Damos las gracias a Barbara Carletti y Anna Marie Kenney sugerencias invaluable. HYL el apoyo de la Formación Grant &quot;Hormonas: Bioquímica y Biología Molecular&quot;, DK07328. Apoyado en parte por el NIH subvención 5R01 NS16951 (CAM).

Parte 1: Configuración (1-2 días antes de la disección) (No se muestra el vídeo) <ol><li> PREPARACIÓN DE SOLUCIONES CULTURA Y MEDIOS DE COMUNICACIÓN: <ul><li> 4X CMF-PBS-EDTA (calcio y magnesio libre de tampón fosfato salino-EDTA para las diluciones de Percoll) por litro, agregar 32 g de NaCl, 1,2 g KCl, 8 g de glucosa, 2 g de NaH 2 PO 4, 1 g KH 2 PO 4, 8 ml 2% NaHCO stock 3, 10 ml 1M EDTA (pH 8,0) a agua destilada / desionizada. Ajuste el volumen a 1 litro y el pH a 7,4. Filtro de esterilización. </li><li> HBSS-glucosa: glucosa Añadir (6 gramos / litro) de calcio y magnesio Solución libre salina equilibrada de Hank (HBSS) y un filtro estéril. 500 ml se pueden almacenar a 4 ° C durante un máximo de un mes. </li><li> MEDIOS DE CULTIVO: medio libre de suero (SFM) y el 10% medio FBS. A 48 ml de Neurobasal A-Media añadir 500 l 100X Glutamax I, 500 l 100X penicilina-estreptomicina (final de 100 unidades de penicilina y estreptomicina 100 mg), 6,25 l 2 M KCl (final de 250 mM). Dividida en 2 partes alícuotas de 9 ml y 40 ml. Para preparar el 10% medio FBS, añadir 1 ml de SFB inactivado por calor a la parte alícuota de 9 ml. Para preparar la ordenación forestal sostenible, añadir 800 l de los suplementos de suero libre de B-27 a la alícuota de 40 ml. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C por un máximo de 2 semanas. Para obtener mejores resultados que los medios de comunicación nuevos para cada experimento. </li></ul></li><li> Preparar las diluciones de Percoll: <ul><li> Percoll se presenta como un líquido y debe ser acidificada antes de su uso. Para preparar el caldo, agregar HCl 1N, poco a poco a la solución de Percoll durante un período de 1-2 horas hasta pH 7,4 se alcanza. Añadir el HCl demasiado rápido hará que el Percoll al conjunto. Aproximadamente 6.5ml de HCl 1 N se necesitan por cada litro de Percoll. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C. </li><li> Un 35% y un 60% (vol: vol) de dilución Percoll se utilizará en el paso gradiente de Percoll. Preparar 100 ml de Percoll diluciones que contiene 35 o 60 ml de Percoll de valores, 25 ml de 4X CMF-PBS-EDTA y agua destilada / desionizada H2O para el volumen final. Añadir unas gotas de azul de toluidina para la solución del 60%, sino que le ayudará a visualizar la interfaz y las células. Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C. </li><li> 4X CMF-PBS-EDTA no deben ser mayores de 3 meses, como búfer insuficiente causará la muerte celular aumentó durante el procedimiento. </li></ul></li><li> Cubreobjetos PREPARACIÓN: cubreobjetos de cristal (mejor si es de Carolina Biological Supply Company) se lavan con HCl 10% durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave, enjuagar con agua destilada / deonized agua y almacenados en etanol al 70%. Antes de usar, solo se llama cubreobjetos esterilizados por brevemente la celebración con unas pinzas sobre una llama abierta (mechero Bunsen) hasta que se evapore el etanol. 12 mm cubreobjetos de vidrio se pueden colocar en placas de cultivo de 4 bien y cubreobjetos de 25 mm en placas de cultivo de 6 pocillos. </li><li> BUQUES DE LA CULTURA DE RECUBRIMIENTO CON SOPORTE: Para la tinción de inmunofluorescencia o tratamientos farmacológicos cubreobjetos de vidrio son más adecuados, ya que pueden ser fácilmente montados en portaobjetos de vidrio para la visualización en el microscopio. Cuando un gran número de células necesarias para la recogida de muestras de ARN o de proteína, las células pueden ser cultivadas en la cultura de plástico dishes.The noche antes de la disección, cubreobjetos de vidrio o platos de plástico para la cultura deben ser recubiertas con poli-D-lisina (500 mg / ml; 800 l / pocillo para placas de 6 pocillos o 350 l / pocillo de 4 placas). 5 mg / ml de solución stock de poli-D-lisina se almacena a -20 ° C, después se diluyó en agua destilada estéril / deonized el agua y el derecho de filtrado estéril antes de su uso. Recipientes de cultivo se incuba a 37 ° C durante la noche (o por lo menos durante 2 horas antes de la chapa) y se lavó dos veces con el derecho de agua destilada estéril / deonized de las placas,. </li><li> La preparación de platos PREPLATING: Estos platos serán utilizados para pre-revestimiento de las células del cerebelo aislado antes del cultivo para eliminar los contaminantes gliales, que se adhieren más fácilmente a una menor concentración de sustrato. Dos capas de 60 mm placas de cultivo de plástico con 4 ml por placa de poli-D-lisina (100 ug / ml; Nota: esta es 1 / 5 de la concentración utilizada para el cultivo). Se incuba a 37 ° C durante la noche (o por lo menos durante 2 horas antes de la disección). Justo antes de la disección, se retira la solución de poli-D-lisina, lavar los platos dos veces con agua estéril y dejar secar en la campana. </li><li> Esterilizar las herramientas de disección en el autoclave o en el día de la disección, sumerja los instrumentos en el 70% de etanol durante 20 minutos. Herramientas necesarias: unas tijeras Permaset, tijeras microdissecting, cuatro Dumont # 5 pinza de disección. </li></ol> Parte 2: Preparación para la disección (día de la disección) - (demostrada en el vídeo) Todos los procedimientos siguientes se realizan en una campana de cultivo de tejidos a menos que se. <ol><li> Limpie el área de disección con etanol al 70%. Caliente los medios de comunicación a 37 ° C en un baño de agua o en un 5% de CO 2 incubadora a 37 ° C. </li><li> Cuando se inicia un nuevo sistema de papaína disociación