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Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Arnold School of Public Health, University of South Carolina

&#x7531;&#x4E8E;&#x80DE;&#x5916;&#x805A;&#x5408;&#x7269; &#xFF08;&#x4EE5;&#x4FBF;&#x5728;&#x5E7C;&#x5E74;&#xFF09; &#x548C;&#x76D0;&#x7B49;&#x6291;&#x5236;&#x5242;&#x7684;&#x5B58;&#x5728;&#xFF0C;&#x6700;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x57AB;&#x7814;&#x7A76;&#x4F9D;&#x9760;&#x4E25;&#x9177;&#x76F4;&#x63A5; DNA &#x63D0;&#x53D6;&#x65B9;&#x6CD5;&#x4EA7;&#x751F;&#x51FA;&#x7684;&#x592A;&#x5C0F;&#xFF0C;&#x5927;&#x63D2;&#x5165;&#x8F7D;&#x4F53;&#x514B;&#x9686;&#x7684; DNA &#x7247;&#x6BB5;&#x3002;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x91CF; &#xFF08;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x91CF;&#xFF09; DNA &#x529F;&#x80FD;&#x5B8F;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#x81F3;&#x5173;&#x91CD;&#x8981;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x5927;&#x7684;&#x788E;&#x7247;&#x76EE;&#x524D;&#x611F;&#x5174;&#x8DA3;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x66F4;&#x591A;&#x5730;&#x83B7;&#x5F97;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x91CF; DNA &#x63D0;&#x53D6; EPS &#x5BCC;&#x542B;&#x76D0;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x57AB;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5F97;&#x5230;&#x6539;&#x8FDB;&#x3002;&#x8BAE;&#x5B9A;&#x4E66; &#x300B; &#x4E3A; DNA &#x63D0;&#x53D6;&#x548C;&#x7EAF;&#x5316;&#x805A;&#x4E59;&#x4E8C;&#x9187; (PEG) &#x964D;&#x6C34;&#x8DDF;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5206;&#x79BB;&#x7ED3;&#x5408;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E0E;&#x673A;&#x68B0;&#x548C;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x8BAE;&#x5B9A;&#x4E66; &#x300B; &#x6536;&#x76CA;&#x7387; &gt; 2 &#x5FAE;&#x514B;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x91CF; DNA (&gt; 48 kb) &#x6BCF;&#x514B;&#x57AB;&#x6837;&#x672C;&#xFF0C;&#x4E0E; A260:280 &#x6BD4;&#x7387; &gt; 1.7&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x7528;&#x53D8;&#x6027;&#x68AF;&#x5EA6;&#x51DD;&#x80F6;&#x7535;&#x6CF3;&#x548C;&#x7126;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x6280;&#x672F;&#x7684; 16S rRNA &#x57FA;&#x56E0;&#x5206;&#x6790;&#x8868;&#x660E;&#x672C;&#x8BAE;&#x5B9A;&#x4E66;&#x4EE3;&#x8868; DNA&#x3001; &#x63D0;&#x53D6;&#x7269;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x57AB;&#x793E;&#x533A;&#x4E2D;&#x8F83;&#x9AD8;&#x7684;&#x6574;&#x4F53;&#x8BA1;&#x7B97;&#x7684;&#x591A;&#x6837;&#x6027;&#x6307;&#x6570;&#xFF0C;&#x76F8;&#x6BD4;&#x5176;&#x4ED6;&#x4E09;&#x4E2A;&#x6807;&#x51C6;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684; DNA &#x63D0;&#x53D6;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x663E;&#x793A;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x5B8F;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x5B66;&#x7528;&#x4E8E;&#x786E;&#x4FDD;&#x6700;&#x4F73;&#x6062;&#x590D;&#x7684;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x4E30;&#x5BCC;&#x7684; DNA &#x63D0;&#x53D6;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x91CD;&#x8981;&#x6027;&#x3002;

&#x4ECE;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x57AB;&#x7684;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x91CF; DNA &#x7684;&#x63D0;&#x53D6;&#x3002;

Due to the presence of inhibitors such as extracellular polymeric substances (EPSs) and salts, most microbial mat studies have relied on harsh methods of direct DNA extraction that result in DNA fragments too small for large-insert vector cloning. High molecular weight (HMW) DNA is crucial in functional metagenomic studies, because large fragments present greater access to genes of interest. Here we report improved methodologies for extracting HMW DNA from EPS-rich hypersaline microbial mats. The protocol uses a combination of microbial cell separation with mechanical and chemical methods for DNA extraction and purification followed by precipitation with polyethylene glycol (PEG). The protocol yields >2 Âµg HMW DNA (>48 kb) per gram of mat sample, with A260:280 ratios >1.7. In addition, 16S rRNA gene analysis using denaturing gradient gel electrophoresis and pyrosequencing showed that this protocol extracts representative DNA from microbial mat communities and results in higher overall calculated diversity indices compared with three other standard methods of DNA extraction. Our results show the importance of validating the DNA extraction methods used in metagenomic studies to ensure optimal recovery of microbial richness.

Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats.

En raison de la pr&#xE9;sence d&#x26;#39;inhibiteurs tels que les substances polym&#xE9;riques extracellulaires (EPS) et les sels, les &#xE9;tudes les plus mat microbiennes se sont appuy&#xE9;s sur des m&#xE9;thodes dures d&#x26;#39;extraction directe de l&#x26;#39;ADN qui se traduisent par des fragments d&#x26;#39;ADN trop petit pour le vecteur de clonage &#xE0; grande insert. De haut poids mol&#xE9;culaire (HMW) de l&#x26;#39;ADN est cruciale dans les &#xE9;tudes m&#xE9;tag&#xE9;nomiques fonctionnelles, parce que de gros fragments de pr&#xE9;senter un plus grand acc&#xE8;s &#xE0; des g&#xE8;nes d&#x26;#39;int&#xE9;r&#xEA;t. Nous rapportons ici des m&#xE9;thodologies am&#xE9;lior&#xE9;es pour l&#x26;#39;extraction d&#x26;#39;ADN &#xE0; partir de HMW-EPS riches tapis microbiens hypersalins. Le protocole utilise une combinaison de la s&#xE9;paration des cellules microbiennes avec des m&#xE9;thodes m&#xE9;caniques et chimiques pour l&#x26;#39;extraction et la purification d&#x26;#39;ADN suivie d&#x26;#39;une pr&#xE9;cipitation avec le poly&#xE9;thyl&#xE8;neglycol (PEG). Les rendements du protocole&#x26;gt; 2 ug d&#x26;#39;ADN HMW (&#x26;gt; 48 kb) par gramme d&#x26;#39;&#xE9;chantillon mat, avec A260: 280 rapports&#x26;gt; 1,7. En outre, l&#x26;#39;analyse du g&#xE8;ne 16S ARNr utilisant &#xE9;lectrophor&#xE8;se sur gel d&#xE9;naturant gradient et pyros&#xE9;quen&#xE7;age a montr&#xE9; que ce protocole extrait l&#x26;#39;ADN repr&#xE9;sentant de communaut&#xE9;s microbiennes tapis et des r&#xE9;sultats globaux plus &#xE9;lev&#xE9;s dans les indices de diversit&#xE9; calcul&#xE9;s par rapport &#xE0; trois autres m&#xE9;thodes standard d&#x26;#39;extraction d&#x26;#39;ADN. Nos r&#xE9;sultats montrent l&#x26;#39;importance de la validation des m&#xE9;thodes d&#x26;#39;extraction d&#x26;#39;ADN utilis&#xE9;s dans les &#xE9;tudes m&#xE9;tag&#xE9;nomiques pour assurer une r&#xE9;cup&#xE9;ration optimale de la richesse microbienne.

