Ringraziamo Barbara Carletti e Anna Marie Kenney per i preziosi suggerimenti. HYL è sostenuta dalla borsa di formazione &quot;Gli ormoni: Biochimica e Biologia Molecolare&quot;, DK07328. Sostenuto in parte dal NIH concedere 5R01 NS16951 (CAM).

Parte 1: Impostazione (1-2 giorni prima della dissezione) (Non mostrato in video) <ol><li> PREPARAZIONE SOLUZIONI CULTURA E MEDIA: <ul><li> 4X CMF-PBS-EDTA (calcio e magnesio libero-tampone fosfato-EDTA per diluizioni Percoll): litro, aggiungere 32 g di NaCl, 1,2 g di KCl, 8 g di glucosio, 2 g di NaH 2 PO 4, 1 g di KH 2 PO 4, 8 ml al 2% NaHCO stock 3, 10 ml EDTA 1M (pH 8,0) a distillata / deionizzata. Regolare il volume di 1 litro e il pH a 7,4. Filtro sterilizzare. </li><li> HBSS-GLUCOSIO: Aggiungi glucosio (6 grammi / litro) al calcio e magnesio Salt libero di Hank Soluzione Balance (HBSS) e filtro sterile. 500 ml può essere conservato a 4 ° C per un massimo di un mese. </li><li> MEDIA CULTURA: mezzo privo di siero (SFM) e il 10% medio FBS. A 48 ml di Neurobasal A-Media aggiungere 500 microlitri 100X GlutaMAX I, 500 microlitri 100X penicillina-streptomicina (finale 100 unità penicillina e streptomicina 100 mg), 6,25 microlitri 2 M KCl (finale 250 mM). Diviso in 2 aliquote di 9 ml e 40 ml. Per preparare al 10% medio FBS, aggiungere 1 ml di calore FBS inattivato aliquota al 9 ml. Per preparare SFM, aggiungere 800 ml di siero senza supplemento B-27 per l&#39;aliquota 40 ml. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane. Per ottenere i migliori risultati rendono mezzi freschi per ciascun esperimento. </li></ul></li><li> PREPARAZIONE DILUIZIONI Percoll: <ul><li> Percoll è fornito come liquido e deve essere acidificato prima dell&#39;uso. Per preparare il brodo, aggiungere 1N HCl a poco a poco alla soluzione Percoll per un periodo di 1-2 ore fino a pH 7,4 viene raggiunto. Aggiunta del HCl troppo rapidamente farà sì che il Percoll per aggregare. Circa 6.5ml di 1N HCl sono necessari per ogni litro di Percoll. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li><li> A 35% e un 60% (vol: vol) diluizione Percoll saranno utilizzati nella fase gradiente Percoll. Preparare 100 ml di diluizioni Percoll contenente 35 o 60 ml di Percoll stock, 25 ml di 4X CMF-PBS-EDTA e distillata / deionizzata H2O al volume finale. Aggiungere poche gocce di blu di toluidina per la soluzione del 60%: ci aiuterà visualizzare l&#39;interfaccia e le cellule. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C. </li><li> 4X CMF-PBS-EDTA non dovrebbe avere più di 3 mesi, come il buffering inadeguata causerà la morte delle cellule è aumentato durante la procedura. </li></ul></li><li> Coprioggetto PREPARAZIONE: coprioggetto di vetro (meglio se da Supply Company Carolina biologica) vengono lavati con il 10% HCl notte a temperatura ambiente con agitazione mite, sciacquati accuratamente con acqua distillata / deonized acqua e conservati in etanolo al 70%. Prima dell&#39;uso, coprioggetto singole sono di fiamma sterilizzati con brevemente tenendo con una pinza su una fiamma libera (becco Bunsen) fino alla evapora etanolo. 12-mm coprioggetto di vetro può essere posizionato in 4 pozzetti cultura e coprioggetto da 25 mm in 6 pozzetti cultura. </li><li> NAVI RIVESTIMENTO CULTURA CON SUPPORTO: Per immunofluorescenza o trattamenti farmacologici in vetro coprioggetto sono più adatti in quanto possono essere facilmente montate su vetrini per la visualizzazione al microscopio. Quando un gran numero di cellule sono necessarie per la raccolta di campioni di RNA e proteine, le cellule possono essere coltivate sui piatti tradizionali della cultura plastica notte prima della dissezione, coprioggetto di vetro o piatti di plastica per la cultura devono essere rivestiti con poli-D-lisina (500 mg / ml; 800 microlitri / pozzetto per 6-pozzetti o 350 microlitri / pozzetto per 4-pozzetti). 5 mg / ml soluzione stock di poli-D-lisina è conservato a -20 ° C, poi diluito in distillata sterile / deonized acqua filtrata e sterile destra prima dell&#39;uso. Recipienti di coltura vengono incubate a 37 ° C per una notte (o almeno per 2 ore prima placcatura) e lavato due volte con distillata sterile / deonized diritto all&#39;acqua prima di placcatura. </li><li> Preparazione di piatti PREPLATING: Questi piatti saranno utilizzati per il pre-plating le cellule isolate cerebellari prima cultura per rimuovere i contaminanti gliali, che aderiscono più facilmente a una minore concentrazione di substrato. Cappotto due 60 mm di plastica con piatti di cultura 4 ml al piatto di poli-D-lisina (100 mg / ml; Nota questa è 1 / 5 della concentrazione usata per la coltura). Incubare a 37 ° C per una notte (o almeno per 2 ore prima della dissezione). Poco prima la dissezione, rimuovere il poli-D-lisina soluzione, lavare i piatti due volte con acqua sterile e lasciare asciugare nel cappuccio. </li><li> Sterilizzare gli strumenti dissezione in autoclave o il giorno della dissezione, immergere gli strumenti in etanolo al 70% per 20 minuti. Strumenti necessari: Permaset forbici, forbici microdissecting, quattro Dumont # 5 dissettore. </li></ol> Parte 2: Preparazione per la dissezione (giorno di dissezione) - (dimostrato in video) Tutte le seguenti procedure vengono eseguite in una cappa di coltura di tessuti a meno che celebre. <ol><li> Pulire l&#39;area dissezione con il 70% di etanolo. Riscaldare la media a 37 ° C a bagnomaria o in un 5% di CO 2 37 ° C incubatore. </li><li> Quando si avvia un nuovo sistema di papaina dissociazione Kit (Worthington), preparare la soluzione di albumina-ovomucoid