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Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in <em>E. coli</em>

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

University of California Santa Cruz - UCSC

Dna &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x6211; (pol &#x6211;) &#x5728;&#x843D;&#x540E;&#x7EDE;&#x5408;&#x6210; RNA &#x5F15;&#x7269;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x5904;&#x7406;&#x548C; DNA &#x4FEE;&#x590D;&#x53CD;&#x5E94;&#x671F;&#x95F4;&#x586B;&#x5145;&#x5C0F;&#x7684;&#x5DEE;&#x8DDD;&#x3002;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x4E0D;&#x6E05;&#x695A;&#x5982;&#x4F55; pol &#x6211;&#x548C; pol III &#x4E00;&#x8D77;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x671F;&#x95F4;&#x590D;&#x5236;&#x548C;&#x4FEE;&#x590D;&#x6216;&#x5982;&#x4F55;&#x5E7F;&#x6CDB; pol &#x6211;&#x5904;&#x7406;&#x7684;&#x5188;&#x5D0E;&#x7247;&#x6BB5;&#x662F;&#x4F53;&#x5185;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x89E3;&#x51B3;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x95EE;&#x9898;&#xFF0C;&#x901A;&#x8FC7;&#x5206;&#x6790; pol &#x6211;&#x901A;&#x8FC7;&#x6613;&#x51FA;&#x9519; ColE1 &#x8D28;&#x7C92;&#x7684;&#x590D;&#x5236;&#x751F;&#x6210;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x3002;&#x6570;&#x636E;&#x83B7;&#x5F97;&#x7684;&#x76F4;&#x63A5;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x5141;&#x8BB8;&#x7CBE;&#x786E;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x7A81;&#x53D8;&#x8C31;&#x53CA;&#x5206;&#x5E03;&#x3002;Pol &#x6211;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x8DB3;&#x8FF9;&#x8868;&#x660E;&#xFF1A; (i) &#x5728;&#x9886;&#x5148;&#x7EDE;&#x7EBF;&#x590D;&#x5236; pol &#x671F;&#x95F4;&#x6211;&#x6B63;&#x5728;&#x9010;&#x6B65;&#x53D6;&#x4EE3; pol III &#x4EE5;&#x4E0A;&#x81F3;&#x5C11; 1.3 kb &#xFF1B;(&#x4E8C;) pol &#x6211;&#x5904;&#x7406;&#x7684;&#x5188;&#x5D0E;&#x7247;&#x6BB5;&#x4EC5;&#x9650;&#x4E8E; &sim;20 nt &#x548C; (iii) &#x7684;&#x5188;&#x5D0E;&#x7247;&#x6BB5;&#x7684;&#x5927;&#x5C0F;&#x662F;&#x77ED; (&sim;250 nt)&#x3002;&#x867D;&#x7136;&#x57FA;&#x4E8E; ColE1 &#x8D28;&#x7C92;&#x590D;&#x5236;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x6709;&#x53EF;&#x80FD;&#x6709;&#x5173;&#x7684;&#x5176;&#x4ED6;&#x6CB9;&#x6599;&#x590D;&#x5236;&#x8FDB;&#x7A0B;&#x8FD9;&#x79CD;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x590D;&#x5236;&#x548C; DNA &#x4FEE;&#x590D;&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E0D;&#x540C;&#x4E8E;&#x5927;&#x591A;&#x5728;&#x62DB;&#x8058;&#x6B65;&#x9AA4; ColE1 &#x590D;&#x5236;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E00;&#x7A81;&#x53D8;&#x8DB3;&#x8FF9;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5E94;&#x5E2E;&#x52A9;&#x5EFA;&#x7ACB;&#x4F53;&#x5185;&#xFF0C;&#x5176;&#x4ED6;&#x539F;&#x6838;&#x6216;&#x771F;&#x6838;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5DE5;&#x5177;&#xFF0C;&#x8C03;&#x67E5;&#x5982;&#x4F55;&#x5E8F;&#x5217;&#x62D3;&#x6251;&#x3001; DNA &#x635F;&#x4F24;&#x6216;&#x4E0E;&#x86CB;&#x767D;&#x5408;&#x4F5C;&#x4F19;&#x4F34;&#x7684;&#x4E92;&#x52A8;&#x53EF;&#x80FD;&#x4F1A;&#x5F71;&#x54CD;&#x4E2A;&#x4EBA;&#x7684; DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x6211;&#x5728;&#x9886;&#x5148;&#x548C;&#x843D;&#x540E;&#x7EDE;&#x7EBF;&#x590D;&#x5236;&#x5B9A;&#x4E49;&#x7531; ColE1 &#x8D28;&#x7C92;&#x590D;&#x5236;&#x9AD8;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x7A81;&#x53D8;&#x8DB3;&#x8FF9;&#x7684; DNA &#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

