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Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Royal Institute of Technology

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&#x9009;&#x5B9A;&#x7684;&#x6B63;&#x4EA4;&#x4EB2;&#x548C;&#x7EAF;&#x5316;&#x7684;&#x5C0F;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;

A novel protein domain with dual affinity has been created by randomization and selection. The small alkali-stabilized albumin-binding domain (ABD*), used as scaffold to construct the library, has affinity to human serum albumin (HSA) and is constituted of 46 amino acids of which 11 were randomized. To achieve a dual binder, the binding site of the inherent HSA affinity was untouched and the randomization was made on the opposite side of the molecule. Despite its small size and randomization of almost a quarter of its amino acids, a bifunctional molecule, ABDz1, with ability to bind to both HSA and the Z2 domain/protein A was successfully selected using phage display. Moreover, the newly selected variant showed improved affinity for HSA compared to the parental molecule. This novel protein domain has been characterized regarding secondary structure and affinity to the two different ligands. The possibility for affinity purification on two different matrices has been investigated using the two ligands, the HSA matrix and the protein A-based, MabSelect SuRe matrix, and the new protein domain was purified to homogeneity. Furthermore, gene fusions between the new domain and three different target proteins with different characteristics were made. To take advantage of both affinities, a purification strategy referred to as orthogonal affinity purification using two different matrices was created. Successful purification of all three versions was efficiently carried out using this strategy.

A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification.

Une nouvelle prot&#xE9;ine de domaine avec une affinit&#xE9; double a &#xE9;t&#xE9; cr&#xE9;&#xE9; par la randomisation et la s&#xE9;lection. Le petit alcali-albumine stabilis&#xE9; domaine de liaison (ABD *), utilis&#xE9; comme &#xE9;chafaudage pour construire la biblioth&#xE8;que, poss&#xE8;de une affinit&#xE9; pour l&#x26;#39;albumine s&#xE9;rique humaine (HSA) et est constitu&#xE9; de 46 acides amin&#xE9;s dont 11 ont &#xE9;t&#xE9; randomis&#xE9;s. Pour atteindre un liant double, le site de liaison de l&#x26;#39;affinit&#xE9; inh&#xE9;rente SAH a &#xE9;t&#xE9; touch&#xE9; et le randomisation est faite sur le c&#xF4;t&#xE9; oppos&#xE9; de la mol&#xE9;cule. Malgr&#xE9; sa petite taille et la randomisation de pr&#xE8;s d&#x26;#39;un quart de ses acides amin&#xE9;s, une mol&#xE9;cule bifonctionnelle, ABDz1, avec la capacit&#xE9; de se lier &#xE0; la fois HSA et le domaine Z2 / prot&#xE9;ine A a &#xE9;t&#xE9; s&#xE9;lectionn&#xE9; &#xE0; l&#x26;#39;aide avec succ&#xE8;s phage display. En outre, le variant nouvellement s&#xE9;lectionn&#xE9; montr&#xE9; affinit&#xE9; am&#xE9;lior&#xE9;e de la SAH par rapport &#xE0; la mol&#xE9;cule parentale. Ce domaine nouvelle prot&#xE9;ine a &#xE9;t&#xE9; caract&#xE9;ris&#xE9;e en ce qui concerne la structure secondaire et de l&#x26;#39;affinit&#xE9; pour les deux ligands diff&#xE9;rents. La possibilit&#xE9; pour la purification d&#x26;#39;affinit&#xE9; sur deux matrices diff&#xE9;rentes a &#xE9;t&#xE9; &#xE9;tudi&#xE9;e en utilisant les deux ligands, la matrice HSA et la prot&#xE9;ine A-base, la matrice MabSelect s&#xFB;r, et le domaine de la prot&#xE9;ine nouvelle a &#xE9;t&#xE9; purifi&#xE9;e jusqu&#x26;#39;&#xE0; homog&#xE9;n&#xE9;it&#xE9;. En outre, des fusions de g&#xE8;nes entre le nouveau domaine et trois prot&#xE9;ines cibles diff&#xE9;rentes avec des caract&#xE9;ristiques diff&#xE9;rentes ont &#xE9;t&#xE9; faites. Pour profiter de ces deux affinit&#xE9;s, une strat&#xE9;gie de purification appel&#xE9; la purification par affinit&#xE9; orthogonale en utilisant deux matrices diff&#xE9;rentes a &#xE9;t&#xE9; cr&#xE9;&#xE9;. Purification r&#xE9;ussie de tous les trois versions a &#xE9;t&#xE9; efficacement r&#xE9;alis&#xE9;e en utilisant cette strat&#xE9;gie.

