우리는 소중한 제안 바바라 Carletti과 안나 마리 케니 감사합니다. , DK07328 : HYL는 교육 부여 &quot;생화학 및 분자 생물학 호르몬&quot;에 의해 지원됩니다. NIH 교부금 5R01 NS16951 (CAM)에 의해 부분적으로 지원.

1 부 : (동영상에 표시되지 않음) (1-2일 절개 전) 설정 <ol><li> 문화 솔루션과 미디어 준비 : <ul><li> 4X CMF - PBS - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Percoll의 dilutions을위한 칼슘, 마그네슘 자유 인산 버퍼 호수 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) : 당 리터, 32g NaCl, 1.2 g KCl, 8g 포도당, 2g 아니 2 PO 4 1g KH 2 PO를 추가 4, 8 ML 2% NaHCO 3 재고, deionized / 증류수 10 ML 1M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0). 1리터 및 7.4에 산도로 볼륨을 조정합니다. 소독 필터. </li><li> HBSS - 포도당 : 칼슘, 마그네슘 무료 행크의 밸런스 소금 솔루션 (HBSS) 및 살균 필터에 추가 포도당 (6g / 리터). 500 ML은 ° C 한달에 최대 4 저장할 수 있습니다. </li><li> 문화 미디어 : 혈청이없는 매체 (SFM)와 10 % FBS 배지. 48 ML하기 Neurobasal - 중간 500 μl 100X GlutaMAX I, 500 μl 100X의 페니실린 - 스트렙토 마이신 (최종 100 단위의 페니실린과 100 μg의 스트렙토 마이신), 6.25 μl 2 M KCl을 (250 μm의 최종) 추가합니다. 9 ML 2 aliquots 40 ML에 가라. 10% FBS 매체를 준비하려면, 9 ML의 나누어지는에 열 inactivated FBS의 1ml를 추가합니다. SFM를 준비하려면 40 ML의 나누어지는에 혈청이없는 보완 B - 27 800 μl를 추가합니다. 소독 필터 2 주 최대 4 ° C에 저장합니다. 각 실험에 대한 새로운 미디어를 만드는 최상의 결과하십시오. </li></ul></li><li> PERCOLL의 DILUTIONS 준비 : <ul><li> Percoll은 액체로 공급되며 그것은 사용하기 전에 산성해야합니다. 산도 7.4에 도달할 때까지 주식을 준비하려면 1-2시간 기간 동안 Percoll 솔루션에 조금씩 1N HCL을 조금 추가합니다. 너무 빨리 HCL를 추가하면 집계에 Percoll의 원인이됩니다. 1N HCL 약 6.5ml은 Percoll의 각 리터 필요합니다. 소독 필터와 4 저장 ° C. </li><li> 35 %, 60 % (권 : 권) Percoll 희석은 Percoll 기울기 단계에서 사용됩니다. Percoll 주식의 35 또는 60 ML을 포함하는 100 ML Percoll의 dilutions 준비, 4X CMF - PBS - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 소주의 25 ML은 / 최종 볼륨 H2O deionized. 60 % 용액에 청색 toluidine 몇 방울을 추가, 그것은 인터페이스와 세포를 시각적으로 도움이 될 것입니다. 소독 필터와 4 저장 ° C. </li><li> 부적 절한 버퍼링이 절차를 수행하는 동안 증가 세포 사망의 원인이되므로 4X CMF - PBS - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)은, 3 개월 이상은 안됩니다. </li></ul></li><li> 준비 COVERSLIPS : 유리 coverslips는 (최고의 카롤 생물 공급 회사의 경우), 가벼운 교반과 함께 실온에서 하룻밤 10% HCL로 씻은 deonized / 증류수로 깨끗이 씻어서 70 % 에탄올에 저장되어 있습니다. 사용하기 전에 단일 coverslips은 불꽃 - 소독 짧게 에탄올 증발까지 오픈 화염 (알콜 램프)를 통해 포셉으로 그들을 개최하여. 12 mm 유리 coverslips는 6 잘 문화 접시에 4 잘 문화 접시와 25 mm coverslips에 삽입할 수 있습니다. </li><li> 기판 코팅 문화 선박 : 그들이 쉽게 현미경으로 시각화를위한 유리 슬라이드에 장착할 수 있으므로 immunofluorescence 얼룩이나 약물 치료의 유리 coverslips에 대한 더 적합합니다. 