Kit (Worthington), preparar la solución de albúmina ovomucoide inhibidor. Agregar 32 mlde EBSS (solución salina balanceada de Earle, en el kit) a la mezcla de inhibidor de la albúmina ovomucoide y permitir que los contenidos se disuelven, mientras que la preparación de los otros componentes. Reconstituir en la primera utilización, guarde la solución restante a 2-8 º C y utilizar hasta los cinco aislamientos permitido por cada kit se han completado. </li><li> Añadir 5 ml de EBSS al vial de la papaína uno de los kit de disociación (cada vial es suficiente para la disociación de 4 a 15 cerebelo de postnatal día 5 ratones). Coloque el vial de la papaína en un 5% de CO 2 37 ° C o incubador de 37 ° C baño de agua durante 5 a 10 minutos hasta que la papaína se disuelva por completo y la solución parece clara. Mantener la solución a temperatura ambiente durante la disección. </li><li> Añadir 500 l de EBSS a un vial DNasa del kit de disociación. Mezclar suavemente tocando el vial desde DNasa es sensible a la desnaturalización de corte. Añadir 250 l de esta solución en el vial que contiene la papaína (concentración final es de 20 unidades / ml papaína y el 0,005% DNasa). Guarde el resto de vial DNasa para su uso en el paso 5.1 o 6.1. </li></ol> Parte 3: Disección y eliminación de las meninges <ol><li> La edad óptima para el cultivo de células granulares de ratones C57BL/6J es después del día 06/04, cuando el número de células progenitoras de células granulares de la EGL peaks1, 10. Diseccionar las crías de una en una, y como que se familiarice más con la disección del cerebelo tratar de reducir el tiempo de la disección a no más de 6 minutos por cada cachorro. La velocidad es la esencia. Si el paso se pasa por alto gradiente de Percoll, ocho días después del parto-5 crías de ratón puede producir suficientes células de una placa de cultivo de 6 pocillos (o seis de 25 mm cubreobjetos) o por seis placas de cultivo de 4 bien (o veinticuatro 12 - mm cubreobjetos). Rendimiento aproximado es de 4 a 5x106 células por la densidad de cría y de las planchas puede variar entre 1 y 5x105 células/cm2. Dado que las células del 15-20% se pierden durante el Paso 4 Percoll, más animales se necesitan para obtener la misma densidad deseada de la célula. </li><li> Pipeta de 15 ml de HBSS-glucosa en un 60 mm plato de plástico de cultivo de tejidos y de 10 ml en una estéril Falcon 15 ml tubo de plástico cónico. Poner en hielo. </li><li> Fuera de la campana, limpie la cabeza del cachorro con el 70% de etanol. Use las tijeras Permaset para decapitar al cachorro. (La decapitación no será mostrado en el video.) </li><li> En la capilla, sostener la cabeza con unas pinzas Dumont de modo que usted puede ver claramente la parte posterior del cráneo. El acceso al cerebro mediante la inserción de tijeras microdissecting dentro del foramen magno y el corte en línea recta hacia los ojos. Con unas pinzas, retire la piel y levantar el cráneo para exponer el cerebro. El uso de pinzas Dumont, pellizcar el cerebelo y el mesencéfalo rodea y su transferencia a la fuente con HBSS-glucosa. (Es más fácil de manipular el cerebelo y eliminar las meninges si el cerebelo está todavía en el tejido circundante). </li><li> Bajo el microscopio de disección, suavemente pelar las meninges de la cerebelo y también entre los lóbulos con una multa Dumont # 5 fórceps durante el uso de las pinzas de anclaje a otros por el cerebelo a la placa. Usted se dará cuenta de los vasos sanguíneos en la superficie del cerebelo. Estos vasos sanguíneos son una buena manera de identificar las meninges. Quite la meninges hasta el cerebelo tiene un aspecto blanco mate. Separar el cerebelo desde el resto del cerebro medio. A su vez a su lado ventral y eliminar el plexo coroideo, que se parece a una cinta de color rojizo entre el cerebelo y el mesencéfalo ventral adyacente. Coloque cada cerebelo en frío HBSS-glucosa en un tubo cónico de 15 ml en hielo tan pronto como disecados. Cambie la solución de disección a un nuevo HBSS-glucosa después de la disección de tres cerebros. </li></ol> Parte 4: Suspensión celular <ol><li> Una vez que todas las disecciones se termine, quite el HBSS-glucosa desde el tubo y reemplazarlo con la solución de papaína en el paso 2.4. Aunque el equipo recomienda cortar el tejido en trozos pequeños, nos encontramos con que no es necesario cortar o picar el cerebelo a esta edad. Coloque el tejido + solución de papaína (en un tubo cónico de 15 ml) en un 37 ° C baño de agua o 5% de CO 2 37 ° C incubadora durante 15 a 20 minutos. De 4 a 8 cerebelo, a 15 minutos a 37 º C es suficiente para un mayor número de cerebelo 20 a 30 minutos es mejor. Agite suavemente el tubo cada 3 a 4 minutos. </li><li> Triturar la mezcla con una punta de la pipeta estéril p1000 aerosol que ha sido recubierto con FBS. Hacer este paso con cuidado para evitar que la formación de burbujas de aire. Pipetas de vidrio pulido de incendios se puede utilizar, pero nos encontramos con que el suero estéril recubierta p1000 consejos aerosol funcionan igual de bien. Para cubrir la punta de la pipeta con el FBS, FBS pipeta hacia arriba y abajo dos veces antes de usar. Alrededor de 10 movimientos arriba y abajo con la pipeta son suficientes para disociar el tejido. La solución se enturbie. Permitir la suspensión de sentarse por 30-60 segundos para que los trozos grandes de tejido no disociado se asentará en el fondo del tubo. </li><li> Eliminar las células en suspensión (cuidado de no quitar las piezas de tejido no disociado en el bottom) en un nuevo tubo de 15 ml cónicos con una pipeta de punta recubierta de suero. Se centrifuga a aproximadamente 200xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. Prepare la resuspensión medio. Para