inibitore. Aggiungere 32 mldi EBSS (soluzione salina bilanciata di Earle, fornito nel kit) per l&#39;albumina-ovomucoid miscela inibitore e permettere il contenuto di sciogliere durante la preparazione degli altri componenti. Ricostituire per il primo utilizzo, poi conservare la soluzione rimanente a 2-8 ° C e utilizzare fino a cinque isolamenti consentiti da ogni kit sono stati completati. </li><li> Aggiungere 5 ml di EBSS ad un flaconcino papaina dal Kit dissociazione (ogni fiala è sufficiente per la dissociazione di 4-15 dal cervello dei topi dopo la nascita giorno 5). Porre la fiala papaina in un 5% di CO 2 37 ° C o incubatore a 37 ° C bagnomaria per 5 a 10 minuti fino a quando la papaina è completamente sciolto e la soluzione appare chiara. Mantenere la soluzione a temperatura ambiente durante la dissezione. </li><li> Aggiungere 500 ml di EBSS ad un flaconcino DNasi nel kit dissociazione. Mescolare delicatamente toccando il flacone dal DNasi è sensibile alla denaturazione taglio. Aggiungere 250 microlitri di questa soluzione al flacone contenente la papaina (concentrazione finale è di 20 unità / ml di papaina e DNasi 0,005%). Salva il flacone rimanenti DNasi per l&#39;uso in fase 5.1 o 6.1. </li></ol> Parte 3: dissezione e rimozione Meningi <ol><li> L&#39;età ottimale per la coltura dei granuli delle cellule di topo C57BL/6J è il giorno dopo la nascita 4-6, quando il numero di cellule progenitrici delle cellule dei granuli in EGL peaks1, 10. Sezionare cuccioli uno alla volta e come si diventa più familiarità con la dissezione cerebellare cercare di ridurre i tempi di dissezione, per non più di 6 minuti per ogni cucciolo. La velocità è essenziale. Se il passo gradiente Percoll è bypassato, otto giorni dopo la nascita-5 cuccioli di topo si possono ottenere cellule sufficiente per un 6-bene piastra di coltura (o sei coprioggetto da 25 mm) o per sei a 4 e piastre di coltura (o 24 12 - coprioggetto mm). Rendimento stimato è di 4 a 5x106 cellule per densità cucciolo e placcatura può variare tra 1 e 5x105 cells/cm2. Dato che le cellule del 15-20% vengono persi durante la step4 Percoll, più animali sono necessari per ottenere la stessa densità cella desiderata. </li><li> Pipettare 15 ml di HBSS-glucosio in una di 60 mm piatto di plastica coltura di tessuto e 10 ml in una sterile Falcon 15 tubo di plastica ml. Mettere in ghiaccio. </li><li> Al di fuori della cappa, pulire la testa del cucciolo con il 70% di etanolo. Usare le forbici Permaset di decapitare il cucciolo. (Decapitazione non verrà mostrato nel video). </li><li> Nel cappuccio, tenere la testa con una pinza Dumont in modo che si può vedere chiaramente la parte posteriore del cranio. Accedi al cervello con l&#39;inserimento di forbici microdissecting nel foro occipitale e taglio dritto verso gli occhi. Con le pinzette e staccarsi la pelle e sollevare il cranio per esporre il cervello. Utilizzando pinze Dumont, pizzichi via il cervelletto e il mesencefalo circostante e trasferirlo al piatto con HBSS-glucosio. (E &#39;più facile manipolare il cervelletto e rimuovere le meningi se il cervelletto è ancora attaccato al tessuto circostante). </li><li> Sotto il microscopio da dissezione, delicatamente sbucciare le meningi fuori il cervelletto e anche tra i lobi con una multa Dumont # 5 forcipe durante l&#39;uso del forcipe altro ancora lungo il cervelletto alla piastra. Noterete vasi sanguigni sulla superficie del cervelletto. Questi vasi sanguigni sono un buon modo per identificare le meningi. Rimuovere le meningi fino a quando il cervelletto assume un aspetto opaco bianco. Separare il cervelletto dal resto del mesencefalo. Girare per il suo lato ventrale ed estrarre il plesso coroideo, che si presenta come un nastro rosso tra il cervelletto e il mesencefalo ventrale adiacenti. Mettete ogni cervelletto a freddo HBSS-glucosio in un tubo da 15 ml su ghiaccio appena sezionato. Cambia la soluzione dissezione a fresco HBSS-glucosio dopo dissezione 3 cervelli. </li></ol> Parte 4: sospensione cellulare <ol><li> Una volta che tutte le dissezioni sono finiti, rimuovere il HBSS-glucosio dal tubo e sostituirlo con la soluzione di papaina effettuata nel passaggio 2.4. Anche se il kit raccomanda il taglio del tessuto in piccoli pezzi, troviamo che non è necessario tagliare o tritare il cervello dei a questa età. Posizionare il + soluzione papaina tessuto (in un tubo da 15 ml) nel 37 ° C in bagno d&#39;acqua o 5% di CO 2 37 ° C incubatore per 15 a 20 minuti. Da 4 a 8 cervelletti, a 15 minuti a 37 ° C è sufficiente, per un numero maggiore di cervello dei 20 a 30 minuti è meglio. Agitare delicatamente il tubo ogni 3 o 4 minuti. </li><li> Triturare la miscela con un puntale sterile p1000 aerosol che è stato rivestito con FBS. Fare questo passo delicatamente per evitare la formazione di bolle d&#39;aria. Pipette in vetro lucido fuoco può essere utilizzato, ma a nostro parere siero rivestito sterile p1000 suggerimenti aerosol funzionare altrettanto bene. Per ricoprire la punta della pipetta con FBS, FBS pipetta su e giù due volte prima dell&#39;uso. Circa 10 su e giù per i movimenti con la pipetta sono sufficienti per dissociare il tessuto. La soluzione diventerà torbida. Consentono la sospensione a sedere per 30-60 secondi in modo che qualsiasi grossi pezzi di tessuto dissociato si depositerà sul fondo della provetta. </li><li> Rimuovere le cellule in sospensione (attenzione a non rimuovere i pezzi di tessuto non dissociato al bottom) in un nuovo tubo 15 ml con una punta di siero pipetta rivestito. Centrifugare a circa 200xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Preparare la risospensione media. Per fare questo, mix EBSS 2,7 ml con 300 ml di albumina ricostituito-inibitore ovomucoid soluzione in una provetta sterile. Aggiungere 150 ml di soluzione di DNasi dal punto 2.4. </li><li> Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e subito risospendere il pellet cellulare in diluita DNasi / soluzione inibitore albumina preparata al punto 4.3 con un siero rivestito p1000 aerosol puntale. </li><li> Preparazione di un gradiente discontinuo di densità come segue. Aggiungere 5 ml di albumina-ovomucoid soluzione inibitore ad un tubo da 15 ml. Con attenzione sospensione strato della cella in cima. Centrifugare a circa 70xg per 6 minuti a temperatura ambiente. Cellule dissociate pellet sul fondo del tubo, frammenti di membrana rimangono a livello di interfaccia. </li><li> Se si desidera ottenere colture che si arricchiscono in granuli, superare la fase di gradiente di Percoll di separazione (che produce le culture più pura di granuli cerebellari), e passare alla Parte 6. Se si desidera isolare ulteriormente le cellule gliali e granuli da interneuroni grandi per separazione gradiente di Percoll, passare alla Parte 5. L&#39;uso del passo gradiente Percoll ridurrà il rendimento delle celle. Nelle nostre mani, la riduzione della resa è di circa 20-35%. Tuttavia, vi è un aumento della arricchimento dei neuroni dei granuli e cellule progenitrici di circa il 90% al 95-99%. </li></ol> Parte 5: Separazione gradiente Percoll <ol><li> Eliminare il supernatante e risospendere immediatamente il pellet in 2 ml di HBSS-glucosio con 50 ml di DNasi dal punto 2.4. Filtrare la sospensione cellulare anche se una maglia di nylon (dimensione dei pori 70 micron) per gravità. Questo passo sarà la rimozione di grandi cellule non neuronali e prevede una sospensione migliore singola cella. </li><li> Preparare due incendi lucidato vetro pipette Pasteur. Per fare questo, delicatamente fiamma la punta di una pipetta di vetro fino a quando il bordo è semplificate ed il foro pipetta è 40-50% delle dimensioni originali. Fare attenzione a non fare l&#39;apertura troppo piccola. </li><li> Preparare gradiente Percoll. Introdurre 10 ml di soluzione di Percoll al 35% in una provetta sterile da 50 ml conica. Percoll 60% (10 ml) viene caricato con una siringa da 10 ml sterile con un ago sterile spinale allegato. Delicatamente lo strato di soluzione di Percoll al 60% sotto la soluzione al 35%, con l&#39;aggiunta di una soluzione al 60% sul fondo del tubo con l&#39;ago spinale. Aver cura di mantenere un&#39;interfaccia netta tra i due strati. Aggiungi le cellule alla parte superiore del gradiente usando un incendio lucidato pipetta, aggiungere delicatamente lungo il lato del tubo senza disturbare l&#39;interfaccia. </li><li> Posto con attenzione il tubo nella centrifuga e centrifugare a 1800xg. Rampa la velocità di un passo ogni 20 secondi (incrementi di velocità sono le seguenti: circa 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg) in modo che ci vogliono circa 2 minuti per raggiungere la velocità desiderata. Avviare il timer a 10 minuti quando 1800xg è raggiunto. Al termine, diminuire la velocità gradualmente un passo ogni 20 secondi. </li><li> Rimuovere l&#39;interfaccia superiore del gradiente (contenente glia grande, cellule di Purkinje, e interneuroni) e scartare. </li><li> Rimuovere con attenzione le cellule a livello di interfaccia tra il 35% e il 60% Percoll con un fuoco lucido pipetta e trasferirli in un tubo da 50 ml. Risospendere in 3 volumi di HBSS-glucosio e mescolare capovolgendo più volte. Centrifugare per 5 minuti a 1100xg. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 4 ml di 10% di media FBS con 50 ml di DNasi. Risospendere il pellet delicatamente con un incendio lucidato pipetta per formare una sospensione singola cella. Passare al punto 6.2. </li></ol> Parte 6: Pre-placcatura e placcatura <ol><li> Eliminare il supernatante e risospendere immediatamente il pellet in 4 ml di FBS 10% medio con 50 ml di DNasi dal punto 2.4. Filtrare la sospensione cellulare anche se una maglia di nylon (dimensione dei pori 70 micron) per gravità. Questo passo sarà la rimozione di grandi cellule non neuronali e prevede una sospensione migliore singola cella. </li><li> Piastra le cellule raccolte in un poli-D-lisina rivestito pre-placcatura piatto per 20 minuti in un 5% di CO 2 37 ° C incubatore. Ripetere con un piatto fresco. Le cellule astroglia e più pesanti si stabilizzerà e rispettare i piatti e lasciare i neuroni dei granuli piccoli e cellule progenitrici dei neuroni galleggianti. Dopo l&#39;incubazione, i neuroni granulari liberamente aderito e le cellule progenitrici dei neuroni sono spostano facilmente e allentato con lievi colpetti della piastra. </li><li> Raccogliere i neuroni dei granuli e le cellule progenitrici dei neuroni in un tubo da 15 ml e centrifugare a 200xg per 5 minuti. Risospendere il pellet in 1 ml di mezzo privo di siero e contare una aliquota di 10 microlitri con un emocitometro. </li><li> Aggiungere mezzo privo di siero per raggiungere la densità cellulare desiderato. Linee guida di massima per il numero di cellule per piastra per densità media: per 6-pozzetti da 3,5 a 4 milioni di cellule, per piatti 4-bene, 650.000 cellule. Per 6-pozzetti cultura, io piatto 1,5 ml / pozzetto e per 4 ben plates, io piatto 0,5 ml / pozzetto. Le cellule sono mantenute in un 5% di CO 2 37 ° C incubatore. Cambia il medium completamente 24 ore dopo con modifiche successive ogni due o tre giorni. </li></ol>