세포의 큰 숫자는 단백질이나 RNA 샘플을 수집하기 위해 필요한 경우, 세포가 플라스틱 문화를 해부하기 전에 dishes.The 밤에 교양 수있는, 문화에 대한 유리 coverslips 또는 플라스틱 요리는 폴리 - D - 라이신 (500 μg / ML로 코팅되어야합니다; μl / 잘 6 - 잘 접시 800 또는 350 μl / 음 4 - 잘 접시를 위해). 5 MG / 폴리 - D - 라이신의 ML 주식 솔루션은 -20 ° C 후, 멸균 deonized / 증류수 및 사용하기 전에 멸균 필터링 오른쪽에서 희석에 저장됩니다. 문화 선박이 37 incubated 아르 ° C 숙박 (또는 적어도 도금 전에 2 시간 용)과 도금하기 전에 멸균 deonized / 증류수 오른쪽과 함께 두 번 세탁. </li><li> PREPLATING 요리를 준비 :이 요리는 기판의 낮은 농도에 더 쉽게 준수 glial 오염 물질을 제거하는 문화 전에 격리 소뇌 세포를 미리가 도금에 사용됩니다. 폴리 - D - 라이신 (;이 culturing에 사용되는 농도의 1 / 5 주 100 μg / ML)의 그릇 당 4 ML과 문장이 60 mm 플라스틱 문화 요리. 37 품어 ° C 숙박 (또는 적어도 해부하기 전에 2 시간 용). 오른쪽 절개 전에, 폴리 - D - 라이신 솔루션을 제거하는 살균 물로 두 번 설거지를하고 후드의 건조 수 있습니다. </li><li> 압력솥이나 해부 당일 해부 도구를 소독, 20 분 70 %의 에탄올에있는 도구를 잠그다. 필요한 도구 : Permaset 가위, microdissecting 가위, 넷 더몬트 # 5 해부 포셉. </li></ol> 2 부 : 절개 (절개의 날)을위한 준비 - (동영상 시연) 언급하지 않는 한 다음 절차의 모든 조직 문화 후드에서 수행됩니다. <ol><li> 70 % 에탄올로 해부 영역을 아래로 닦아주십시오. ° C 물 목욕이나 5 % CO 2 37 ° C 배양기에서 37로 미디어를 따뜻하게. </li><li> 새로운 Papain 분리 시스템 키트 (워싱턴)를 시작할 때, 알부민 - ovomucoid 억제제의 솔루션을 준비합니다. 32 ML 추가EBSS (얼의 밸런스드 소금 솔루션, 키트에 제공)의 알부민 - ovomucoid 억제제 혼합물과 다른 구성 요소를 준비하는 동안 내용이 용해 수 있습니다. 처음 사용 Reconstitute, 그때 2-8에서 남아있는 솔루션을 저장 ° C 각 키트에 의해 허용되는 다섯 isolations이 완료될 때까지 사용합니다. 것은 </li><li> 분리 키트 (각 유리병은 출생 후의 5 일 마우스 4-15 cerebella의 분리에 충분합니다) 한 papain의 약병에 EBSS 5 ML을 추가합니다. 5 % CO 2 37 papain 병을 플레이스 ° C 배양기 또는 37 ° papain 완전히 해산 및 솔루션 분명히 나타날 때까지 5~10분위한 C 물 목욕. 해부 동안 상온에서 솔루션을 유지합니다. </li><li> 분리 키트에서 하나의 약병에 DNase EBSS 500 μl를 추가합니다. DNase는 전단 변성에 민감 있기 때문에 병을 감청하여 부드럽게 섞는다. papain (최종 농도가 20 단위 / ML의 papain과 0.005 % DNase입니다)이있는 유리병에이 솔루션을 250 μl를 추가합니다. 5.1 또는 6.1 단계에서 사용하기 위해 나머지 DNase의 약병을 저장합니다. </li></ol> 파트 3 : 해부 및 Meninges 제거 <ol><li> C57BL/6J 마우스의 과립 세포 배양을위한 최적의 연령은 출생 후의 일 4-6 EGL peaks1, 10 과립 세포 progenitors의 수입니다. 것입니다 새끼 한 번에 하나씩 해부하다하고 소뇌 해부 더욱 친숙해질 같은 새끼 당 더 이상 6보다 분 해부 시간을 줄이기 위해 시도합니다. 속도는 본질입니다. Percoll 기울기 단계가 무시하는 경우, 여덟 출생 후의 일 5 마우스 새끼 한 6 자 문화 플레이트 (여섯 25 mm coverslips)에 대한 여섯 4 잘 문화 플레이트 (또는 스물넷 12 충분한 세포를 얻을 수 있습니다 - mm의 coverslips). 대략 수율은 강아지와 도금 밀도 당 4 5x106 세포 cells/cm2 1 ~ 5X105을 범위를 수있다는 것입니다. 15~20% 세포가 Percoll step4 중에 손실되기 때문에, 더 많은 동물이 동일한 원하는 세포 밀도를 얻기 위해 필요합니다. </li><li> 피펫 살균 팰컨 15 ML 원뿔형 플라스틱 튜브에 60 mm 플라스틱 조직 문화 요리 및 10 ML에 HBSS - 포도당 15 ML. 