Une petite prot&#xE9;ine bisp&#xE9;cifique S&#xE9;lectionn&#xE9; pour Purification par affinit&#xE9; orthogonale

Eine neuartige Protein-Dom&auml;ne mit dual Affinit&auml;t wurde durch Randomisierung und Auswahl erstellt. Die kleine Alkali stabilisierten Albumin-bindende Dom&auml;ne (ABD *), als Ger&uuml;st verwendet, um die Bibliothek zu konstruieren hat Affinit&auml;t zum menschlichen Serum-Albumin (HSA) und konstituiert sich aus 46 Aminos&auml;uren, von denen 11 randomisiert wurden. Um eine duale-Sammelmappe zu erreichen, wurde die Bindungsstelle der inh&auml;renten HSA-Affinit&auml;t unber&uuml;hrt und die Randomisierung wurde auf der gegen&uuml;berliegenden Seite des Molek&uuml;ls. Trotz seiner geringen Gr&ouml;&szlig;e und Randomisierung von fast ein Viertel seiner Aminos&auml;uren, ein Bifunktionelles Molek&uuml;l, ABDz1, mit M&ouml;glichkeit zum Binden an HSA und Z2 Dom&auml;ne/Protein A erfolgreich w&auml;hlte Phagen-Display verwenden. Dar&uuml;ber hinaus zeigte die neu ausgew&auml;hlte Variante verbesserte Affinit&auml;t f&uuml;r HSA im Vergleich zu den elterlichen Molek&uuml;l. Diese neuartige Protein-Dom&auml;ne war bez&uuml;glich Sekund&auml;rstruktur und Affinit&auml;t zu zwei unterschiedlichen Liganden charakterisiert. Die M&ouml;glichkeit der Affinit&auml;tsreinigung auf zwei verschiedenen Matrizen wurde untersucht mit zwei Liganden, der HSA-Matrix und das Protein A-basierte, MabSelect SuRe Matrix und die neue Proteindom&auml;ne zur Homogenit&auml;t gereinigt wurde. Dar&uuml;ber hinaus erfolgten gen Fusionen zwischen der neuen Dom&auml;ne und drei unterschiedliche Ziel-Proteine mit unterschiedlichen Eigenschaften. Um beide Affinit&auml;ten zu nutzen, entstand eine Reinigung-Strategie als orthogonale Affinit&auml;tsreinigung mit zwei verschiedene Matrizen bezeichnet. Erfolgreiche Reinigung aller drei Versionen wurde effizient durchgef&uuml;hrt, mit dieser Strategie.

Eine kleine Bispezifischer-Protein f&uuml;r orthogonale Affinit&auml;tsreinigung ausgew&auml;hlt.

Un dominio della proteina romanzo con doppia affinit&agrave; &egrave; stato creato da selezione e randomizzazione. Il piccolo stabilizzato alcali albumina-associazione dominio (ABD *), utilizzato come impalcatura per costruire la libreria, ha affinit&agrave; di albumina di siero umano (HSA) ed &egrave; costituito da 46 amminoacidi di cui 11 sono stati randomizzati. Per ottenere un legante dual, il sito di legame dell&#39;intrinseca affinit&agrave; HSA era intatto e la randomizzazione &egrave; stata effettuata sul lato opposto della molecola. Nonostante la sua piccola dimensione e la randomizzazione di quasi un quarto dei suoi amminoacidi, una molecola bifunzionale, ABDz1, con capacit&agrave; di legarsi sia HSA e il dominio di Z2/proteina A &egrave; stato selezionato utilizzando phage display. Inoltre, la variante appena selezionata ha mostrato una migliore affinit&agrave; per HSA rispetto alla molecola parentale. Questo dominio romanzo della proteina &egrave; stato caratterizzato per quanto riguarda la struttura secondaria e affinit&agrave; per i ligandi diversi due. La possibilit&agrave; per la purificazione di affinit&agrave; su due matrici diverse &egrave; stata studiata utilizzando i due ligandi, la matrice di HSA e la proteina A-based, MabSelect certo matrix e il nuovo dominio proteico &egrave; stato purificato di omogeneit&agrave;. Inoltre, sono state fatte fusioni del gene fra il nuovo dominio e tre proteine bersaglio differenti con caratteristiche diverse. Per sfruttare i vantaggi di entrambi affinit&agrave;, &egrave; stata creata una strategia di purificazione come purificazione di affinit&agrave; ortogonale utilizzando due diverse matrici. Successo purificazione di tutte le tre versioni &egrave; stato effettuato in modo efficiente usando questa strategia.