Extraction d&#x26;#39;ADN haut poids mol&#xE9;culaire de tapis microbiens

Durch die Anwesenheit von Inhibitoren wie extrazellul&auml;rer polymerer Substanzen (EPSs) und Salze haben die meisten mikrobielle Matte Studien auf rauen Methoden der direkten DNA-Extraktion verlassen, die DNA-Fragmente zu klein f&uuml;r gro&szlig;e-Insert Vektor Klonen f&uuml;hren. Hochmolekulare (HMW) DNA ist entscheidend in funktionale durchgef&uuml;hrte metagenomische Studien, weil gro&szlig;e Fragmente besseren Zugang zu den Genen des Interesses zu pr&auml;sentieren. Hier berichten wir &uuml;ber verbesserte Methoden zur Extraktion von HMW-DNA aus EPS-reiche hypersaliner mikrobielle Matten. Das Protokoll verwendet eine Kombination von mikrobiellen Zellseparation mit mechanischen und chemischen Methoden zur DNA-Extraktion und Reinigung mit anschlie&szlig;ender Ausf&auml;llung mit Polyethylenglykol (PEG). Das Protokoll ergibt &gt; 2 &micro;g DNA HMW (&gt; 48KB) pro Gramm Mat Probe mit A260:280-Verh&auml;ltnissen &gt; 1.7. 16S rRNA-gen-Analyse mit Denaturierung Gradienten Gelelektrophorese und Pyrosequencing zeigte au&szlig;erdem, dass dieses Protokoll von Mat Mikrobengemeinschaften und f&uuml;hrt zu h&ouml;heren insgesamt berechneten Vielfalt Indizes verglichen mit drei anderen standard-Methoden der DNA-Extraktion Vertreter DNA extrahiert. Unsere Ergebnisse zeigen die Bedeutung der Validierung der DNA-Extraktion-Methods in durchgef&uuml;hrte metagenomische Studien zur optimalen Regeneration der mikrobiellen Reichtum zu gew&auml;hrleisten.

Extraktion von hochmolekulare DNA von mikrobiellen Matten.

A causa della presenza di inibitori quali sostanze polimeriche extracellulari (EPSs) e sali, studi mat microbici pi&ugrave; hanno contato su duri metodi di estrazione diretta di DNA che si traducono in frammenti di DNA troppo piccoli per grande inserto vettore di clonazione. DNA ad elevato peso molecolare (HMW) &egrave; cruciale negli studi funzionali metagenomica, perch&eacute; grossi frammenti presentano maggiore accesso ai geni di interesse. Qui riportiamo migliorate metodologie per l&#39;estrazione del DNA HMW da tappeti microbici EPS-rich ipersaline. Il protocollo utilizza una combinazione di separazione delle cellule microbiche con metodi meccanici e chimici per l&#39;estrazione del DNA e purificazione seguita da precipitazione con polietilenglicole (PEG). Il protocollo di rendimenti &amp;gt; 2 &micro; g di DNA HMW (&amp;gt; 48 kb) per grammo di campione opaco, con rapporti A260:280 &amp;gt; 1.7. Inoltre, analisi del gene 16S rRNA mediante denaturazione pyrosequencing ed elettroforesi del gel di pendenza ha mostrato che questo protocollo estratti DNA rappresentante dalla comunit&agrave; microbiche mat e risultati pi&ugrave; elevati indici di diversit&agrave; complessiva calcolata confrontato con tre altri metodi standard di estrazione del DNA. I nostri risultati dimostrano l&#39;importanza della convalida i metodi di estrazione del DNA utilizzati negli studi di metagenomica per garantire un recupero ottimale di ricchezza microbica.

Estrazione di alto peso molecolare del DNA da tappeti microbici.

&#x305D;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x7269;&#x8CEA;&#xFF08;EPS&#x306B;&#xFF09;&#x3084;&#x5869;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x306E;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306F;&#x3001;DNA&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x30A4;&#x30F3;&#x30B5;&#x30FC;&#x30C8;&#x30D9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30FC;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x306F;&#x5C0F;&#x3055;&#x3059;&#x304E;&#x308B;&#x65AD;&#x7247;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x76F4;&#x63A5;DNA&#x62BD;&#x51FA;&#x306E;&#x904E;&#x9177;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306B;&#x983C;&#x3063;&#x3066;&#x304D;&#x305F;&#x3002;&#x5927;&#x65AD;&#x7247;&#x306F;&#x3001;&#x76EE;&#x7684;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3078;&#x306E;&#x3088;&#x308A;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30B9;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x3001;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x91CF;&#xFF08;HMW&#xFF09;&#x306E;DNA&#x306F;&#x3001;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x306A;&#x30E1;&#x30BF;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;EPS-&#x8C4A;&#x5BCC;&#x306A;&#x821F;&#x306E;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;HMW DNA&#x3092;&#x62BD;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6539;&#x5584;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;&#x30DD;&#x30EA;&#x30A8;&#x30C1;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B0;&#x30EA;&#x30B3;&#x30FC;&#x30EB;&#xFF08;PEG&#xFF09;&#x6C88;&#x6BBF;&#x306B;&#x7D9A;&#x3044;&#x3066;DNA&#x62BD;&#x51FA;&#x3068;&#x7CBE;&#x88FD;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6A5F;&#x68B0;&#x7684;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x624B;&#x6CD5;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5206;&#x96E2;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306E;&#x5229;&#x56DE;&#x308A;&#x26;gt;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C8;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;1g&#x5F53;&#x305F;&#x308A;2&#x3BC;g&#x306E;HMW DNA&#xFF08;&#x26;gt; 48&#x30AD;&#x30ED;&#x30D0;&#x30A4;&#x30C8;&#xFF09;&#x3001;A260&#x3068;280&#x306E;&#x6BD4;&#x26;gt; 1.7&#x3002;&#x5909;&#x6027;&#x52FE;&#x914D;&#x30B2;&#x30EB;&#x96FB;&#x6C17;&#x6CF3;&#x52D5;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3001;&#x30D1;&#x30A4;&#x30ED;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x52A0;&#x3048;&#x3066;&#x3001;16S rRNA&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5206;&#x6790;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;DNA&#x62BD;&#x51FA;&#x306E;&#x4ED6;&#x306E;3&#x3064;&#x306E;&#x6A19;&#x6E96;&#x7684;&#x306A;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3068;&#x6BD4;&#x3079;&#x3066;&#x3088;&#x308A;&#x9AD8;&#x3044;&#x5168;&#x4F53;&#x306E;&#x8A08;&#x7B97;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x591A;&#x69D8;&#x6027;&#x6307;&#x6A19;&#x306E;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x30DE;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x30B3;&#x30DF;&#x30E5;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x3068;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x304B;&#x3089;&#x4EE3;&#x8868;&#x7684;&#x306A;DNA&#x3092;&#x62BD;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x306A;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x5FAE;&#x751F;&#x7269;&#x306E;&#x8C4A;&#x304B;&#x3055;&#x306E;&#x6700;&#x9069;&#x306A;&#x56DE;&#x5FA9;&#x3092;&#x78BA;&#x5B9F;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x30E1;&#x30BF;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x7528;&#x3044;&#x305F;DNA&#x62BD;&#x51FA;&#x6CD5;&#x3092;&#x691C;&#x8A3C;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