얼음 입어. </li><li> 후드 이외의 70 % 에탄올로 강아지의 머리를 닦아냅니다. 강아지 목을 벨로 Permaset 가위를 사용합니다. (잘린는 동영상에 표시되지 않습니다.) </li><li> 당신은 명확하게 두개골의 뒷면을 볼 수 있도록 후드에서 더몬트 집게로 머리를 잡아. 구멍의 매그넘에 microdissecting 가위를 삽입하고 눈을 향해 직선 절단하여 두뇌에 액세스할 수 있습니다. 피부 껍질, 집게를 사용하여 두뇌를 노출하기 위해 두개골을 올려요. 더몬트 집게를 사용하여 소뇌 및 주변 midbrain을 꼬집어하고 HBSS - 포도당과 함께 접시에 전송할 수 있습니다. (그것은 소뇌가 여전히 주변 조직에 연결된 경우 소뇌을 조작하고 meninges를 제​​거하는 것이 더 쉽습니다.) </li><li> 해부 현미경, 부드럽게 소뇌에서 meninges 껍질 또한 접시에 소뇌를 앵커로 다른 집게를 사용하는 동안 한 멋진 더몬트 # 5 포셉있는 엽 (叶) 사이. 당신은 소뇌의 표면에 혈관을 통지합니다. 이러한 혈관은 meninges을 식별하는 좋은 방법입니다. 소뇌가 헝클어진 흰 ​​모양에 소요 때까지 meninges를 제​​거합니다. midbrain의 나머지 부분에서 소뇌를 구분한다. 는 복부쪽으로 그것을 켜고 복부 소뇌와 인접한 midbrain 사이에 붉은 리본처럼 보이는 맥락막 얼기를 제거합니다. 빨리 해부로 얼음에 15 ML 원뿔 관에 HBSS - 포도당 추운 각 소뇌를 배치합니다. 3 머리를 해부 후 HBSS - 포도당 신선한에 해부 솔루션을 변경합니다. </li></ol> 4 부 : 세포 현탁액 <ol><li> 일단 모든 해부 작업이 완료, 튜브의 HBSS - 포도당을 제거하고 단계 2.4 만든 papain 솔루션으로 대체합니다. 키트 작은 조각의 조직을 절단하는 것이 좋습니다 있지만, 우리는이 나이에 cerebella를 잘라내거나 말하다 필요가 없습니다 것을 발견했습니다. 37 조직 + papain 솔루션 (15 ML 원뿔 튜브) 장소 ° C 물 목욕이나 5% CO 2 37 15~20분에 대한 ° C 배양기. 4-8 cerebella, 37에서 15 분 동안 ° C가 충분합니다; cerebella의 큰 숫자에 대해 20 ~ 30 분 더 있습니다. 부드럽게 관에게 매 3 4 분 선동. </li><li> FBS로 코팅되어 살균 P1000 에어로졸의 피펫 팁로 혼합물을 씹다. 모든 공기 방울 형성​​을 방지하기 위해이 단계를 부드럽게 마십시오. 소방 광택 유리 pipettes를 사용하지만, 우리는 혈청 살균 코팅 P1000 에어로졸 도움말 단지뿐만 아니라 작동하는지 찾을 수 있습니다. 코트 FBS와 피펫 팁하려면, 피펫 FBS 위아래 두 번 그냥 사용하기 전에. 피펫와 약 10 아래로 움직임이 조직을 떼어 놓다 충분히 있습니다. 이 솔루션은 뿌연 될 것입니다. 정지가 undissociated 조직의 큰 조각은 튜브의 바닥에 해결할 수 있도록 30-60초 위해 앉아 수 있습니다. </li><li> 정지 세포 (주의 B에서 undissociated 조직 조각을 제거하지 제거혈청 코팅 피펫 팁을 가진 신선한 15 ML 원뿔 관에 ottom). 상온에서 5 분 정도 200xg에서 원심 분리기. 다시 서스펜션 매체를 준비합니다. 이렇게하려면, 멸균 튜브에 재구성 알부민 - ovomucoid 억제제 솔루션 300 μl와 2.7 ML EBSS를 섞는다. 2.4 단계에서 DNase 솔루션 150 μl를 추가합니다. </li><li> centrifuging 후, 표면에 뜨는를 버리고 즉시 희석 DNase / 혈청 코팅 P1000 에어로졸 피펫 팁과 단계 4.3에서 준비 알부민 억제제 솔루션 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> 다음과 같이 불연속 밀도 기울기를 준비합니다. 15 ML 원뿔 관에 알부민 - ovomucoid 억제제 솔루션의 5 ML을 추가합니다. 위에 조심스럽게 레이어 세포 현탁액. 상온에서 6 분 정도 70xg에서 원심 분리기. 튜브 하단의 Dissociated 세포 펠렛은 멤브레인 조각 인터페이스에 남아 있습니다. </li><li> 이 과립 세포에 농축 아르 문화를 얻는하고자하는 경우, Percoll 기울기 분리 단계 (소뇌 과립 세포의 순수한 문화를 산출하는) 무시하고, 6 부로 진행합니다. 당신이 더 Percoll 기울기 분리에 의해 glia 대형 interneurons에서 과립 세포를 분리하려는 경우 제 5 부로 진행합니다. Percoll 기울기 단계의 사용은 세포의 수율을 줄일 수 있습니다. 