ello, mezcla de 2,7 ml EBSS con 300 l de solución reconstituida inhibidor de la albúmina ovomucoide en un tubo estéril. Añadir 150 ml de solución de DNasa en el paso 2.4. </li><li> Después de centrifugar, descartar el sobrenadante e inmediatamente resuspender el botón celular en los gases de DNasa / inhibidor de la solución de albúmina preparada en la etapa 4.3 con un suero recubierto p1000 aerosol punta de la pipeta. </li><li> Preparar un gradiente de densidad discontinuo de la siguiente manera. Añadir 5 ml de solución de inhibidor de la albúmina ovomucoide a un tubo cónico de 15 ml. Cuidadosamente la capa de células en suspensión en la parte superior. Se centrifuga a aproximadamente 70xg durante 6 minutos a temperatura ambiente. Disociada precipitar las células en la parte inferior del tubo, fragmentos de membrana permanecen en la interfaz. </li><li> Si desea obtener cultivos que se enriquecen en las células granulares, evitar el gradiente de Percoll paso de separación (que produce cultivos puros de células granulares del cerebelo), y proceder a la parte 6. Si desea aislar aún más a las células granulares de la glía y las interneuronas grandes por la separación de gradiente de Percoll, proceder a la parte 5. El uso del paso gradiente de Percoll reduzca el rendimiento de las células. En nuestras manos, la reducción en el rendimiento es de aproximadamente 20-35%. Sin embargo, hay un aumento en el enriquecimiento de las neuronas granulares y las células progenitoras de aproximadamente el 90% al 95-99%. </li></ol> Parte 5: Separación gradiente de Percoll <ol><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado inmediatamente en 2 ml de HBSS-glucosa con 50 l de DNasa de paso 2.4. Filtrar la suspensión de células a través de una malla de nylon (tamaño de poro 70 micras) por la gravedad. Este paso eliminará grandes células no neuronales, y prevé una suspensión de células más simple. </li><li> Prepare dos pulido fuego de vidrio pipetas Pasteur. Para ello, llama suavemente la punta de una pipeta de vidrio hasta que el borde se suaviza y el agujero pipeta es de 40-50% del tamaño original. Tenga cuidado de no hacer que la abertura muy pequeña. </li><li> Prepare gradiente de Percoll. Colocar 10 ml de solución de Percoll al 35% en un tubo cónico de 50 ml estéril. 60% de Percoll (10 ml) se carga en una jeringa de 10 ml estéril con una aguja estéril adjunta la columna vertebral. Suavemente la capa de Percoll al 60% por debajo de la solución de solución al 35%, mediante la adición de la solución al 60% en la parte inferior del tubo con la aguja espinal. Tenga cuidado de mantener una interfaz clara entre las dos capas. Añadir a las células a la parte superior de la pendiente con una pipeta pulida al fuego, añadir suavemente a lo largo del lado del tubo sin molestar a la interfaz. </li><li> Con cuidado, coloque el tubo de la centrífuga y centrifugar a 1800xg. Rampa hasta la velocidad de un paso cada 20 segundos (incrementos de velocidad son los siguientes: de aproximadamente 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg) de modo que dura aproximadamente 2 minutos para alcanzar la velocidad deseada. Iniciar el temporizador de 10 minutos, cuando se alcanza 1800xg. Cuando haya terminado, disminuir la velocidad poco a poco a un paso cada 20 segundos. </li><li> Eliminar la interfaz superior de la pendiente (que contiene las células de grandes, las células de Purkinje y las interneuronas) y descarte. </li><li> Retire con cuidado las células en la interfase entre el 35% y el 60% de Percoll con una pipeta pulida al fuego y la transferencia a un tubo cónico de 50 ml. Resuspender en 3 volúmenes de HBSS-glucosa y mezclar invirtiendo varias veces. Centrifugar durante 5 minutos a 1100xg. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 4 ml de 10% medio FBS con 50 l de DNasa. Resuspender el precipitado con cuidado usando una pipeta pulida al fuego para formar una suspensión de células individuales. Continúe con el paso 6.2. </li></ol> Parte 6: Pre-placas y Revestimiento <ol><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado inmediatamente en 4 ml de 10% medio FBS con 50 l de DNasa en el paso 2.4. Filtrar la suspensión de células a través de una malla de nylon (tamaño de poro 70 micras) por la gravedad. Este paso eliminará grandes células no neuronales, y prevé una suspensión de células más simple. </li><li> Placa de las células recogidas en un poli-D-lisina recubierto pre-revestimiento plato durante 20 minutos en un 5% de CO 2 37 ° C incubadora. Repita el procedimiento con un plato dulce. Las células astroglía y más pesado se calmará y se adhieren a los platos y dejar a las neuronas granulares pequeñas y células neuronales progenitoras flotante. Después de la incubación, libremente adheridas las neuronas granulares y las células progenitoras neuronales son desalojados fácilmente y afloja con suaves golpecitos de la placa. </li><li> Recoger las neuronas granulares y las células progenitoras de neuronas en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 200xg durante 5 minutos. Resuspender el precipitado en 1 ml de medio libre de suero y el recuento de una alícuota de 10 l con un hemocitómetro. </li><li> Añadir medio libre de suero para llegar a la densidad celular deseada. Las guías para el número de células a la placa de media densidad: de placas de 6 pocillos, 3,5 a 4 millones de células, de las placas de 4 pocillos, 650.000 células. De 6 y placas de cultivo, que la placa de 1,5 ml / pocillo y 4, así pla-tes, que la placa de 0,5 ml / pocillo. Las células se mantienen en un 5% de CO 2 37 ° C incubadora. Cambiar el medio por completo 24 horas más tarde con los cambios subsiguientes se celebrarán cada dos o tres días. </li></ol>