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&#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; &#xACE0;&#xBD84;&#xC790; &#xBB3C;&#xC9C8; (Eps)&#xACFC; &#xC18C;&#xAE08; &#xAC19;&#xC740; &#xC874;&#xC7AC;&#xB85C; &#xC778;&#xD574; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC758; &#xBBF8;&#xC0DD;&#xBB3C; &#xB9E4;&#xD2B8; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; &#xB108;&#xBB34; &#xD070; &#xC0BD;&#xC785; &#xBCA1;&#xD130; &#xD074;&#xB85C;&#xB2DD;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xC791;&#xC740; DNA &#xC870;&#xAC01; &#xADC0;&#xCC29;&#xB418;&#xB294; &#xAC00;&#xD639;&#xD55C; &#xC9C1;&#xC811; DNA &#xCD94;&#xCD9C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD070; &#xC870;&#xAC01; &#xAD00;&#xC2EC;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xB354; &#xC911;&#xB300; &#xD55C; &#xC811;&#xADFC;&#xC744; &#xC81C;&#xC2DC; &#xD558;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xACE0; &#xBD84;&#xC790;&#xB7C9; (HMW) DNA &#xAE30;&#xB2A5; metagenomic &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xC815;&#xC801; &#xC774;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; EPS &#xD48D;&#xBD80;&#xD55C; hypersaline &#xBBF8;&#xC0DD;&#xBB3C; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; HMW DNA&#xB97C; &#xCD94;&#xCD9C; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xBC29;&#xBC95;&#xB860; &#xBCF4;&#xACE0;&#xC11C;. &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C; DNA &#xCD94;&#xCD9C; &#xBC0F; &#xC815;&#xC218; &#xB4A4;&#xC5D0; &#xD3F4; &#xB9AC; &#xC5D0;&#xD2F8;&#xB80C; &#xAE00;&#xB9AC;&#xCF5C; (&#xD398;&#xADF8;)&#xC640; &#xAC15; &#xC218;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAE30;&#xACC4;&#xC801;, &#xD654;&#xD559;&#xC801; &#xBC29;&#xBC95;&#xC73C;&#xB85C; &#xBBF8;&#xC0DD;&#xBB3C; &#xC138;&#xD3EC; &#xBD84;&#xB9AC;&#xC758; &#xC870;&#xD569;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C; &#xC218;&#xC775;&#xB960; &amp;gt; 2 &micro; g HMW DNA (&amp;gt; 48 kb) A260:280 &#xBE44;&#xC728; &#xB9E4;&#xD2B8; &#xC0D8;&#xD50C;&#xC758; &#xADF8;&#xB7A8; &#xB2F9; &amp;gt; 1.7. &#xB610;&#xD55C; 16S rRNA &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBD84;&#xC11D; &#xBCC0;&#xC131; &#xADF8;&#xB77C;&#xB370;&#xC774;&#xC158; &#xC824; &#xC804;&#xAE30; &#xC774;&#xB3D9; &#xBC95; &#xBC0F; pyrosequencing&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;&#xC774; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C; &#xBBF8;&#xC0DD;&#xBB3C; &#xB9E4;&#xD2B8; &#xC0AC;&#xD68C;&#xC640; DNA &#xCD94;&#xCD9C;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0; &#xD45C;&#xC900; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xB354; &#xB192;&#xC740; &#xC804;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; &#xACC4;&#xC0B0;&#xB41C; &#xB2E4;&#xC591;&#xC131; &#xC9C0;&#xD45C; &#xACB0;&#xACFC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xD45C; DNA&#xB97C; &#xCD94;&#xCD9C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; DNA &#xCD94;&#xCD9C; &#xBC29;&#xBC95; metagenomic &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBBF8;&#xC0DD;&#xBB3C; &#xD48D;&#xC694;&#xB85C; &#xC6C0;&#xC758; &#xBCF5;&#xAD6C;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC7A5; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xB294; &#xC720;&#xD6A8;&#xC131; &#xAC80;&#xC0AC;&#xC758; &#xC911;&#xC694;&#xC131;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xBBF8;&#xC0DD;&#xBB3C; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB192;&#xC740; &#xBD84;&#xC790;&#xB7C9; DNA &#xCD94;&#xCD9C;.

Debido a la presencia de inhibidores, tales como sustancias polim&#xE9;ricas extracelulares (EPS) y las sales, los estudios m&#xE1;s estera microbianas se han basado en m&#xE9;todos &#xE1;speros de extracci&#xF3;n directa de ADN que dan lugar a fragmentos de ADN demasiado peque&#xF1;o para vector de clonaci&#xF3;n a gran inserci&#xF3;n. De alto peso molecular (HMW) de ADN es crucial en estudios metagenomic funcionales, porque los fragmentos grandes presentan mayor acceso a los genes de inter&#xE9;s. Aqu&#xED; mostramos metodolog&#xED;as mejoradas para la extracci&#xF3;n de ADN de alto peso molecular de la EPS-ricos tapetes microbianos hipersalinos. El protocolo utiliza una combinaci&#xF3;n de separaci&#xF3;n de c&#xE9;lulas microbianas con m&#xE9;todos mec&#xE1;nicos y qu&#xED;micos para la extracci&#xF3;n y purificaci&#xF3;n del ADN, seguido de precipitaci&#xF3;n con polietilenglicol (PEG). Los rendimientos de protocolo&#x26;gt; 2 g de ADN HMW (&#x26;gt; 48 kb) por gramo de muestra estera, con A260: 280 coeficientes&#x26;gt; 1,7. Adem&#xE1;s, el an&#xE1;lisis del gen 16S ARNr mediante electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante y pirosecuenciaci&#xF3;n puso de manifiesto que este protocolo extrae ADN representante de las comunidades de esteras microbianas y los resultados m&#xE1;s altos en los &#xED;ndices globales de diversidad calculados en comparaci&#xF3;n con los otros tres m&#xE9;todos est&#xE1;ndar de extracci&#xF3;n de ADN. Nuestros resultados muestran la importancia de validar los m&#xE9;todos de extracci&#xF3;n de ADN utilizados en estudios de metagen&#xF3;mica para asegurar una recuperaci&#xF3;n &#xF3;ptima de la riqueza microbiana.