우리 손에, 이윤율의 감소는 약 20-35%입니다. 그러나, 약 90% 95-99의 %로 과립 신경 및 전구 세포의 농축 증가가있다. </li></ol> 제 5 부 : Percoll 기울기 분리 <ol><li> 뜨는을 취소하고 즉시 단계 2.4에서 DNase 50 μl와 HBSS - 포도당 2 ML에서 펠렛을 resuspend. 중력에 의한 나일론 메쉬 (기공 크기가 70 μm의) 비록 세포 현탁액을 필터링합니다. 이 단계는 큰 비의 연결 세포를 제거하고 더 나은 단일 세포 현탁액을 위해 제공하는 것입니다. </li><li> 이 화재 - 광택 유리 파스퇴르 pipettes 준비. 이렇게하려면 부드럽게 불꽃은 가장자리가 smoothened 및 피펫 구멍 때까지 유리 피펫의 끝에 원래 크기의 40~50%입니다. 자리가 너무 작게 만들 안됩니다. </li><li> Percoll 기울기를 준비합니다. 50 ML 살균 원뿔 관에 35 % Percoll 솔루션의 장소 10 ML. 60% Percoll (10 ML)은 첨부 살균 척추 바늘로 10 ML 멸균 주사기에로드됩니다. 척추 바늘과 튜브의 하단에있는 60 %의 솔루션을 추가하여 35 % 용액 아래 부드럽게 계층 60 % Percoll 솔루션. 날카로운 인터페이스 두 레이어 사이에 유지하는데주의를 기울여야. 부드럽게 인터페이스를 방해하지 않고 튜브의 측면을 따라 그들을 추가, 불타는 광택 피펫을 사용하여 그라디언트의 상단에 셀을 추가합니다. </li><li> 1800xg에서 원심과 원심의 튜브를 조심스럽게 넣습니다. 그것이 원하는 속도에 도달하는 약 2 분 정도 소요되도록 : 속도가 한 단계마다 20 초 (약 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg 속도의 증가는 다음과 같다)까지 램프. 1800xg에 도달하기 위해 10 분 타이머를 시작합니다. 완료되면, 점차 한 단계마다 20 초 속도 감소. </li><li> 그라디언트의 상위 인터페이스 (대형 glia, Purkinje 세포와 interneurons를 포함)의 제거 및 폐기. </li><li> 신중하게 불을 광택 피펫과 50 ML 원뿔 튜브로 전송으로 35 %, 60 % Percoll 사이의 인터페이스에있는 세포를 제거합니다. HBSS - 포도당과 반전 몇 배 혼합 3 권 Resuspend. 1100xg에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 뜨는를 제거하고 DNase 50 μl와 10% FBS 배지 4 ML를 추가합니다. 부드럽게 단일 세포 현탁액을 형성하기 위해 불을 광택 피펫을 사용하여 펠렛을 Resuspend. 6.2 단계로 진행합니다. </li></ol> 6 부 : 사전 도금 및 도금 <ol><li> 뜨는을 취소하고 즉시 단계 2.4에서 DNase 50 μl와 10% FBS 배지 4 ML에서 펠렛을 resuspend. 중력에 의한 나일론 메쉬 (기공 크기가 70 μm의) 비록 세포 현탁액을 필터링합니다. 이 단계는 큰 비의 연결 세포를 제거하고 더 나은 단일 세포 현탁액을 위해 제공하는 것입니다. </li><li> 플레이트 5 % CO 2 37 ° C 배양기에서 20 분 동안 폴리 - D - 라이신 코팅 미리 도금 요리에 수집된 세포. 신선한 요리와 함께 반복합니다. astroglia과 무거운 세포가 진정하고 요리를 준수하고 작은 과립 뉴런과 신경 세포의 전구 세포가 떠있는 떠날 것이다. 부화 후, 느슨하게 붙어 과립 뉴런과 신경 세포의 전구 세포가 쉽게 dislodged되고 접시의 부드러운 도청과 느슨하게. </li><li> 5 분 200xg에서 15 ML 원뿔 관과 원심 분리기의 과립 뉴런과 신경 세포의 전구 세포를 수집합니다. 혈청이없는 배지 1 ML에서 펠렛을 Resuspend과 hemocytometer를 사용하여 10 μl의 나누어지는를 계산합니다. </li><li> 원하는 세포 밀도에 도달하는 혈청이없는 매체를 추가합니다. 중간 밀도에 대한 판에 세포의 숫자가 대략적인 지침 : 6 - 그럼 접시, 3.5-4000000 전지, 4 자 번호판, 650,000 전지. 6 - 잘 문화 접시 들면, 플레이트 1.5 ML / 음과 4 잘 괞찮아드디어, 내가 플레이트 0.5 ML / 음. 세포는 5 % CO 2 37 ° C 배양기에서 유지됩니다. 후속 변경 사항을 모든 2-3일 24 시간 후에 완전히 매체를 변경합니다. </li></ol>