Una proteina piccola bispecific selezionata per la purificazione di affinit&agrave; ortogonale.

&#x30C7;&#x30E5;&#x30A2;&#x30EB;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x65B0;&#x898F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x5316;&#x3068;&#x9078;&#x629E;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x4F5C;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x30FC;&#x3092;&#x69CB;&#x7BC9;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8DB3;&#x5834;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x5C0F;&#x578B;&#x306E;&#x30A2;&#x30EB;&#x30AB;&#x30EA;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#xFF08;ABD *&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#xFF08;HSA&#xFF09;&#x30D2;&#x30C8;&#x8840;&#x6E05;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x3068;&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x304A;&#x308A;&#x3001;11&#x306F;&#x7121;&#x4F5C;&#x70BA;&#x306B;&#x5272;&#x308A;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x3046;&#x3061;46&#x500B;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x3067;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x30C7;&#x30E5;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C0;&#x30FC;&#x3092;&#x9054;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x56FA;&#x6709;&#x306E;HSA&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306F;&#x305D;&#x306E;&#x307E;&#x307E;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x5316;&#x306F;&#x3001;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x53CD;&#x5BFE;&#x5074;&#x306B;&#x884C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x305D;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x306E;&#x307B;&#x307C;4&#x5206;&#x306E;1&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30BA;&#x304C;&#x5C0F;&#x3055;&#x3044;&#x3068;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x5316;&#x3001;&#x4E8C;&#x5B98;&#x80FD;&#x6027;&#x5206;&#x5B50;&#x3001;ABDz1&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;HSA&#x3068;Z2&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;/&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x80FD;&#x529B;&#x3067;&#x6B63;&#x5E38;&#x306B;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30C7;&#x30A3;&#x30B9;&#x30D7;&#x30EC;&#x30A4;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x9078;&#x629E;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x65B0;&#x3057;&#x304F;&#x9078;&#x629E;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;&#x89AA;&#x5206;&#x5B50;&#x306B;&#x6BD4;&#x3079;&#x3066;HSA&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x6539;&#x826F;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x65B0;&#x898F;&#x306A;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x4E8C;&#x6B21;&#x69CB;&#x9020;&#x3001;2&#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x306E;&#x7279;&#x5FB4;&#x3068;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E8C;&#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x4E0A;&#x306E;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x30FC;&#x7CBE;&#x88FD;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;MabSelect&#x78BA;&#x304B;&#x306B;&#x884C;&#x5217;&#x306F;&#x3001;2&#x3064;&#x306E;&#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;HSA&#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3068;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x3092;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x304A;&#x308A;&#x3001;&#x65B0;&#x305F;&#x306A;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x304C;&#x5747;&#x4E00;&#x306B;&#x306A;&#x308B;&#x307E;&#x3067;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x7279;&#x6027;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3068;3&#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x6A19;&#x7684;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x878D;&#x5408;&#x304C;&#x884C;&#x308F;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x4E21;&#x65B9;&#x3068;&#x3082;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x6D3B;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x7CBE;&#x88FD;&#x6226;&#x7565;&#x306F;&#x3001;2&#x3064;&#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x884C;&#x5217;&#x304C;&#x4F5C;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x76F4;&#x4EA4;&#x3059;&#x308B;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x30FC;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3068;&#x3082;&#x547C;&#x3070;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002; 3&#x3064;&#x306E;&#x30D0;&#x30FC;&#x30B8;&#x30E7;&#x30F3;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x6210;&#x529F;&#x3057;&#x305F;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3092;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x3053;&#x306E;&#x6226;&#x7565;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x884C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;

&#x76F4;&#x4EA4;&#x30A2;&#x30D5;&#x30A3;&#x30CB;&#x30C6;&#x30A3;&#x30FC;&#x7CBE;&#x88FD;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x9078;&#x629E;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x5C0F;&#x578B;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;