<ol>
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Este protocolo se basa en modificaciones de los procedimientos que se han descrito en el pasado 3,7,11. Hay varios puntos importantes que tenga en cuenta como veremos a continuación. Las neuronas granulares y las células progenitoras se adhieren a las 2 horas de la siembra. Las células sanas tienen una morfología redonda bajo el 4 microscopio de contraste. Dentro de 24 horas después de la siembra, las células sanas se distribuye uniformemente en todo el cubreobjetos o el plástico y así se forma los proc...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell strainer with 70&mu;m mesh pore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinal Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>405182</td>
<td>20G x 3-1/2 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine mol wt>300,000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. 
</td>
</tr>
<tr>
<td>Percoll</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-1644</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175-103</td>
<td>Must be calcium and magnesium free.</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal A-Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10888-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamax I supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Serum Free Supplement (50x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12-mm circle coverslips </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply</td>
<td>63-3029</td>
<td>These are made in Germany by Deckgluder.</td>
</tr>
<tr>
<td>25-mm circle coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply</td>
<td>63-3037</td>
<td>These are made in Germany by Deckgluder.</td>
</tr>
<tr>
<td>Papain Dissociation System </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
<td>LK 003150</td>
<td>Kit is good for five isolations.</td>
</tr>
<tr>
<td>Permaset scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS6782</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 (Dumostar)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS4978</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4-well culture dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140685</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons 