La extracci&#xF3;n de ADN de alto peso molecular a partir de los tapetes microbianos

&#x5E9F;&#x6C34;&#x5904;&#x7406;&#x5382; &#xFF08;&#x6C61;&#x6C34;&#x5904;&#x7406;&#x5382;&#xFF09; &#x6536;&#x96C6;&#x7684;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x3001; &#x5E9F;&#x6C34;&#x5904;&#x7406;&#x7684;&#x7CBE;&#x77FF;&#xFF0C;&#x6CBB;&#x7597;&#x4EBA;&#x4F53;&#x5E9F;&#x7269;&#xFF0C;&#x6700;&#x7EC8;&#x91CA;&#x653E;&#x5230;&#x5F53;&#x5730;&#x7684;&#x73AF;&#x5883;&#x3002;&#x867D;&#x7136;&#x6C61;&#x6C34;&#x5904;&#x7406;&#x5382;&#x6709;&#x6548;&#x7684;&#x53BB;&#x9664;&#x5927;&#x591A;&#x6570;&#x751F;&#x7269;&#x56FA;&#x4F53;&#xFF0C;&#x5B83;&#x8868;&#x660E;&#x8BB8;&#x591A;&#x6297;&#x751F;&#x7D20;&#x548C;&#x6297;&#x751F;&#x7D20;&#x8010;&#x836F;&#x83CC;&#x53EF;&#x4EE5;&#x751F;&#x5B58;&#x7684;&#x5904;&#x7406;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x3002;&#x8981;&#x786E;&#x5B9A;&#x5982;&#x4F55;&#x6C61;&#x6C34;&#x5904;&#x7406;&#x5382;&#x5F71;&#x54CD;&#x6D53;&#x5EA6;&#x548C;&#x6297;&#x751F;&#x7D20;&#x8010;&#x836F;&#x57FA;&#x56E0;&#x5230;&#x73AF;&#x5883;&#x4E2D;&#x4F20;&#x64AD;&#xFF0C;&#x529F;&#x80FD;&#x5B8F;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x662F;&#x7528;&#x6765;&#x6807;&#x8BC6;&#x5728;&#x6C61;&#x6C34;&#x5904;&#x7406;&#x5382;&#x5185;&#x7684;&#x65B0;&#x578B;&#x6297;&#x751F;&#x7D20;&#x8010;&#x836F;&#x57FA;&#x56E0;&#x548C;&#x5B9A;&#x91CF; PCR &#xFF08;qPCR&#xFF09; &#x7528;&#x4E8E;&#x786E;&#x5B9A;&#x8BE5;&#x8BBE;&#x65BD;&#x548C;&#x5F53;&#x5730;&#x7684;&#x6CBF;&#x6D77;&#x751F;&#x6001;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x5185;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x62F7;&#x8D1D;&#x6570;&#x3002;&#x4ECE;&#x57CE;&#x5E02;&#x6C61;&#x6C34;&#x5904;&#x7406;&#x5382;&#x5B8F;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x6587;&#x5E93;&#x4E2D;&#xFF0C;fosmid &#x63D2;&#x5165;&#x5176;&#x4E2D;&#x4E00;&#x4E2A;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x8010;&#x836F;&#x514B;&#x9686; &asymp; 416 &mu; ml(-1) &#x6C28;&#x82C4;&#x9752;&#x9709;&#x7D20; MIC&#xFF09; &#x6392;&#x5E8F;&#xFF0C;&#x7136;&#x540E;&#x6CE8;&#x660E;&#xFF0C;&#x63ED;&#x793A; 33 &#x5047;&#x5B9A;&#x57FA;&#x56E0;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC; 927 bp &#x57FA;&#x56E0;&#x76F8;&#x540C;&#x529F;&#x80FD;&#x7279;&#x8272;&#x7684; &beta;-&#x5185;&#x9170;&#x80FA;&#x9176;&#x7684;&#x91D1;&#x9EC4;&#x8272;&#x8461;&#x8404;&#x7403;&#x83CC;&#x7535;&#x8111; 1 42%&#x3002;&#x9694;&#x79BB;&#x548C;&#x4E9A;&#x514B;&#x9686;&#x7684;&#x8FD9;&#x79CD;&#x57FA;&#x56E0;&#xFF0C;&#x79F0;&#x4E3A; bla(M-1)&#xFF0C;&#x8D4B;&#x4E88;&#x5176;&#x5927;&#x80A0;&#x57C3;&#x5E0C;&#x6C0F;&#x5927;&#x80A0;&#x6746;&#x83CC;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x7684;&#x6C28;&#x82C4;&#x9752;&#x9709;&#x7D20;&#x6297;&#x6027;&#x3002;&#x65F6;&#x5F52;&#x5377;&#xFF0C;qPCR &#x5728;&#x521D;&#x671F;&#x6CBB;&#x7597;&#x9636;&#x6BB5;&#xFF0C;&#x4F46;&#x4E0B;&#x8DCC; 2 &#x500D;&#x6D53;&#x5EA6;&#x5728;&#x6700;&#x540E;&#x5904;&#x7406;&#x9636;&#x6BB5;&#x671F;&#x95F4;&#x663E;&#x793A; bla(M-1) &#x7684;&#x6D53;&#x5EA6;&#x589E;&#x52A0;&#x3002;&#x5728;&#x6574;&#x4E2A;&#x57CE;&#x5E02;&#x6C61;&#x6C34;&#x5904;&#x7406;&#x5382;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x4ECE;&#x8FDB;&#x6C34;&#x5230;&#x51FA;&#x6C34;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;bla(M-1) &#x4F7F;&#x4E86;&#x5F88;&#x5927;&#x4E00;&#x90E8;&#x5206;&#x88AB;&#x91CA;&#x653E;&#x5230;&#x6CBF;&#x6D77;&#x751F;&#x6001;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x6574;&#x4F53;&#x9057;&#x4F20;&#x6750;&#x6599;&#x589E;&#x52A0;&#x6D53;&#x5EA6; ng(-1) DNA&#x3002;&#x4F30;&#x8BA1;&#x5E73;&#x5747;&#x6D41;&#x91CF;&#x4E3A;&#x6BCF;&#x5929;&#x91CA;&#x653E;&#x5230;&#x8FD9;&#x4E2A;&#x6CBF;&#x6D77;&#x751F;&#x6001;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684; bla(M-1) &#x57FA;&#x56E0; 3.9 &times; 10(14) &#x526F;&#x672C;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x57FA;&#x56E0;&#x6307;&#x51FA;&#x6240;&#x6709;&#x91C7;&#x6837;&#x6CBF;&#x6D77;&#x6C34;&#x548C;&#x6C89;&#x79EF;&#x7269;&#x6837;&#x54C1;&#x5468;&#x56F4;&#x8BBE;&#x65BD;&#x4E2D;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x6C61;&#x6C34;&#x5904;&#x7406;&#x5382;&#x53EF;&#x80FD;&#x5230;&#x73AF;&#x5883;&#x65B0;&#x578B;&#x6297;&#x751F;&#x7D20;&#x8010;&#x836F;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x4F20;&#x64AD;&#x9014;&#x5F84;&#x3002;