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이 프로토콜은 과거 3,7,11에서 설명했습니다 절차의 변경에 따라 달라집니다. 아래의 논의로 참고하기 위해 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다. 과립 신경 및 전구 세포는 도금 2 시간 이내에 준수. 건강한 세포의 위상 대비 현미경 4 아래 둥근 형태 있습니다. 도금 후 24 시간 이내에, 건강한 세포는 coverslips 또는 플라스틱 잘 주위에 균일하게 확산하고, 프로세스를 형성합니다. 최초의 매체 ?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell strainer with 70&mu;m mesh pore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinal Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>405182</td>
<td>20G x 3-1/2 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine mol wt>300,000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. 
</td>
</tr>
<tr>
<td>Percoll</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-1644</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175-103</td>
<td>Must be calcium and magnesium free.</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal A-Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10888-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamax I supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Serum Free Supplement (50x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12-mm circle coverslips </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply</td>
<td>63-3029</td>
<td>These are made in Germany by Deckgluder.</td>
</tr>
<tr>
<td>25-mm circle coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply</td>
<td>63-3037</td>
<td>These are made in Germany by Deckgluder.</td>
</tr>
<tr>
<td>Papain Dissociation System </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
<td>LK 003150</td>
<td>Kit is good for five isolations.</td>
</tr>
<tr>
<td>Permaset scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS6782</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 (Dumostar)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS4978</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4-well culture dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140685</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons 