DNA polymerase I (pol I) processes RNA primers during lagging-strand synthesis and fills small gaps during DNA repair reactions. However, it is unclear how pol I and pol III work together during replication and repair or how extensive pol I processing of Okazaki fragments is in vivo. Here, we address these questions by analyzing pol I mutations generated through error-prone replication of ColE1 plasmids. The data were obtained by direct sequencing, allowing an accurate determination of the mutation spectrum and distribution. Pol I's mutational footprint suggests: (i) during leading-strand replication pol I is gradually replaced by pol III over at least 1.3â€‰kb; (ii) pol I processing of Okazaki fragments is limited to âˆ¼20â€‰nt and (iii) the size of Okazaki fragments is short (âˆ¼250â€‰nt). While based on ColE1 plasmid replication, our findings are likely relevant to other pol I replicative processes such as chromosomal replication and DNA repair, which differ from ColE1 replication mostly at the recruitment steps. This mutation footprinting approach should help establish the role of other prokaryotic or eukaryotic polymerases in vivo, and provides a tool to investigate how sequence topology, DNA damage, or interactions with protein partners may affect the function of individual DNA polymerases.

Roles of DNA polymerase I in leading and lagging-strand replication defined by a high-resolution mutation footprint of ColE1 plasmid replication.

L&#x26;#39;ADN polym&#xE9;rase I (Pol I) traite amorces d&#x26;#39;ARN au cours retard brin de synth&#xE8;se et comble les lacunes des petits au cours des r&#xE9;actions r&#xE9;paration de l&#x26;#39;ADN. Cependant, il est difficile de savoir comment pol I et pol III travailler ensemble lors de la r&#xE9;plication et la r&#xE9;paration ou de l&#x26;#39;ampleur pol I traitement des fragments d&#x26;#39;Okazaki est in vivo. Ici, nous abordons ces questions en analysant les mutations pol I g&#xE9;n&#xE9;r&#xE9;s par erreurs de r&#xE9;plication de ColE1 plasmides. Les donn&#xE9;es ont &#xE9;t&#xE9; obtenues par s&#xE9;quen&#xE7;age direct, ce qui permet une d&#xE9;termination pr&#xE9;cise du spectre de mutation et de la distribution. Empreinte mutationnel Pol I sugg&#xE8;re: (i) au cours d&#x26;#39;avant-brin pol r&#xE9;plication I est progressivement remplac&#xE9; par pol III sur au moins 1,3 kb; (ii) pol I traitement des fragments d&#x26;#39;Okazaki est limit&#xE9; &#xE0; ~ 20 nt et (iii) la taille de fragments d&#x26;#39;Okazaki est courte (~ 250 nt). Bien que bas&#xE9; sur la r&#xE9;plication du plasmide ColE1, nos conclusions sont vraisemblablement pertinents &#xE0; d&#x26;#39;autres processus pol r&#xE9;plicatives I telles que la r&#xE9;plication des chromosomes et r&#xE9;paration de l&#x26;#39;ADN, qui diff&#xE8;rent de ColE1 r&#xE9;plication principalement aux &#xE9;tapes du recrutement. Cette approche empreinte de mutation devrait aider &#xE0; &#xE9;tablir le r&#xF4;le d&#x26;#39;autres polym&#xE9;rases procaryotes ou eucaryotes in vivo, et fournit un outil pour &#xE9;tudier comment la topologie s&#xE9;quence, dommages &#xE0; l&#x26;#39;ADN, ou des interactions avec des partenaires prot&#xE9;iques peuvent affecter la fonction des ADN polym&#xE9;rases individuelles.