<ol>
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Questo protocollo si basa su modificazioni delle procedure che sono state descritte in passato 3,7,11. Ci sono diversi punti importanti da notare come descritto di seguito. I neuroni e le cellule progenitrici dei granuli aderire entro 2 ore dalla placcatura. Le cellule sane hanno una morfologia rotonda sotto il contrasto di fase 4 microscopio. Entro 24 ore dopo la placcatura, le cellule sane si diffonderà in modo uniforme in tutto il coprioggetto o il pozzo di plastica e formeranno processi. Al momento del cam...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Cell strainer with 70&mu;m mesh pore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinal Needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>405182</td>
<td>20G x 3-1/2 inches</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine mol wt>300,000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested. 
</td>
</tr>
<tr>
<td>Percoll</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-1644</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-Streptomycin (100X)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14175-103</td>
<td>Must be calcium and magnesium free.</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal A-Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10888-022</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glutamax I supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>35050-061</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Serum Free Supplement (50x)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12-mm circle coverslips </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply</td>
<td>63-3029</td>
<td>These are made in Germany by Deckgluder.</td>
</tr>
<tr>
<td>25-mm circle coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Carolina Biological Supply</td>
<td>63-3037</td>
<td>These are made in Germany by Deckgluder.</td>
</tr>
<tr>
<td>Papain Dissociation System </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
<td>LK 003150</td>
<td>Kit is good for five isolations.</td>
</tr>
<tr>
<td>Permaset scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS6782</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dumont #5 (Dumostar)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS4978</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>4-well culture dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>176740</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>6-well culture dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>140685</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons 