소뇌 피질의 연결 속성과 개발 1,2를 공부에 대해 고유한 기회를 제공하는 잘 설명하는 구조입니다. 소뇌의 연결 유형 (과립 세포, Purkinje 세포와 억제 interneurons)의 과립 뉴런은 지금까지 가장 많은 있으며, 포유류의 두뇌에 신경 가장 풍부한 타입입니다. 설치류 동물에서 소뇌 과립 신경이 소뇌 피질, 외부 과립 층 (EGL)의 바깥쪽 레이어의 전구 세포에서 처음 두 포스트 나탈 주 동안 생성됩니다. 여기에 제시 프로토콜은 풍부 기술과 문화 과립 신경 및 사후 나탈 마우스 소뇌에서 자신의 전구 세포를 설명합니다. 우리는 과립 신경 5,6에 전구 세포를 proliferating의 차별을 연구하는 데 사용할 수있는 순수 증가 3,4의 문화를 구하는 절차를 설명합니다. 일단 전구 세포는 문화가 또한 synaptogenesis, 글루 탐 산염 수용체 기능 7, 기타 정화 소뇌 세포 8,9 또는 세포 사망 7 상호 작용과 같은 현상의 실험적 조작 및 특성에 대한 과립 뉴런의 동질적인 인구를 제공, 차별.

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Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

여기서 우리는 분리 방법 및 출생 후의 마우스 문화 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포와 소뇌 과립 신경을 제시.

포스트 - 나탈 마우스 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포 뉴런의 분리 및 문화

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

isolation-culture-post-natal-mouse-cerebellar-granule-neuron

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

28.4K 조회수.  Columbia University. 여기서 우리는 분리 방법 및 출생 후의 마우스 문화 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포와 소뇌 과립 신경을 제시.

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Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

분리 및 성인 인간 내피 콜로니 형성 전구 세포의 대규모 확장

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

연구

생물학

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

조류 배아 판막병 전구 세포의 분리 및 문화

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

배아 마우스 신장의 Nephrogenic 지대의 세포의 분리 및 문화

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

A simple method to derive and maintain spermatogonial stem and progenitor cell lines from adult mice is presented here. The method utilizes feeder cells originating from the somatic cell compartment of the adult mouse testis. This technique is applicable to common mouse strains, including transgenic, knock-out, and knock-in mice.

장기 성인 마우스 SSC 라인의 유도를위한 문화 Spermatogonial 줄기 및 전구 세포의 일련 농축 (SSCs)

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

분리 및 문화 신생아 마우스 심근

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

근육 위성 세포의 분리, 문화, 및 이식

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...