% NGS</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D9542</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Vectashield</td>
			<td style="width:159px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">*M9 Buffer Recipe</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">**PBS (1X)</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2.2H2O, 0.10 g MgCl2.6H2O, H2O to 1 litre</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">Nematode Growth Medium (NGM)</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 minutes. Cool, and add 1 mL of 1M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1M MgSO4 and 25 mL of 1M KPO4.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial and temporal analysis of active erk in the c. elegans germline

RTK-RAS-ERK経路を伝達する進化的に保存された細胞外シグナルは、主にERK、経路の末端キナーゼの活性化を介して複数の細胞と発生過程を制御する重要なキナーゼシグナル伝達カスケードです。 ERK活性の厳しい規制は、正常な発達と恒常性に不可欠です。過剰な細胞増殖における過度に積極的なERKの結果、不活発ERKは、細胞死を引き起こすながら。C.エレガンスは、開発中にRTK-RAS-ERKシグナル伝達経路の機能および調節を特徴づける助けた強力なモデル系です。具体的には、RTK-RAS-ERK経路は、Cのために不可欠ですこの方法の焦点である生殖系列発達をエレガンス 。ERK（dpERK）の活性、二リン酸化形態に特異的な抗体を使用して、ステレオタイプの局在パターンは、生殖細胞系内で可視化することができます。このパターンは、空間的及び時間的にcontrollあるのでedは、再現性dpERKを分析する能力はdpERK信号継続時間と振幅ので、生殖系列発達に影響を与える経路の調節因子を同定するために有用です。ここでは、Cの範囲内に成功し、汚れを分析する方法を示し、および画像dpERK エレガンス生殖腺。この方法は、Cの任意のシグナルまたは構造タンパク質の空間的局在性に適合させることができますエレガンス生殖腺は、免疫蛍光との互換性抗体が入手可能です提供しました。

WT成体雌雄同体の動物では、dpERKは、典型的には、中間太糸期領域で、ゾーン1、最も成熟したから-1を介し卵母-4 -5（ゾーン2）で可視化されます。この活性化パターンにおける摂動は、シグナル伝達経路の変更を反映します。女性の生殖系列は精子を指定していない、したがって、これらの図5に表されているゾーン1内の唯一の弱い活性化と、ゾーン2にERKの活性化は表示されません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig1.jpg" /> 図1：C.エレガンス生殖細胞系形態。白線で概説1つのU字型の生殖腺アームを持つ大人の雌雄同体の微分干渉コントラスト（DIC）画像。大人雌雄同体生殖腺は、遠位先端部に有糸分裂細胞が含まれています。有糸分裂細胞が減数分裂前期（太糸期）maturに発展を通じて減数分裂と進捗状況を入力してください近位の生殖腺の電子卵母細胞。大人の雌雄同体生殖腺におけるdpERKのゾーン1とゾーン2マークステレオタイプのローカライズ。スケール：20μmで<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig1large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig2.jpg" /> 図2：解剖時の針位置の実証左 ：プロセスにおける解剖の写真。右：ワームを参照して、針位置<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig3.jpg" /> 図3：アガローススライド準備のデモンストレーション。 （A）テープlengthwisを配置2清潔な顕微鏡スライドを横切って電子。示すようにテープで2つのスライドの間に新鮮なきれいな顕微鏡スライドを配置します。 3スライドを縦に隣接している。（B）センター内のスライドにアガロース溶融追加します。（C）は 、アガロースの低下を運ぶ、へ、および中間スライドの上に垂直に新鮮な顕微鏡スライドを配置します。（ D）アガロースが固化することを許可する。（E）固化したアガロースパッドを残してトップのスライドを削除します。解剖し、染色された生殖系列を実装するためのアガロースパッドと底面のスライドを使用してください。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig4.jpg" /> 図4：DAPI（ トンと野生型の生殖細胞系列のモンタージュモンタージュとしてスライドをイメージングオペアンプ）とdpERK（ 下 ）チャンネル。各パネルのためのパネルBおよびCザDAPIとdpERK画像用パネルAとBと緑のボックスの境界、白い箱を重ねて63Xで撮影された画像は、二つの異なるチャネルで同時に採取しました。組み立てられた画像は図5Aに示されています。スケールバー：20μmで<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig4large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54901/54901fig5.jpg" /> 図5：ERKの動的空間的/時間的活性化。 DNA（白B、DAPI、）とdpERKについて染色（AC）WT（N2）成人（開発の24時間過去の中期L4ステージ）両性の生殖系列（C、赤）。ゾーン1、太糸期領域、およびゾーン2、成熟した卵母細胞におけるdpERK信号がハイライト表示されます。（DF）を霧-2（oz40）女性の生殖系列DNA（E、DAPI）とdpERK（F）について染色した（8時間発展の過去の中期L4段階で）。若い女性の生殖系列は、ゾーン1内、および精子に依存しない方法で、単一の卵母細胞に弱いdpERKを表示します。ゾーン2は、精子に依存する、と女性の生殖細胞系列でこのように存在しません。スケールバー：20μmで<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54901/54901fig5large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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C. elegans 生殖系列における活性型 ERK の空間的および時間的解析 |発生生物学 |ビデオ

