我々は、貴重な提案をバーバラカルレッティとアンナマリーケニーに感謝します。 、DK07328：HYLはトレーニンググラント&quot;生化学分子生物学ホルモン&quot;によってサポートされています。 NIHの助成金5R01 NS16951（CAM）によって部分的にサポート。

パート1：（ビデオで示されていません）（解剖前に1〜2日）の設定<ol><li>培養液とメディアを準備： <ul><li> 4X CMF - PBS - EDTA（パーコールの希釈のためのカルシウムとマグネシウムのフリーリン酸緩衝生理食塩水- EDTA）：リットルは、32グラムのNaCl、1.2グラムのKCl、8 gのグルコース、2グラムのNaH 2 PO 4、1gのKH 2 POを追加する4、8 mLの2％のNaHCO 3の株式、脱イオン/蒸留水に10ミリリットル1MのEDTA（pH8.0）。 1リットルと7.4のpHに音量を調整します。滅菌フィルタします。 </li><li> HBSS -グルコース：カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクスバランス塩溶液（HBSS）および滅菌フィルターにグルコース（6グラム/リットル）を追加。 500mlを、最大ヶ月間4℃で保存することができる。 </li><li>培養培地：無血清培地（SFM）および10％FBS培地。 Neurobasal A -培地48 mlに500μlの100Xグルタミン私、500μlの100Xペニシリン - ストレプトマイシン（最終の100単位のペニシリン及び100μg/mlのストレプトマイシン）、6.25μlの2 M KClを（250、最終μM）に追加します。 9ミリリットルの2アリコートと40mlの分割。 10％FBS培地を準備するには、9 mlのアリコートに熱不活化FBSの1mlを加える。 SFMを準備するには、40mlのアリコートに無血清サプリメントB - 27の800μlを加える。滅菌濾過し、2週間の最大のために4℃で保存します。最良の結果がそれぞれの実験のために新鮮な培地を作るために。 </li></ul></li><li>パーコール希釈の準備： <ul><li>パーコールは液体として供給され、それは使用前に酸性化する必要があります。 pHが7.4に達するまで株式を準備するには、1〜2時間の期間にわたってパーコールソリューションに少しで1N塩酸を少し追加。あまりにも急速にHClを添加すると、集計にパーコールが発生します。 1N塩酸の約6.5ミリリットルはパーコールの各リットル必要とされる。滅菌濾過し、4℃で保存します。 </li><li> 35％、60％（体積：体積）パーコールの希釈は、Percoll勾配のステップで使用されます。 、パーコール株式の35または60 mlを入れた100ミリリットルパーコールの希釈液を調製4X CMF - PBS - EDTA及び蒸留25mlの/最後のボリュームにH2O脱イオン水。 60％のソリューションに青トルイジンの数滴を追加し、それはインタフェースと細胞を視覚化するのに役立ちます。滅菌濾過し、4℃で保存します。 </li><li>不十分なバッファリングが手順の実行中に増加し、細胞死の原因となるので、4X CMF - PBS - EDTAは、3ヶ月以上経過であってはならない。 </li></ul></li><li>はPREPARINGカバーガラス：ガラスカバースリップは、（最高のキャロライナ生物供給会社からの場合）、軽く攪拌しながら室温で一晩10％塩酸で洗浄deonized /蒸留水で十分にすすぎ、70％エタノールに格納されています。ご使用の前に、単一のカバースリップは火炎滅菌簡単にエタノールが蒸発するまで、裸火（ブンゼンバーナー）を介して鉗子でそれらを保持することによって。 12 mmのガラス製カバースリップを6ウェル培養プレートの4ウェル培養プレートと25 mmのカバースリップに配置することができます。 </li><li>基板とのコーティングの培養容器：それらは簡単に顕微鏡下で可視化するためのガラススライドにマウントすることができるので、免疫蛍光染色または薬物治療ガラス製カバースリップの方が適しています。 、文化のための解剖、ガラス製カバースリップまたはプラスチック製の皿が（500μg/ mlのポリ- D -リジンでコーティングされている必要があります前に、多数の細胞が蛋白質またはRNAサンプルを収集するために必要とされている場合、セルはプラスチック製の培養上dishes.The夜を培養することができます。 μL/ウェル、6ウェルプレートで800または350μl/ウェル、4ウェルプレート用）。 5 mgの/ポリ- D -リジンのmlのストック溶液は-20 ° C、その後、滅菌deonized /蒸留水及び使用前に滅菌濾過右に希釈に格納されています。培養容器は、（メッキ前または少なくとも2時間用）37℃で一晩インキュベートし、メッキ前に滅菌蒸留/ deonized水の右で2回洗浄する。 </li><li> PREPLATING皿を準備：これらの料理は、基板の低濃度に、より容易に付着するグリア汚染物質を除去するために文化の前に分離された小脳の細胞をあらかじめめっきに使用されます。コー​​トポリ- D -リジンの皿あたり4ミリリットル（100μg/ mlの、これは培養に使用される濃度の1 / 5です注）と2つの60 mmのプラスチック培養皿。 （または、少なくとも解剖前に2時間用）37℃で一晩インキュベートする。右解剖前に、滅菌水で二回皿を洗うとフードで乾燥させるため、ポリ- D -リジン溶液を取り除く。 </li><li>オートクレーブや解剖の日に解剖ツールを殺菌、20分間70％エタノールでツールを浸す。必要なツール：Permasetはさみ、microdissectingはさみ、4デュモン第5位解剖鉗子。 </li></ol>パート2：解剖（解剖の日）の準備 - （ビデオで示される） 断りのない限り次の手順のすべては、組織培養フードで実行されます。 <ol><li> 70％エタノールで解剖エリアを拭う。 ℃の水浴中でまたは5％CO 2、37℃インキュベーターで37メディアを温める。 </li><li>新しいパパイン解離システムキット（ワーシントン）起動時には、アルブミン、オボムコイド阻害剤の溶液を調製。 32ミリリットルを追加します。EBSS（アールの平衡塩類溶液、キットに付属）のアルブミン - オボムコイド阻害剤の混合物へと他のコンポーネントを準備中に内容が溶解することができます。最初の使用のための再構成、そして℃で2-8で残りの溶液を格納し、各キットによって許可fiveアイソレーションが完了するまで使用してください。 </li><li>解離キット（各バイアルは、生後5日目マウスの4から15小脳の解離のために十分である）から一パパインのバイアルにEBSS 5 mlを加える。パパインが完全に溶解し、溶液が透明に表示されるまで、5％CO 2、37℃インキュベーターまたは37 5〜10分間℃の水浴中にパパインバイアルを置きます。解剖時の室温でのソリューションを維持する。 </li><li>解離キットから一つのDNaseバイアルにEBSS 500μlを添加します。 DNaseはせん断変性に敏感であるため、バイアルをタップすることで静かに混和。パパイン（終濃度20単位/ mlパパイン、0.005％DNase処理である）を含むバイアルに、このソリューションの250μlを追加します。ステップ5.1または6.1で使用するために残りのDNaseバイアルを保存します。 </li></ol>パート3：解剖と髄膜の除去<ol><li> C57BL/6Jマウスから顆粒細胞培養のための最適な年齢は生後4-6、EGL peaks1、10の顆粒細胞の前駆細胞の数。です。子犬を一度に1つずつ細かく分析し、小脳解剖子犬あたり1 6より分に解剖の時間を短縮しようとすると慣れてくると。速度は非常に重要である。 Percoll勾配のステップがバイパスされている場合、8つの生後日 - 5仔マウスは、1つの6穴培養プレート（または6 25mmのカバースリップ）または6つの4 - ウェル培養プレート（または24 12の十分な細胞を得ることができます - mmのカバーガラス）。おおよその収率は、子犬とメッキ密度あたり4〜5x106細胞がcells/cm2 1〜5X105の範囲が可能です。 15〜20％の細胞はパーコールステップ4中に失われているので、より多くの動物が同じ所望の細胞密度を得るために必要とされる。 </li><li>ピペット滅菌ファルコン15 mlコニカルプラスチックのチューブに60 mmのプラスチック製組織培養皿と10 mlのHBSS -グルコース15mlの。氷上に置く。 </li><li>フードの外側に、70％エタノールで子犬の頭を拭いてください。子犬の首を切るためにPermasetのはさみを使用してください。 （断頭は、ビデオには表示されません。） </li><li>フードでは、あなたが明らかに頭蓋骨の背面を見ることができるようデュモンの鉗子で頭をホールド。大後頭孔にmicrodissectingはさみを挿入し、目に向かってまっすぐにカットすることで脳にアクセスします。皮離れて鉗子、スキンを使用して、脳を露出するために頭蓋骨を持ち上げる。デュモンの鉗子を用いて、小脳とその周辺の中脳をピンチオフし、HBSS -グルコースで皿に移す。 （これは、小脳を操作し、小脳がまだ周囲の組織に接続されている場合は髄膜を除去する方が簡単です）。 </li><li>解剖顕微鏡下で、静かに小脳から髄膜皮とまたプレートに小脳を固定するために他の鉗子を使用しながら、ある晴れたデュモン第5ピンセットで葉の間。あなたは、小脳の表面に血管がわか​​ります。これらの血管は、髄膜を識別するための良い方法です。小脳はマットホワイト外観を取るまで、髄膜を取り外します。中脳の残りの部分から小脳を区切ります。その腹側にそれを回し、腹側小脳と隣接する中脳の間に赤のリボンのような脈絡叢を、削除してください。早く解剖と氷上で15 mlのコニカルチューブに冷HBSS -グルコースの各小脳を置きます。 3脳を解剖した後新鮮なHBSS -グルコースに解剖ソリューションを変更します。 </li></ol>パート4：細胞懸濁液<ol><li>一度すべての解剖が終了している、チューブからHBSS -グルコースを除去し、ステップ2.4​​で作成したパパイン溶液と交換してください。このキットは小さな断片に組織を切断推奨していますが、我々はそれがこの歳で小脳をカットしたりミンチする必要がないことがわかります。 37℃の水浴または、5％CO 2 37 15〜20分間℃のインキュベーターで組織+パパイン溶液（15 mlコニカルチューブに）置きます。 4〜8小脳、37℃で15分間° Cで十分です。小脳、20〜30分の大きい数のために優れています。ゆっくりとチューブごとに3〜4分に撹拌。 </li><li> FBSでコーティングされている滅菌P1000エアロゾルのピペットチップとの混合物を砕いて粉にする。どんな空気の気泡の形成を防ぐために穏やかに、この手順を実行してください。火災研磨したガラスピペットが使用されていますが、我々は血清コーティングされた無菌P1000エアロゾルのヒントが同様に作用することに気付くことができます。二回使用直前に上下コートFBSとピペットチップ、ピペットFBSをに。ピペットで最大10程度とダウンの動きは、組織を解離するのに十分です。溶液は濁りになります。サスペンションは非常に解離していない組織の任意の大部分は、チューブの底に沈降することを30〜60秒間座ってすることができます。 </li><li> Bで解離していない組織片を削除しないように注意して浮遊細胞を（削除する血清コーティングされたピペットチップで新鮮な15 mlコニカルチューブにottom）。室温で5分間、約200xgで遠心分離します。再懸濁培地を準備します。これを行うには、滅菌チューブに再構成されたアルブミン-オボムコイド阻害剤溶液300μlで2.7ミリリットルEBSSを混ぜる。ステップ2.4​​からDNase溶液150μlを加え。 </li><li>遠心分離後、上清を廃棄し、すぐに血清コーティングP1000のエアロゾルピペットの先端で、ステップ4.3で作成した希薄化後のDNase /アルブミン阻害剤溶液で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>次のように不連続密度勾配を準備します。 15 mlコニカルチューブにアルブミン-オボムコイド阻害剤溶液5mlを追加。上に注意深く層細胞懸濁液。室温で6分間、約70xg間遠心する。チューブの下部に解離細胞ペレットは、膜断片は、インタフェースのまま。 </li><li>あなたが顆粒細胞に富む文化を取得したい場合は、Percoll勾配分離ステップを（小脳顆粒細胞の純粋な文化を表します）バイパス、およびパート6に進みます。あなたがさらにPercoll勾配分離によってグリアと大型介在から顆粒細胞を分離したい場合は、パート5に進みます。 Percoll勾配のステップの使用は、細胞の収率が低下します。私たちの手では、収量の減少は約20から35パーセントです。しかし、約90％から95〜99％の顆粒神経細胞と前駆細胞の濃縮の増加がある。 </li></ol>パート5：Percoll勾配分離<ol><li>上清を捨て、すぐにステップ2.4​​からのDNase50μlをHBSS -グルコース2mlにペレットを再懸濁します。重力によるナイロンメッシュ（孔径70μm以下）も、細胞懸濁液をフィルターします。このステップでは、大規模な非神経細胞を除去し、よりよい単一の細胞懸濁液のために提供されます。 </li><li> twoファイアーポリッシュガラスパスツールピペットを準備します。これを行うには、静かに炎ガラスピペットの先端をエッジが平滑化されるまでとピペットボアは元のサイズの40〜50％です。開口部が小さすぎるように注意してください。 </li><li> Percoll勾配を準備します。 50ミリリットル滅菌コニカルチューブに35％パーコール溶液の代わりに10ミリリットル。 60％パーコール（10ml）を添付滅菌脊髄針、10 mlの滅菌注射器にロードされます。脊髄針とチューブの底に60％溶液を加えて35重量％溶液を下にそっと層60％パーコールのソリューションを、。 2つの層の間のシャープな界面を維持するように注意してください。優しくインタフェースを妨げることなく、チューブの側面に沿ってそれらを追加、ファイアーポリッシュピペットを用いて勾配の上部にセルを追加します。 </li><li> 1800xgで遠心し、遠心でチューブを静かに置きます。それが目的の速度に達するまで約2分かかるように：スピード一歩ごとに20秒（約18、70、200、440、850、1100、1800xg速度の増分は次の通りです）に上昇。 1800xgに達すると10分にタイマーを開始します。終了したら、徐々に一歩ごとに20秒を短縮減少。 </li><li>グラデーションの左上インタフェースを（大グリア細胞、プルキンエ細胞、及び介在を含む）を取り外して廃棄します。 </li><li>慎重にファイアーポリッシュピペット及び50 mlコニカルチューブに移すと35％、60％パーコールの間のインターフェイスでセルを削除します。反転数回でHBSS -グルコースとミックスの3倍量に再懸濁します。 1100xgで5分間遠心分離します。 </li><li>上清を除去し、DNase50μlと10％FBS培地を4 ml加える。穏やかに、単一の細胞懸濁液を形成するためにファイアーポリッシュピペットを用いてペレットを再懸濁します。 6.2に進みます。 </li></ol>第6部：プレめっきおよびめっき<ol><li>上清を捨て、すぐにステップ2.4​​からのDNase50μlの10％FBS培地4 mlにペレットを再懸濁します。重力によるナイロンメッシュ（孔径70μm以下）も、細胞懸濁液をフィルターします。このステップでは、大規模な非神経細胞を除去し、よりよい単一の細胞懸濁液のために提供されます。 </li><li>プレートを5％CO 2、37℃インキュベーターで20分間ポリ- D -リジンコートしたプレメッキ皿上に回収した細胞。新鮮な料理を繰り返します。アストログリアと重い細胞が落ち着くと皿に付着し、小さな顆粒ニューロンとニューロンの前駆細胞をフローティング状態のままになります。インキュベーション後、ゆるく付着した顆粒ニューロンとニューロンの前駆細胞が簡単に外れているとプレートの穏やかなタッピングをほぐした。 </li><li> 5分間200xgで15 mlコニカルチューブと遠心分離機の顆粒ニューロンとニューロンの前駆細胞を収集する。無血清培地1mlにペレットを再懸濁し、血球計算盤を用いて10μlのアリコートを数える。 </li><li>所望の細胞密度に到達する無血清培地を追加。中密度のためのプレートに細胞数の大まかなガイドライン：6ウェルプレート、3.5から4000000セル用、4ウェルプレート用、65万細胞。 6ウェル培養プレートのため、私はプレート1.5ミリリットル/ウェル、4のためのよくPLATESは、私プレートを0.5ml /よく。細胞は、5％CO 2、37℃インキュベーター中で維持されます。後続の変更毎に2〜3日と24時間後に完全に培養液を交換する。 </li></ol>