La corteccia cerebellare è una struttura ben descritto che offre opportunità uniche per studiare le proprietà neuronali e 1,2 di sviluppo. Dei tipi neuronali del cervelletto (cellule dei granuli, cellule di Purkinje e interneuroni inibitori), i neuroni dei granuli sono di gran lunga i più numerosi e sono il tipo più abbondante di neuroni nel cervello dei mammiferi. Nei roditori, i neuroni granuli cerebellari sono generati durante i primi due post-natale settimane da cellule progenitrici nello strato più esterno della corteccia cerebellare, lo strato granulare esterno (EGL). Il protocollo presentato qui descrive le tecniche per arricchire e neuroni dei granuli cultura e le loro cellule progenitrici dal post-natale del cervelletto mouse. Si descrivono le procedure per ottenere colture di purezza crescente 3,4, che può essere utilizzato per studiare la differenziazione delle cellule progenitrici proliferano in neuroni dei granuli 5,6. Una volta che le cellule progenitrici differenziare, le culture forniscono anche una popolazione omogenea di neuroni granulari per la manipolazione sperimentale e caratterizzazione di fenomeni come la sinaptogenesi, la funzione dei recettori del glutammato 7, l&#39;interazione con altre cellule purificate cerebellari 8,9 o morte cellulare 7.