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

我々は、解剖CのアクティブなERKの空間的および時間的局在化のための免疫蛍光イメージングベースの方法を提示しますエレガンス生殖腺。ここで説明するプロトコルは、Cの任意のシグナルまたは構造タンパク質の可視化のために適合させることができますエレガンス生殖腺は、適切な抗体試薬は入手可能です提供しました。

で活躍ERKの時空間解析<em&gt; C。エレガンス</em&gt;生殖細胞系列

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

spatial-and-temporal-analysis-of-active-erk-in-the-c-elegans-germline

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JoVE Core

JoVE Journal

Biology

Developmental Biology

Genetics

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Meiosis

SCIENTISTS IN ACTION

10.1K ビュー.  Baylor College of Medicine. 我々は、解剖CのアクティブなERKの空間的および時間的局在化のための免疫蛍光イメージングベースの方法を提示しますエレガンス生殖腺。ここで説明するプロトコルは、Cの任意のシグナルまたは構造タンパク質の可視化のために適合させることができますエレガンス生殖腺は、適切な抗体試薬は入手可能です提供しました。 

ビデオ: Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the field of environmental health. This is due in part to the paucity of model systems that can (1) accurately recapitulate keys features of reproductive processes and (2) do so in a medium- to high-throughput fashion, without the need for a high number of vertebrate animals.
We describe here an assay in the nematode C. elegans that allows the rapid identification of germline toxicants by monitoring the induction of aneuploid embryos. By making use of a GFP reporter line, errors in chromosome segregation resulting from germline disruption are easily visualized and quantified by automated fluorescence microscopy. Thus the screening of a particular set of compounds for its toxicity can be performed in a 96- to 384-well plate format in a matter of days. Secondary analysis of positive hits can be performed to determine whether the chromosome abnormalities originated from meiotic disruption or from early embryonic chromosome segregation errors. Altogether, this assay represents a fast first-pass strategy for the rapid assessment of germline dysfunction following chemical exposure.

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.

線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

発生生物学

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

胚性メッケル軟骨でZebrabowクローン細胞分析によって軟骨細胞のインターカレーションと方向性増殖の可視化

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

詳細な空間式マップからダイナミック発現データの時間的順序

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

細胞間腔の形態形成と単一細胞レベルでのIn Vivo偏光膜生合成のためのモデルとして線虫腸: 抗体の汚損、RNAi 損失の機能解析、イメージングによるラベリング

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

核の分布、蛋白質および細胞骨格を研究する線虫生殖細胞の解析

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

チミジン アナログ エドゥと線虫の生殖における細胞周期解析

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...