&#x5B9A;&#x6027;&#x548C;&#x5B9A;&#x91CF;&#x7684;&#x5E9F;&#x6C34;&#x5904;&#x7406;&#x8BBE;&#x65BD;&#x548C;&#x5468;&#x56F4;&#x7684;&#x6CBF;&#x6D77;&#x751F;&#x6001;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x4E2D;&#x627E;&#x5230;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B0;&#x578B; &beta;-&#x5185;&#x9170;&#x80FA;&#x9176;&#x57FA;&#x56E0;&#x3002;

Wastewater treatment plants (WWTPs) are engineered structures that collect, concentrate, and treat human waste, ultimately releasing treated wastewater into local environments. While WWTPs efficiently remove most biosolids, it has been shown that many antibiotics and antibiotic-resistant bacteria can survive the treatment process. To determine how WWTPs influence the concentration and dissemination of antibiotic-resistant genes into the environment, a functional metagenomic approach was used to identify a novel antibiotic resistance gene within a WWTP, and quantitative PCR (qPCR) was used to determine gene copy numbers within the facility and the local coastal ecosystem. From the WWTP metagenomic library, the fosmid insert contained in one highly resistant clone (MIC, â‰ˆ 416 Î¼g ml(-1) ampicillin) was sequenced and annotated, revealing 33 putative genes, including a 927-bp gene that is 42% identical to a functionally characterized Î²-lactamase from Staphylococcus aureus PC1. Isolation and subcloning of this gene, referred to as bla(M-1), conferred ampicillin resistance to its Escherichia coli host. When normalized to volume, qPCR showed increased concentrations of bla(M-1) during initial treatment stages but 2-fold-decreased concentrations during the final treatment stage. The concentration ng(-1) DNA increased throughout the WWTP process from influent to effluent, suggesting that bla(M-1) makes up a significant proportion of the overall genetic material being released into the coastal ecosystem. Average discharge was estimated to be 3.9 Ã— 10(14) copies of the bla(M-1) gene released daily into this coastal ecosystem. Furthermore, the gene was observed in all sampled coastal water and sediment samples surrounding the facility. Our results suggest that WWTPs may be a pathway for the dissemination of novel antibiotic resistance genes into the environment.

Characterization and quantitation of a novel Î²-lactamase gene found in a wastewater treatment facility and the surrounding coastal ecosystem.

Les stations d&#x26;#39;&#xE9;puration (STEP) sont des structures d&#x26;#39;ing&#xE9;nierie qui recueillent, se concentrer, et de traiter les d&#xE9;chets d&#x26;#39;origine humaine, en fin de compte la lib&#xE9;ration des eaux us&#xE9;es trait&#xE9;es dans des environnements locaux. Alors que les stations d&#x26;#39;&#xE9;puration &#xE9;liminent efficacement la plupart des biosolides, il a &#xE9;t&#xE9; montr&#xE9; que de nombreux antibiotiques et les bact&#xE9;ries r&#xE9;sistantes aux antibiotiques peuvent survivre au processus de traitement. Pour d&#xE9;terminer comment les stations d&#x26;#39;&#xE9;puration influence sur la concentration et la diffusion de g&#xE8;nes r&#xE9;sistants aux antibiotiques dans l&#x26;#39;environnement, une approche m&#xE9;tag&#xE9;nomique fonctionnelle a &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9;e pour identifier un g&#xE8;ne de r&#xE9;sistance aux antibiotiques dans les roman une station d&#x26;#39;&#xE9;puration, et PCR quantitative (qPCR) a &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9; pour d&#xE9;terminer le nombre de copies du g&#xE8;ne dans le installation et de l&#x26;#39;&#xE9;cosyst&#xE8;me c&#xF4;tier local. De la biblioth&#xE8;que m&#xE9;tag&#xE9;nomique station d&#x26;#39;&#xE9;puration, l&#x26;#39;insert fosmide contenue dans un clone tr&#xE8;s r&#xE9;sistant (CMI, ug ml &#x2248; 416 (-1) &#xE0; l&#x26;#39;ampicilline) a &#xE9;t&#xE9; s&#xE9;quenc&#xE9; et annot&#xE9;, r&#xE9;v&#xE9;lant 33 g&#xE8;nes putatifs, y compris un g&#xE8;ne 927-pb qui est de 42% identique &#xE0; une caract&#xE9;risation fonctionnelle &#x3B2;-lactamase de PC1 Staphylococcus aureus. L&#x26;#39;isolement et le sous-clonage de ce g&#xE8;ne, appel&#xE9; bla (M-1), conf&#xE8;re r&#xE9;sistance &#xE0; l&#x26;#39;ampicilline &#xE0; son h&#xF4;te Escherichia coli. Lorsque normalis&#xE9;e au volume, qPCR a montr&#xE9; des concentrations accrues de bla (M-1) au cours des &#xE9;tapes de traitement initial, mais de 2 fois-une diminution des concentrations au cours de la phase de traitement final. La concentration ng (-1) d&#x26;#39;ADN a augment&#xE9; tout au long du processus de station d&#x26;#39;&#xE9;puration de l&#x26;#39;influent &#xE0; l&#x26;#39;effluent, ce qui sugg&#xE8;re que bla (M-1) repr&#xE9;sente une proportion importante de la mati&#xE8;re g&#xE9;n&#xE9;tique globale d&#x26;#39;&#xEA;tre rejet&#xE9;es dans l&#x26;#39;&#xE9;cosyst&#xE8;me c&#xF4;tier. D&#xE9;charge moyenne a &#xE9;t&#xE9; estim&#xE9;e &#xE0; 3,9 &#xD7; 10 (14) exemplaires de la bla (M-1) du g&#xE8;ne lib&#xE9;r&#xE9;s chaque jour dans cet &#xE9;cosyst&#xE8;me c&#xF4;tier. En outre, le g&#xE8;ne a &#xE9;t&#xE9; observ&#xE9;e dans tous les &#xE9;chantillons d&#x26;#39;eau c&#xF4;ti&#xE8;re et des &#xE9;chantillons de s&#xE9;diments entourant l&#x26;#39;&#xE9;tablissement. Nos r&#xE9;sultats sugg&#xE8;rent que les stations d&#x26;#39;&#xE9;puration peut &#xEA;tre une voie pour la diffusion de nouveaux g&#xE8;nes de r&#xE9;sistance aux antibiotiques dans l&#x26;#39;environnement.