R&#xF4;les de l&#x26;#39;ADN polym&#xE9;rase I en avance et en retard brin de r&#xE9;plication est d&#xE9;finie par une empreinte Mutation haute r&#xE9;solution de la r&#xE9;plication du plasmide ColE1

DNA-Polymerase I (Pol ich) RNA-Primer verarbeitet, w&auml;hrend Verz&ouml;gerungsstrang Synthese und f&uuml;llt kleine L&uuml;cken w&auml;hrend der DNA-Reparatur-Reaktionen. Es ist jedoch unklar wie Pol ich und Pol III zusammenarbeiten w&auml;hrend der Replikation und Reparatur oder wie umfangreich Pol ich Verarbeitung von Okazaki-Fragmenten ist in-vivo. Hier, wir stellen diese Fragen durch die Analyse von Pol ich Mutationen &uuml;ber fehleranf&auml;llige Replikation von ColE1 Plasmide generiert. Die Daten wurden durch direkte Sequenzierung, erm&ouml;glicht eine genaue Bestimmung der Mutation Spektrum und Verteilung erzielt. Pol-I mutagenen Fu&szlig;abdruck schl&auml;gt: (i) w&auml;hrend der f&uuml;hrenden-Strang Replikation Pol ich allm&auml;hlich ersetzt durch Pol III &uuml;ber mindestens 1,3 kb; (Ii) Pol ich Verarbeitung von Okazaki Fragmente beschr&auml;nkt sich auf &sim;20 nt und (Iii) die Gr&ouml;&szlig;e der Okazaki Fragmente ist kurz (&sim;250 nt). ColE1 Plasmid Replikation zugrunde, unsere Erkenntnisse d&uuml;rften f&uuml;r andere Pol ich replicative verarbeitet solche als Morphologie und DNA-Reparatur, die unterscheiden sich von ColE1 Replikation vor allem auf die Rekrutierung-Schritte. Diese Mutation Fu&szlig;abdruck Ansatz sollte dazu beitragen, die Position der anderen Prokaryoten oder eukaryotic Polymerasen in-vivo etablieren und bietet ein Tool um zu untersuchen, wie die Sequenz Topologie, DNA-Sch&auml;digung oder Interaktionen mit Protein-Partnern die Funktion der einzelnen DNA-Polymerasen auswirken k&ouml;nnen.

Rollen der DNA-Polymerase, die ich in f&uuml;hrenden und Verz&ouml;gerungsstrang Replikation durch hochaufl&ouml;sende Mutation Grundfl&auml;che von ColE1 Plasmid-Replikation definiert.

DNA polimerasi I (pol io) i processi di primer di RNA durante la sintesi del filamento in ritardo e si riempie di piccole lacune durante reazioni di riparazione del DNA. Tuttavia, non &egrave; chiaro come pol io e pol III lavoro insieme durante la replicazione e la riparazione o come vasto pol I elaborazione dei frammenti di Okazaki &egrave; in vivo. Qui, ci rivolgiamo queste domande analizzando pol sono generate tramite replica error-prona di plasmidi ColE1 mutazioni. I dati sono stati ottenuti attraverso il sequenziamento diretto, permettendo una determinazione accurata della spettro di mutazione e della distribuzione. Pol di impronta mutazionale suggerisce: (i) durante pol leader-strand replica &egrave; gradualmente sostituito da pol III sopra almeno 1,3 kb; (ii) pol mi (iii) la dimensione dei frammenti di Okazaki &egrave; breve ed elaborazione di frammenti di Okazaki &egrave; limitato a &sim;20 nt (nt &sim;250). Mentre basate su replica di plasmidi ColE1, i nostri risultati sono probabilmente pertinenti ad altri pol replicativa che elabora tali come replica cromosomica e riparazione del DNA, che differisce dalla replica ColE1 principalmente presso la procedura di reclutamento. Questo approccio di footprinting mutazione dovr&agrave; aiutare a stabilire il ruolo delle altre polimerasi procariotiche o eucariotiche in vivo e fornisce uno strumento per indagare come la topologia di sequenza, danni del DNA o le interazioni con i partner della proteina possono influenzare la funzione della polimerasi del DNA individuale.