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Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Qui vi presentiamo un metodo per isolare e cultura dei granuli cerebellari cellule progenitrici dei neuroni e neuroni granuli cerebellari da mouse postnatale.

Isolamento e la coltura di cellule post-Natal Neuron cerebellare granuli mouse progenitore e Neuroni

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

isolation-culture-post-natal-mouse-cerebellar-granule-neuron

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

28.5K Views.  Columbia University. Qui vi presentiamo un metodo per isolare e cultura dei granuli cerebellari cellule progenitrici dei neuroni e neuroni granuli cerebellari da mouse postnatale.

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Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

Isolamento e la coltura di cellule embrionali aviaria progenitrici valvolare

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Ricerca

Biologia

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

Isolamento e coltura di cellule dalla Zona nefrogenica del Rene embrionali di topo

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology and other related subjects. The method based on two-step collagenase perfusion for isolation of intact hepatocytes was first introduced by Berry and Friend in 1969 1 and, since then, has undergone many modifications. The most commonly used technique was described by Seglenin 1976 2. Essentially, hepatocytes are dissociated from anesthetized adult rats by a non-recirculating collagenase perfusion through the portal vein. The isolated cells are then filtered through a 100 &mu;m pore size mesh nylon filter, and cultured onto plates. After 4-hour culture, the medium is replaced with serum-containing or serum-free medium, e.g. HepatoZYME-SFM, for additional time to culture. These procedures require surgical and sterile culture steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol, which allow consistently in the generation of viable hepatocytes in large numbers.

Primary hepatocytes provide a valuable tool to evaluate biochemical, molecular, and metabolic functions in a physiologically relevant experimental system. We describe a reliable protocol for rat in situ liver perfusion, which consistently generates viable hepatocytes up to 1.0 &times; 108 cells per preparation with cell viability between 88 ~ 96%.

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

A simple method to derive and maintain spermatogonial stem and progenitor cell lines from adult mice is presented here. The method utilizes feeder cells originating from the somatic cell compartment of the adult mouse testis. This technique is applicable to common mouse strains, including transgenic, knock-out, and knock-in mice.

Arricchimento di serie staminali spermatogoni e cellule progenitrici (SSC) in Cultura per la derivazione di lungo termine Lines topo adulto SSC

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal nuclei in muscle fibers. In adult muscle, satellite cells are normally mitotically quiescent. Following injury, however, satellite cells initiate cellular proliferation to produce myoblasts, their progenies, to mediate the regeneration of muscle. Transplantation of satellite cell-derived myoblasts has been widely studied as a possible therapy for several regenerative diseases including muscular dystrophy, heart failure, and urological dysfunction. Myoblast transplantation into dystrophic skeletal muscle, infarcted heart, and dysfunctioning urinary ducts has shown that engrafted myoblasts can differentiate into muscle fibers in the host tissues and display partial functional improvement in these diseases. Therefore, the development of efficient purification methods of quiescent satellite cells from skeletal muscle, as well as the establishment of satellite cell-derived myoblast cultures and transplantation methods for myoblasts, are essential for understanding the molecular mechanisms behind satellite cell self-renewal, activation, and differentiation. Additionally, the development of cell-based therapies for muscular dystrophy and other regenerative diseases are also dependent upon these factors.

However, current prospective purification methods of quiescent satellite cells require the use of expensive fluorescence-activated cell sorting (FACS) machines. Here, we present a new method for the rapid, economical, and reliable purification of quiescent satellite cells from adult mouse skeletal muscle by enzymatic dissociation followed by magnetic-activated cell sorting (MACS). Following isolation of pure quiescent satellite cells, these cells can be cultured to obtain large numbers of myoblasts after several passages. These freshly isolated quiescent satellite cells or ex vivo expanded myoblasts can be transplanted into cardiotoxin (CTX)-induced regenerating mouse skeletal muscle to examine the contribution of donor-derived cells to regenerating muscle fibers, as well as to satellite cell compartments for the examination of self-renewal activities.

The isolation and culture of a pure population of quiescent satellite cells, a muscle stem cell population, is essential to the understanding of muscle stem cell biology and regeneration, as well as stem cell transplantation for therapies in muscular dystrophy and other degenerative diseases.&#160;

Isolamento, Cultura e trapianto di cellule muscolari satellite

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...