Caract&#xE9;risation et quantification d&#x26;#39;un roman &#x3B2;-lactamase g&#xE8;ne qui se trouve dans une installation de traitement des eaux us&#xE9;es et l&#x26;#39;&#xE9;cosyst&#xE8;me environnant c&#xF4;tier

Abwasserbehandlungsanlagen (Kl&auml;ranlagen) sind ver&auml;nderter Strukturen, die sammeln, Konzentrat und menschliche Abf&auml;lle behandeln, letztlich die Freigabe behandelt Abwasser in lokalen Umgebungen. W&auml;hrend Kl&auml;ranlagen effizient die meisten Kl&auml;rd&uuml;nger entfernen, hat sich gezeigt, dass viele Antibiotika und Antibiotika-resistente Bakterien den Behandlungsprozess &uuml;berleben k&ouml;nnen. Um zu bestimmen, wie Kl&auml;ranlagen Einfluss der Konzentration und Verbreitung von Antibiotika-resistente Gene in die Umwelt, ein funktionale durchgef&uuml;hrte metagenomische Ansatz verwendet, um ein neuartiger Antibiotika-Resistenz-Gen in einer Kl&auml;ranlage zu identifizieren und quantitative war wurde die PCR (qPCR) zur gen Kopie Zahlen innerhalb der Anlage und des lokalen K&uuml;sten-&Ouml;kosystems zu ermitteln. Aus der Kl&auml;ranlage durchgef&uuml;hrte metagenomische Bibliothek auch Fosmid Insert enthalten in einem hochresistent Klon (MIC, &asymp; 416 &mu;g ml(-1) Ampicillin) wurde sequenziert und mit Anmerkungen versehen, 33 vermeintliche Gene, offenbart ein 927-bp-gen, die 42 % mit einer funktional charakterisiert &beta;-Lactamase von Staphylococcus Aureus PC1 identisch ist. Isolierung und Subklonierung dieses Gens, genannt bla(M-1), &uuml;bertragenen Ampicillin-Resistenz zu seinem Escherichia-coli-Host. Wenn Sie Volume normalisiert, zeigte qPCR erh&ouml;hte Konzentrationen von bla(M-1) w&auml;hrend Anfangsbehandlung Stufen aber 2 8-fach-verringerte Konzentration w&auml;hrend der Endbehandlung-Phase. Die Konzentration ng(-1) DNA erh&ouml;ht w&auml;hrend des gesamten Prozesses vom Zulauf Kl&auml;ranlage, Abwasser, was darauf hindeutet, dass ein erheblicher Anteil der insgesamt genetisches Material in die K&uuml;stenstadt &Ouml;kosystem gelangt dieses bla(M-1) bildet. Mittlere Wasserf&uuml;hrung wurde gesch&auml;tzt, um 3,9 &times; 10 Kopien des Gens bla(M-1) t&auml;glich in dieser K&uuml;stenstadt &Ouml;kosystem freigesetzt werden. Dar&uuml;ber hinaus wurde das Gen in allen aufgenommenen K&uuml;stengew&auml;sser und Sedimentproben, die rund um die Anlage beobachtet. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass Kl&auml;ranlagen m&ouml;glicherweise einen Weg f&uuml;r die Verbreitung neuartiger Antibiotika-Resistenz-Gene in die Umwelt.

Charakterisierung und Quantifizierung eines neuartigen &beta;-Lactamase-Gens gefunden in einer Kl&auml;ranlage und des umliegenden K&uuml;sten-&Ouml;kosystems.

Impianti di trattamento delle acque reflue (WWTPs) sono strutture ingegnerizzate che raccolgono, concentrato e trattare rifiuti umani, rilasciando alla fine trattamento delle acque reflue in ambienti locali. Mentre WWTPs efficientemente rimuovere biosolidi la maggior parte, &egrave; stato dimostrato che molti antibiotici e batteri antibiotico-resistenti possono sopravvivere al processo di trattamento. Per determinare come WWTPs influenza la concentrazione e la diffusione dei geni antibiotico-resistenti nell&#39;ambiente, un approccio funzionale metagenomica &egrave; stato usato per identificare un gene di resistenza agli antibiotici romanzo all&#39;interno di un trattamento delle acque reflue e quantitative PCR (qPCR) &egrave; stato utilizzato per determinare il numero di copie del gene all&#39;interno della struttura e dell&#39;ecosistema costiero locale. Dalla libreria metagenomica WWTP, l&#39;inserto fosmid contenuta in uno clone altamente resistenti (MIC, &asymp; 416 &mu;g ml(-1) ampicillina) &egrave; stato sequenziato e annotato, rivelando 33 putativi geni, tra cui un gene 927-bp che &egrave; identico a un &beta;-lattamasi funzionalmente caratterizzato da Staphylococcus aureus PC1 al 42%. Isolamento e subcloning di questo gene, denominato bla(M-1), conferito resistenza ampicillina al suo ospite di Escherichia coli. Quando normalizzato a volume, qPCR mostrato aumento delle concentrazioni di bla(M-1) nella fase di trattamento iniziale ma concentrazioni diminuito a 2 volte durante la fase finale del trattamento. La concentrazione ng(-1) DNA aumentato durante tutto il processo di trattamento delle acque reflue da influenti per effluenti, suggerendo che bla(M-1) costituisce una parte significativa del materiale genetico in generale essere rilasciato nell&#39;ecosistema costiero. Portata media &egrave; stata stimata per essere 3,9 &times; 10(14) copie del gene bla(M-1) pubblicato quotidianamente in questo ecosistema costiero. Inoltre, il gene &egrave; stato osservato in tutte le acque costiere campionate e campioni di sedimento che circonda la struttura. I nostri risultati suggeriscono che WWTPs pu&ograve; essere un percorso per la diffusione dei geni di resistenza antibiotica romanzo nell&#39;ambiente.

Caratterizzazione e quantificazione di un gene della &beta;-lattamasi romanzo trovato in un impianto di trattamento delle acque reflue e il circostante ecosistema costiero.