Ruoli di polimerasi del DNA per la replica di in ritardo-strand e leader definito da un&#39;impronta di mutazione ad alta risoluzione di replicazione del plasmide ColE1.

I&#xFF08;POL I&#xFF09;DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x30E9;&#x30AE;&#x30F3;&#x30B0;&#x9396;&#x5408;&#x6210;&#x6642;&#x306B;RNA&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x3092;&#x51E6;&#x7406;&#x3057;&#x3001;DNA&#x4FEE;&#x5FA9;&#x53CD;&#x5FDC;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A;&#x9699;&#x9593;&#x3092;&#x57CB;&#x3081;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x304B;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x306F;POL I&#x304A;&#x3088;&#x3073;pol III&#x306F;&#x8907;&#x88FD;&#x3084;&#x4FEE;&#x5FA9;&#x4E2D;&#x306B;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x5E83;&#x7BC4;&#x56F2;&#x306E;&#x30CF;&#x30A6;&#x30C4;&#x30FC;POL&#x79C1;&#x306F;&#x5CA1;&#x5D0E;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x51E6;&#x7406;&#x304C;in vivo&#x3067;&#x3069;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x9023;&#x643A;&#x3059;&#x308B;&#x304B;&#x306F;&#x4E0D;&#x660E;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;ColE1&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x306E;&#x30A8;&#x30E9;&#x30FC;&#x304C;&#x767A;&#x751F;&#x3057;&#x3084;&#x3059;&#x3044;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x751F;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;POL I&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x89E3;&#x6790;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x8CEA;&#x554F;&#x306B;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306F;&#x3001;&#x5909;&#x7570;&#x30B9;&#x30DA;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x3068;&#x5206;&#x5E03;&#x306E;&#x6B63;&#x78BA;&#x306A;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x3001;&#x30C0;&#x30A4;&#x30EC;&#x30AF;&#x30C8;&#x30B7;&#x30FC;&#x30AF;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B9;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x30DD;&#x30EB;I&#x306E;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x30D5;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30C8;&#x304C;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#xFF08;i&#xFF09;&#x79C1;&#x306F;&#x5F90;&#x3005;&#x306B;&#x5C11;&#x306A;&#x304F;&#x3068;&#x3082;1.3&#x30AD;&#x30ED;&#x30D0;&#x30A4;&#x30C8;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x306E;pol III&#x306B;&#x7F6E;&#x304D;&#x63DB;&#x3048;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x30EA;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x9396;&#x306E;&#x8907;&#x88FD;POL&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x3001;&#xFF08;&#x2171;&#xFF09;&#x5CA1;&#x5D0E;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;POL I&#x51E6;&#x7406;&#x304C;&#x301C;20 NT&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#xFF08;&#x2172;&#xFF09;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x306B;&#x5236;&#x9650;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x5CA1;&#x5D0E;&#x65AD;&#x7247;&#xFF08;&#x301C;250 NT&#xFF09;&#x77ED;&#x3044;&#x3067;&#x3059;&#x3002; ColE1&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x8907;&#x88FD;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x9593;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x8ABF;&#x67FB;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x304A;&#x305D;&#x3089;&#x304F;&#x305D;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x4E3B;&#x306B;&#x63A1;&#x7528;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x3067;ColE1&#x8907;&#x88FD;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x67D3;&#x8272;&#x4F53;&#x8907;&#x88FD;&#x3068;DNA&#x4FEE;&#x5FA9;&#x306A;&#x3069;&#x3001;&#x4ED6;&#x306E;pol I&#x8907;&#x88FD;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x306F;&#x30D5;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306F;&#x3001;&#x751F;&#x4F53;&#x5185;&#x3067;&#x4ED6;&#x306E;&#x539F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E;&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3059;&#x308B;&#x306E;&#x306B;&#x5F79;&#x7ACB;&#x3064;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3068;&#x3001;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306E;&#x30C8;&#x30DD;&#x30ED;&#x30B8;&#x3092;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3059;&#x308B;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x3001;DNA&#x640D;&#x50B7;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30D1;&#x30FC;&#x30C8;&#x30CA;&#x30FC;&#x3068;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x3001;&#x500B;&#x3005;&#x306E;DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53CA;&#x307C;&#x3059;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