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このプロトコルは、過去3,7,11に記載されている手順の変更に基づいています。以下に述べるように注意することは、いくつかの重要な点があります。 顆粒ニューロンおよび前駆細胞は、メッキの2時間以内に従っている。健康な細胞は位相差顕微鏡の4の下にある丸い形態を持っている。メッキ後24時間以内に、健康な細胞はカバースリップまたはプラスチック製のよく周りに均等に広が...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell strainer with 70&mu;m mesh pore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinal Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>405182</td>
<td>20G x 3-1/2 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine mol wt>300,000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. 
</td>
</tr>
<tr>
<td>Percoll</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-1644</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175-103</td>
<td>Must be calcium and magnesium free.</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal A-Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10888-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamax I supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Serum Free Supplement (50x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12-mm circle coverslips </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply</td>
<td>63-3029</td>
<td>These are made in Germany by Deckgluder.</td>
</tr>
<tr>
<td>25-mm circle coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply</td>
<td>63-3037</td>
<td>These are made in Germany by Deckgluder.</td>
</tr>
<tr>
<td>Papain Dissociation System </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
<td>LK 003150</td>
<td>Kit is good for five isolations.</td>
</tr>
<tr>
<td>Permaset scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS6782</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 (Dumostar)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS4978</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4-well culture dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140685</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons 