&#x5EC3;&#x6C34;&#x51E6;&#x7406;&#x30D7;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C8;&#xFF08;WWTPs&#xFF09;&#x304C;&#x53CE;&#x96C6;&#x3001;&#x96C6;&#x4E2D;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x5EC3;&#x68C4;&#x7269;&#x3092;&#x6271;&#x3044;&#x3001;&#x6700;&#x7D42;&#x7684;&#x306B;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30EB;&#x74B0;&#x5883;&#x306B;&#x4E0B;&#x6C34;&#x51E6;&#x7406;&#x6C34;&#x3092;&#x653E;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x8A2D;&#x8A08;&#x69CB;&#x9020;&#x3067;&#x3059;&#x3002; WWTPs&#x304C;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x30BD;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C9;&#x3092;&#x524A;&#x9664;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x591A;&#x304F;&#x306E;&#x6297;&#x751F;&#x7269;&#x8CEA;&#x3068;&#x6297;&#x751F;&#x7269;&#x8CEA;&#x8010;&#x6027;&#x83CC;&#x306F;&#x3001;&#x6CBB;&#x7642;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x3092;&#x751F;&#x304D;&#x6B8B;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002; WWTPs&#x306F;&#x3001;&#x74B0;&#x5883;&#x3078;&#x306E;&#x6297;&#x751F;&#x7269;&#x8CEA;&#x8010;&#x6027;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3068;&#x666E;&#x53CA;&#x3092;&#x3069;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3059;&#x308B;&#x304B;&#x3092;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x306A;&#x30E1;&#x30BF;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306F;WWTP&#x5185;&#x306E;&#x5C0F;&#x8AAC;&#x306E;&#x6297;&#x751F;&#x7269;&#x8CEA;&#x8010;&#x6027;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x5B9A;&#x91CF;PCR&#xFF08;qPCR&#xFF09;&#x306F;&#x5185;&#x3067;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30B3;&#x30D4;&#x30FC;&#x6570;&#x3092;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x65BD;&#x8A2D;&#x3068;&#x5730;&#x5143;&#x306E;&#x6CBF;&#x5CB8;&#x751F;&#x614B;&#x7CFB;&#x3002; WWTP&#x30E1;&#x30BF;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x30FC;&#x3001;&#x301C;42&#xFF05;&#x540C;&#x4E00;&#x3067;&#x3042;&#x308B;927 bp&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x542B;&#x3080;33&#x306E;&#x63A8;&#x5B9A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3059;&#x308B;1&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x8010;&#x6027;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30F3;&#xFF08;MIC&#x3001;&#x2248;416&#x3BC;g&#x306E;ML&#xFF08;-1&#xFF09;&#x30A2;&#x30F3;&#x30D4;&#x30B7;&#x30EA;&#x30F3;&#xFF09;&#x306E;&#x5869;&#x57FA;&#x914D;&#x5217;&#x3092;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3057;&#x3001;&#x6CE8;&#x91C8;&#x3092;&#x4ED8;&#x3051;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x4E2D;&#x306B;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x308B;fosmid&#x30A4;&#x30F3;&#x30B5;&#x30FC;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x306B;&#x9EC4;&#x8272;&#x30D6;&#x30C9;&#x30A6;&#x7403;&#x83CC;&#x306E;PC1&#x304B;&#x3089;&#x3B2;-&#x30E9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30DE;&#x30FC;&#x30BC;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x3068;&#x3059;&#x308B;&#x3002; BLA&#xFF08;M-1&#xFF09;&#x3068;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x308B;&#x3053;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x5358;&#x96E2;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30B5;&#x30D6;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5927;&#x8178;&#x83CC;&#x5BBF;&#x4E3B;&#x306B;&#x30A2;&#x30F3;&#x30D4;&#x30B7;&#x30EA;&#x30F3;&#x8010;&#x6027;&#x3092;&#x4ED8;&#x4E0E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30DC;&#x30EA;&#x30E5;&#x30FC;&#x30E0;&#x3078;&#x306E;&#x6B63;&#x898F;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3068;&#x304D;&#x306B;&#x3001;&#x5B9A;&#x91CF;PCR&#x306F;&#x3001;&#x521D;&#x671F;&#x6CBB;&#x7642;&#x306E;&#x6BB5;&#x968E;&#x3067;BLA&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x6FC3;&#x5EA6;&#xFF08;M-1&#xFF09;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x6700;&#x7D42;&#x51E6;&#x7406;&#x6BB5;&#x968E;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3092;2&#x500D; - &#x306F;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x306E;NG&#xFF08;-1&#xFF09;DNA&#x306F;&#x3001;bla&#xFF08;M-1&#xFF09;&#x6CBF;&#x5CB8;&#x751F;&#x614B;&#x7CFB;&#x306B;&#x653E;&#x51FA;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x5168;&#x4F53;&#x7684;&#x306A;&#x907A;&#x4F1D;&#x7269;&#x8CEA;&#x306E;&#x304B;&#x306A;&#x308A;&#x306E;&#x5272;&#x5408;&#x3092;&#x5360;&#x3081;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3001;&#x6392;&#x6C34;&#x3078;&#x306E;&#x6D41;&#x5165;&#x304B;&#x3089;WWTP&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x3092;&#x901A;&#x3057;&#x3066;&#x5897;&#x52A0;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5E73;&#x5747;&#x6D41;&#x91CF;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x6CBF;&#x5CB8;&#x751F;&#x614B;&#x7CFB;&#x306B;&#x6BCE;&#x65E5;&#x30EA;&#x30EA;&#x30FC;&#x30B9;BLA&#xFF08;M-1&#xFF09;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;3.9&#xD7;10&#xFF08;14&#xFF09;&#x306E;&#x30B3;&#x30D4;&#x30FC;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3068;&#x63A8;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306F;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6CBF;&#x5CB8;&#x6C34;&#x3068;&#x65BD;&#x8A2D;&#x3092;&#x56F2;&#x3080;&#x5E95;&#x8CEA;&#x8A66;&#x6599;&#x3067;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;WWTPs&#x306F;&#x3001;&#x74B0;&#x5883;&#x3078;&#x306E;&#x65B0;&#x305F;&#x306A;&#x6297;&#x751F;&#x7269;&#x8CEA;&#x8010;&#x6027;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x666E;&#x53CA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x5506;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;

&#x6392;&#x6C34;&#x51E6;&#x7406;&#x65BD;&#x8A2D;&#x3068;&#x5468;&#x8FBA;&#x6CBF;&#x5CB8;&#x751F;&#x614B;&#x7CFB;&#x3067;&#x767A;&#x898B;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x65B0;&#x898F;&#x3B2;-&#x30E9;&#x30AF;&#x30BF;&#x30DE;&#x30FC;&#x30BC;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x7279;&#x6027;&#x3068;&#x5B9A;&#x91CF;