La corteza del cerebelo es una estructura bien descrito que ofrece oportunidades únicas para el estudio de las propiedades neuronales y 1,2 de desarrollo. De los tipos neuronales del cerebelo (células granulosas, células de Purkinje y las interneuronas inhibitorias), las neuronas granulares son con mucho los más numerosos y son el tipo más abundante de las neuronas en el cerebro de los mamíferos. En roedores, las neuronas del cerebelo gránulo se generan durante las dos primeras semanas después del parto a partir de células progenitoras en la capa más externa de la corteza cerebelosa, la capa granular externa (EGL). El protocolo que aquí se presenta describe las técnicas para enriquecer la cultura y las neuronas granulares y sus células progenitoras de cerebelo de ratón post-natal. Vamos a describir los procedimientos para obtener cultivos de pureza cada vez mayor de 3,4, lo que puede ser usado para estudiar la diferenciación de la proliferación de células progenitoras en 5,6 neuronas granulares. Una vez que las células progenitoras se diferencian, las culturas también proporcionan una población homogénea de las neuronas granulares para la manipulación experimental y caracterización de fenómenos como la sinaptogénesis, la función del receptor de glutamato 7, la interacción con otras células del cerebelo 8,9 purificada o muerte celular 7.

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Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Aquí presentamos un método para aislar y cultivar cerebelosa gránulo células progenitoras de neuronas y las neuronas del cerebelo gránulo de ratón postnatal.

Aislamiento y cultivo de Post-Natal células de ratón cerebelosa gránulo Progenitor neuronas y las neuronas

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

isolation-culture-post-natal-mouse-cerebellar-granule-neuron

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

28.5K vistas.  Columbia University. Aquí presentamos un método para aislar y cultivar cerebelosa gránulo células progenitoras de neuronas y las neuronas del cerebelo gránulo de ratón postnatal.

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Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Aislamiento y cultivo de células embrionarias progenitoras aviar valvular

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Investigación

Biología

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Aislamiento y cultivo de células de la zona nefrogénica del riñón de embriones de ratón

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Aislamiento y cultivo primario de células hepáticas de ratas

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

A simple method to derive and maintain spermatogonial stem and progenitor cell lines from adult mice is presented here. The method utilizes feeder cells originating from the somatic cell compartment of the adult mouse testis. This technique is applicable to common mouse strains, including transgenic, knock-out, and knock-in mice.

Enriquecimiento de serie de la madre de espermatogonias y células progenitoras (SSC) en Cultura para la derivación de largo plazo de ratones adultos Líneas SSC

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales Ratón

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Aislamiento y cultivo de ratón primarias células acinares pancreáticas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Aislamiento, cultivo y trasplante de células musculares satélite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...