小脳皮質は神経細胞の特性と開発の1,2を研究するためのユニークな機会を提供するだけでなく説明する構造です。小脳ニューロンタイプ（顆粒細胞、プルキンエ細胞と抑制性介在）のうち、顆粒ニューロンは、これまでで最も多数あり、哺乳類の脳における神経細胞の中で最も豊富なタイプです。げっ歯類では、小脳顆粒ニューロンは小脳皮質、外顆粒層（EGL）の最外層の前駆細胞からの最初の二つの出生後の数週間の間に生成されます。ここで紹介するプロトコールは、豊かにする技術と文化の顆粒ニューロンと出生後のマウスの小脳からそれらの前駆細胞を説明します。我々は、顆粒ニューロン5,6に前駆細胞の増殖分化を研究するために使用することができます増やす純度3,4の文化を、取得する手順を説明します。一度前駆細胞が分化、文化はまた、シナプス形成、グルタミン酸受容体の機能7、他の精製された小脳細胞8,9または細胞死7との相互作用などの現象の実験的操作と特性評価のための顆粒神経細胞の均質な集団を提供しています。

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Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

ここでは、出生後のマウスから小脳顆粒ニューロン前駆細胞や小脳顆粒ニューロンを分離して培養する方法を提示する。

ポストナタールマウス小脳顆粒ニューロン前駆細胞と神経細胞の単離と培養

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

isolation-culture-post-natal-mouse-cerebellar-granule-neuron

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

28.4K ビュー.  Columbia University. ここでは、出生後のマウスから小脳顆粒ニューロン前駆細胞や小脳顆粒ニューロンを分離して培養する方法を提示する。

ビデオ: Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

生物学

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

鳥類胚弁膜前駆細胞の単離と培養

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

マウス胎児の腎臓の腎性帯からの細胞の単離と培養

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

ラット肝細胞の単離及び初代培養

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

A simple method to derive and maintain spermatogonial stem and progenitor cell lines from adult mice is presented here. The method utilizes feeder cells originating from the somatic cell compartment of the adult mouse testis. This technique is applicable to common mouse strains, including transgenic, knock-out, and knock-in mice.

長期成体マウスのSSCラインの導出のために文化の精原幹細胞や前駆細胞の濃縮シリアル（SSCS）

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

新生仔マウス心筋細胞の単離および培養

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...