&#xD3D0;&#xC218; &#xCC98;&#xB9AC; &#xACF5;&#xC7A5; (WWTPs) &#xC124;&#xACC4; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xC218;&#xC9D1; &#xD558;&#xB294;, &#xC9D1;&#xC911;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xAD81;&#xADF9;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD480;&#xC5B4; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xD3D0;&#xAE30;&#xBB3C; &#xB85C;&#xCEEC; &#xD658;&#xACBD;&#xC5D0; &#xD3D0;&#xC218;&#xB97C; &#xCC98;&#xB9AC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. WWTPs &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC758; biosolids&#xB97C; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC81C;&#xAC70; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xADF8;&#xAC83;&#xC740; &#xB9CE;&#xC740; &#xD56D;&#xC0DD;&#xC81C;&#xC640; &#xD56D;&#xC0DD;&#xC81C; &#xB0B4;&#xC131; &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC544; &#xCE58;&#xB8CC; &#xACFC;&#xC815;&#xC744; &#xC0B4;&#xC544;&#xB0A8;&#xC744; &#xC218; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5B4;&#xB5BB;&#xAC8C; WWTPs &#xC601;&#xD5A5; &#xB18D;&#xB3C4; &#xBC0F; &#xD658;&#xACBD;&#xC5D0; &#xD56D;&#xC0DD;&#xC81C; &#xB0B4;&#xC131; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xBCF4;&#xAE09;, &#xAE30;&#xB2A5; metagenomic &#xC811;&#xADFC; &#xC5C8;&#xB294; &#xD3D0;&#xC218;&#xCC98;&#xB9AC; &#xC7A5; &#xB0B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xD56D;&#xC0DD;&#xC81C; &#xC800;&#xD56D; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xACE0; &#xC591;&#xC801; PCR (qPCR) &#xC2DC;&#xC124;&#xACFC; &#xC9C0;&#xC5ED; &#xD574;&#xC548; &#xC0DD;&#xD0DC;&#xACC4; &#xB0B4;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBCF5;&#xC0AC;&#xBCF8; &#xC218;&#xB97C; &#xD655;&#xC778; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xD3D0;&#xC218;&#xCC98;&#xB9AC; &#xC7A5; metagenomic &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xC5D0;&#xC11C; 33 &#xC0C1; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xB4DC;&#xB7EC;&#xB0B4;&#xB294; &#xD558;&#xB098;&#xC758; &#xB0B4;&#xC131; clone (&#xB9C8;&#xC774;&#xD06C;, &asymp; 416 &mu;g ml(-1) &#xC554; &#xD53C; &#xC2E4;&#xB9B0;)&#xB294; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xBC0F; &#xC8FC;&#xC11D;, &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; fosmid &#xC0BD;&#xC785; 42% &#xD669;&#xC0C9; &#xD3EC;&#xB3C4;&#xC0C1;&#xAD6C;&#xADE0; p c 1&#xC5D0;&#xC11C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB77D; &#xD0C0; &#xB9C8;&#xB97C; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC774; &beta;-&#xC81C; &#xB3D9;&#xC77C; 927-bp &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xC5EC;. &#xACE0;&#xB9BD;&#xACFC; subcloning bla(M-1), &#xB77C;&#xACE0; &#xD558;&#xB294;&#xC774; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC554; &#xD53C; &#xC2E4;&#xB9B0; &#xC800;&#xD56D; Escherichia&#xC758; &#xB300;&#xC7A5;&#xADE0; &#xC219;&#xC8FC;&#xC5D0; &#xAC8C; &#xC218; &#xC5EC;. &#xBCFC;&#xB968;&#xC744; &#xC815;&#xADDC;&#xD654; &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0; qPCR &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9; &#xCC98;&#xB9AC; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB18D;&#xB3C4; 2 &#xBC30; &#xAC10;&#xC18C; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xCD08;&#xAE30; &#xCE58;&#xB8CC; &#xB2E8;&#xACC4; &#xB3D9;&#xC548; bla(m-1)&#xC758; &#xC99D;&#xAC00; &#xB18D;&#xB3C4; &#xBCF4;&#xC600;&#xB2E4;. DNA &#xB18D;&#xB3C4; ng(-1) &#xC720;&#xCD9C;, &#xADF8; bla(m-1)&#xC740; &#xD574;&#xC548; &#xC0DD;&#xD0DC;&#xACC4;&#xC5D0; &#xCD9C;&#xC2DC; &#xB418; &#xACE0; &#xC804;&#xBC18;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC720;&#xC804; &#xBB3C;&#xC9C8;&#xC758; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xBE44;&#xC728;&#xC774; &#xAD6C;&#xC131; &#xC81C;&#xC548;&#xC5D0; &#xD615;&#xC131;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD3D0;&#xC218;&#xCC98;&#xB9AC; &#xC7A5; &#xACFC;&#xC815; &#xC804;&#xBC18;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; &#xC99D;&#xAC00; &#xD588;&#xB2E4;. &#xD3C9;&#xADE0; &#xBC29;&#xC804;&#xC774; &#xD574;&#xC548; &#xC0DD;&#xD0DC;&#xACC4;&#xC5D0; &#xB9E4;&#xC77C; &#xBC1C;&#xD45C; &#xD558;&#xB294; bla(M-1) &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; 3.9 &times; 10(14) &#xBCF5;&#xC0AC;&#xBCF8; &#xCD94;&#xC815; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xC0D8;&#xD50C;&#xB9C1; &#xB41C; &#xD574;&#xC548; &#xBB3C;&#xACFC; &#xCE68;&#xC804; &#xBB3C; &#xC0D8;&#xD50C; &#xC2DC;&#xC124; &#xC8FC;&#xBCC0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; WWTPs &#xD658;&#xACBD;&#xC5D0; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xD56D; &#xC0DD; &#xC800;&#xD56D; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xBCF4;&#xAE09;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xACBD;&#xB85C; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xD2B9;&#xC131;&#xD654; &#xBC0F; &#xD3D0;&#xC218; &#xCC98;&#xB9AC; &#xC2DC;&#xC124; &#xBC0F; &#xC8FC;&#xBCC0; &#xD574;&#xC548; &#xC0DD;&#xD0DC;&#xACC4;&#xC5D0; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &beta;-&#xB77D; &#xD0C0; &#xB9C8; &#xC81C; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC815;&#xB7C9;.

Plantas de tratamiento de aguas residuales (EDAR) son estructuras de ingenier&#xED;a que se acumulan, se concentran y tratan los desechos humanos, en &#xFA;ltima instancia, la liberaci&#xF3;n de las aguas residuales tratadas en los entornos locales. Mientras EDAR eficientemente eliminar la mayor&#xED;a de los bios&#xF3;lidos, se ha demostrado que muchos antibi&#xF3;ticos y bacterias resistentes a los antibi&#xF3;ticos pueden sobrevivir al proceso de tratamiento. Para determinar c&#xF3;mo EDAR influyen en la concentraci&#xF3;n y la difusi&#xF3;n de los genes resistentes a los antibi&#xF3;ticos en el medio ambiente, un enfoque metagen&#xF3;mica funcional se utiliza para identificar un nuevo gen de resistencia antibi&#xF3;tica dentro de una planta depuradora, y la PCR cuantitativa (qPCR) se utiliz&#xF3; para determinar el n&#xFA;mero de copias del gen dentro del las instalaciones y el ecosistema costero local. Desde la biblioteca metagen&#xF3;mica EDAR, la inserci&#xF3;n fosmid contenida en un clon de alta resistencia (MIC, &#x2248; 416 mg ml (-1) a la ampicilina) fue secuenciado y anotado, dejando al descubierto 33 genes putativos, incluyendo un gen de 927 pb que es 42% id&#xE9;ntica a la uno caracterizado funcionalmente &#x3B2;-lactamasa de PC1 Staphylococcus aureus. El aislamiento y la subclonaci&#xF3;n de este gen, denominado bla (M-1), confiere resistencia a la ampicilina a su hu&#xE9;sped de Escherichia coli. Cuando se normaliza el volumen, qPCR mostraron mayores concentraciones de bla (M-1) durante las etapas iniciales del tratamiento, sino dos veces-disminuci&#xF3;n de las concentraciones durante la etapa de tratamiento final. La concentraci&#xF3;n de ng (-1) ADN aument&#xF3; durante todo el proceso de la EDAR del afluente de aguas residuales, lo que sugiere que bla (M-1) constituye una parte importante del material gen&#xE9;tico total que se liberan en el ecosistema costero. Descarga promedio se estim&#xF3; en 3.9 &#xD7; 10 (14) copias de la bla (M-1) de genes publicadas diariamente en este ecosistema costero. Adem&#xE1;s, el gen se observa en todas muestras de agua costera y muestras de sedimentos en torno a la instalaci&#xF3;n. Nuestros resultados sugieren que las EDAR puede ser una v&#xED;a para la difusi&#xF3;n de nuevos genes de resistencia a antibi&#xF3;ticos en el medio ambiente.

Caracterizaci&#xF3;n y cuantificaci&#xF3;n de una novela de &#x3B2;-lactamasa de genes encontrados en una planta de tratamiento de aguas residuales y el ecosistema de la regi&#xF3;n costera

Erin B. Fichot

Department of Environmental Health Sciences

Arnold School of Public Health, University of South Carolina

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Erin B. Fichot

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Department of Environmental Health Sciences

Arnold School of Public Health, University of South Carolina

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Department of Environmental Health Sciences