DNA&#x30DD;&#x30EA;&#x30E1;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x306F;&#x79C1;&#x304C;&#x5148;&#x982D;&#x3068;&#x9045;&#x884C;&#x9396;&#x30EC;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;ColE1&#x30D7;&#x30E9;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C9;&#x8907;&#x88FD;&#x306E;&#x9AD8;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x30D5;&#x30C3;&#x30C8;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30C8;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3055;&#x308C;

Dna &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C; I (pol I) &#xB4A4;&#xC9C0;&#xB294; &#xAC00;&#xB2E5; &#xD569;&#xC131; &#xC911; RNA &#xD504;&#xB77C;&#xC774; &#xBA38; &#xCC98;&#xB9AC; &#xBC0F; DNA &#xBCF5;&#xAD6C; &#xBC18;&#xC751;&#xC744; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xC791;&#xC740; &#xAC04;&#xACA9;&#xC744; &#xCC44;&#xC6C1;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xADF8;&#xAC83;&#xC740; &#xBD84;&#xBA85; pol &#xB098; pol III&#xC5D0; &#xD568;&#xAED8; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xBCF5;&#xC81C; &#xBC0F; &#xBCF5;&#xAD6C; &#xB610;&#xB294; &#xC5BC;&#xB9C8;&#xB098; &#xAD11;&#xBC94;&#xC704; &#xD55C; pol &#xB3D9;&#xC548; &#xB0B4;&#xAC00; &#xC624;&#xCE74;&#xC790;&#xD0A4; &#xC870;&#xAC01;&#xC758; &#xCC98;&#xB9AC;&#xAC00; vivo&#xC5D0;&#xC11C;. &#xD22C;&#xD45C; &#xC18C;&#xB97C; &#xBD84;&#xC11D; &#xD558; &#xC5EC; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xBB38;&#xC81C;&#xB97C; &#xD574;&#xACB0; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC5EC;&#xAE30;, &#xB0B4;&#xAC00; ColE1 &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC;&#xC758; &#xC624;&#xB958;&#xAC00; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xAE30; &#xC26C;&#xC6B4; &#xBCF5;&#xC81C;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;. &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB294; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC2A4;&#xD399;&#xD2B8;&#xB7FC; &#xBD84;&#xD3EC;&#xC758; &#xC815;&#xD655;&#xD55C; &#xACB0;&#xC815;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xB3C4;&#xB85D; &#xC9C1;&#xC811; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1; &#xD558; &#xC5EC; &#xC5BB;&#xC740; &#xD588;&#xB2E4;. Pol mutational &#xBC1C;&#xC790;&#xAD6D; &#xB098;&#xC758; &#xC81C;&#xC548;: (i) &#xD22C;&#xD45C; &#xC18C; &#xC120;&#xB3C4; &#xAC00;&#xB2E5; &#xBCF5;&#xC81C; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xB0B4;&#xAC00; &#xC810;&#xCC28;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC801;&#xC5B4;&#xB3C4; 1.3 kb; &#xD1B5;&#xD574; pol III&#xB85C; &#xBC14;&#xB01D;&#xB2C8;&#xB2E4; (ii) &#xD22C;&#xD45C; &#xC18C; &#xB09C; &#xC624;&#xCE74;&#xC790;&#xD0A4; &#xC870;&#xAC01;&#xC758; &#xCC98;&#xB9AC; &sim;20 nt &#xC81C;&#xD55C; &#xB418;&#xBA70; (iii) &#xC624;&#xCE74;&#xC790;&#xD0A4; &#xC870;&#xAC01;&#xC758; &#xD06C;&#xAE30;&#xB294; &#xC9E7;&#xC740; (&sim;250 nt). ColE1 &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC; &#xBCF5;&#xC81C;&#xC5D0; &#xAE30;&#xBC18;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xACB0;&#xACFC; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xC774; &#xB2E4;&#xB978; &#xD22C;&#xD45C; &#xC18C; &#xAD00;&#xB828; &#xC77C;&#xCC28; &#xB098;&#xB294; &#xB4F1;&#xC744; &#xCC98;&#xB9AC; &#xD558;&#xB294; &#xBAA8;&#xC9D1; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC8FC;&#xB85C; ColE1 &#xBCF5;&#xC81C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E4; &#xC5FC;&#xC0C9;&#xCCB4; &#xBCF5;&#xC81C;&#xC640; DNA &#xC218;&#xB9AC;. &#xC774; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD504;&#xB9B0;&#xD305; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xB2E4;&#xB978; prokaryotic &#xB610;&#xB294; &#xC9C4; &#xD575; &#xD3F4; vivo&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xC124;&#xC815; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xB3C4;&#xC6C0;&#xC774; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xC5B4;&#xB5BB;&#xAC8C; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xD1A0;&#xD3F4;&#xB85C;&#xC9C0;, DNA &#xC190;&#xC0C1;, &#xB610;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD30C;&#xD2B8;&#xB108;&#xC640;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xAC1C;&#xBCC4; DNA &#xD3F4;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC774; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xC870;&#xC0AC; &#xD558;&#xB294; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC120;&#xD589; &#xBC0F; &#xD6C4;&#xD589; &#xAC00;&#xB2E5; &#xBCF5;&#xC81C; &#xB098; ColE1 &#xD50C;&#xB77C;&#xC2A4; &#xBBF8;&#xB4DC; &#xBCF5;&#xC81C;&#xC758; &#xACE0;&#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBC1C;&#xC790;&#xAD6D;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC815;&#xC758; &#xB41C; DNA &#xC911; &#xD569; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xC5ED;&#xD560;.

DNA polimerasa I (Pol I) los procesos de cebadores de RNA durante la s&#xED;ntesis del cap&#xED;tulo de retraso, y llena los vac&#xED;os peque&#xF1;os durante las reacciones de reparaci&#xF3;n del ADN. Sin embargo, no est&#xE1; claro c&#xF3;mo Pol I y III pol trabajar juntos durante la replicaci&#xF3;n y la reparaci&#xF3;n o la forma extensa Pol I de procesamiento de los fragmentos de Okazaki es en vivo. En este sentido, responder a estas preguntas mediante el an&#xE1;lisis de mutaciones pol I generados a trav&#xE9;s de propenso a errores de replicaci&#xF3;n de ColE1 pl&#xE1;smidos. Los datos fueron obtenidos por secuenciaci&#xF3;n directa, lo que permite una determinaci&#xF3;n exacta de la mutaci&#xF3;n del espectro y de distribuci&#xF3;n. Huella mutacional Pol I sugiere: (i) durante l&#xED;der hebra pol replicaci&#xF3;n que es reemplazado gradualmente por pol III durante al menos 1,3 kb, (ii) pol procesamiento I de los fragmentos de Okazaki se limita a ~ 20 nt y (iii) el tama&#xF1;o de fragmentos de Okazaki es corto (~ 250 nt). Aunque se basen en la replicaci&#xF3;n del pl&#xE1;smido ColE1, nuestros resultados probablemente sean aplicables a otros procesos pol replicativa I como la replicaci&#xF3;n de los cromosomas y la reparaci&#xF3;n del ADN, que difieren de la replicaci&#xF3;n ColE1 sobre todo en las etapas de contrataci&#xF3;n. Este enfoque de huellas de mutaci&#xF3;n deber&#xED;a ayudar a establecer el papel de otras polimerasas de procariotas o eucariotas in vivo, y proporciona una herramienta para investigar la forma en la topolog&#xED;a de la secuencia, el da&#xF1;o del ADN, o las interacciones con los socios de prote&#xED;nas puede afectar la funci&#xF3;n de las polimerasas de ADN individuales.

Funciones de la ADN polimerasa I de llevar y de revestimiento de hebra de replicaci&#xF3;n definida por una huella de la mutaci&#xF3;n de alta resoluci&#xF3;n de la replicaci&#xF3;n del pl&#xE1;smido ColE1

Jacob Marquette

Department of Microbiology & Environmental Toxicology

University of California Santa Cruz - UCSC

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Jacob Marquette

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Department of Microbiology & Environmental Toxicology

University of California Santa Cruz - UCSC

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Department of Microbiology & Environmental Toxicology