&#xC774;&#xC911; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC18C;&#xC124; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xB79C;&#xB364; &#xBC0F; &#xC120;&#xD0DD;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC0DD;&#xC131; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC791;&#xC740; &#xC54C;&#xCE7C;&#xB9AC; &#xC548;&#xC815;&#xD654; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; (ABD *) &#xBE44; &#xACC4;&#xB85C; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xB97C; &#xB9CC;&#xB4DC;&#xB294; &#xB370; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC778;&#xAC04; &#xD608; &#xCCAD; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; (HSA)&#xB97C; &#xC788;&#xC73C;&#xBA70; 11 &#xBB34;&#xC791;&#xC704;&#xB85C; &#xD588;&#xB2E4;&#xB294; 46 &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0;&#xC758; &#xAD6C;&#xC131;. &#xB4C0;&#xC5BC; &#xBC14;&#xC778;&#xB354;&#xB97C; &#xB2EC;&#xC131; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xACE0;&#xC720;&#xC758; HSA &#xC120;&#xD638;&#xB3C4;&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xAC10;&#xB3D9; &#xD588;&#xB2E4;&#xC640; &#xB79C;&#xB364; &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xBC18;&#xB300;&#xD3B8;&#xC5D0; &#xB9CC;&#xB4E4;&#xC5B4;&#xC84C;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xAC83;&#xC758; &#xC791;&#xC740; &#xD06C;&#xAE30;&#xC640; &#xB79C;&#xB364; bifunctional &#xBD84;&#xC790;&#xC758; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0;&#xC758; &#xAC70;&#xC758; 4 &#xBD84;&#xC758;&#xC5D0; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0; ABDz1, HSA&#xC640; Z2 &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;/&#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; A &#xBAA8;&#xB450;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xAC8C; &#xB41C;&#xB294; &#xC131;&#xACF5;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC120;&#xD0DD; &#xC0B4; &#xADE0; &#xC18C; &#xB514;&#xC2A4;&#xD50C;&#xB808;&#xC774; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC0C8;&#xB85C; &#xC120;&#xD0DD;&#xD55C; &#xBCC0;&#xD615; &#xBD80;&#xBAA8;&#xC758; &#xBD84;&#xC790;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; HSA&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xBCF4;&#xC600;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBE44; &#xBC1C;&#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; 2 &#xCC28; &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xC11C;&#xB85C; &#xB2E4;&#xB978; ligands &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xAD00;&#xD55C; &#xD2B9;&#xC9D5; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; ligands, HSA &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xCE5C; &#xD654;&#xB825; &#xC815;&#xD654;&#xB97C; &#xC704;&#xD55C; &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131; &#xC870;&#xC0AC; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; A &#xAE30;&#xBC18; MabSelect &#xBB3C;&#xB860; &#xD589;&#xB82C;&#xACFC; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xB3D9;&#xC9C8;&#xC131;&#xC744; &#xC815;&#xD654; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC0C8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xBC0F; &#xB2E4;&#xB978; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xAC00;&#xC9C4; 3 &#xAC1C;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xB300;&#xC0C1; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xC720;&#xC804;&#xC790; fusions &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xB450; &#xB3D9;&#xC9C8;&#xC131;&#xC744; &#xD65C;&#xC6A9; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xB450; &#xB2E4;&#xB978; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC9C1;&#xAC01; &#xCE5C; &#xD654;&#xB825; &#xC815;&#xD654; &#xB77C;&#xACE0; &#xC815;&#xD654; &#xC804;&#xB7B5;&#xC744; &#xB9CC;&#xB4E4;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBAA8;&#xB4E0; &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBC84;&#xC804;&#xC758; &#xC131;&#xACF5;&#xC801;&#xC778; &#xC815;&#xD654;&#xAC00;&#xC774; &#xC804;&#xB7B5;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC218;&#xD589; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;.

&#xC9C1;&#xAD50; &#xCE5C; &#xD654;&#xB825; &#xC815;&#xD654;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC120;&#xC815; &#xC791;&#xC740; bispecific &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;.

Un dominio de nueva prote&#xED;na, con una afinidad dual ha sido creado por la asignaci&#xF3;n al azar y la selecci&#xF3;n. El peque&#xF1;o alcalino-estabilizada de alb&#xFA;mina dominio de uni&#xF3;n (ABD *), utilizado como andamio para construir la biblioteca, tiene una afinidad para la alb&#xFA;mina s&#xE9;rica humana (HSA) y est&#xE1; constituido por 46 amino&#xE1;cidos de los cuales 11 fueron asignados al azar. Para lograr un aglutinante dual, el sitio de uni&#xF3;n de la afinidad inherente HSA estaba intacta y la aleatorizaci&#xF3;n se hizo en el lado opuesto de la mol&#xE9;cula. A pesar de su peque&#xF1;o tama&#xF1;o y la aleatorizaci&#xF3;n de casi un cuarto de sus amino&#xE1;cidos, una mol&#xE9;cula bifuncional, ABDz1, con capacidad para unirse a ambos HSA y el dominio Z2 / prote&#xED;na A se seleccion&#xF3; utilizando con &#xE9;xito de fagos. Adem&#xE1;s, la variante reci&#xE9;n seleccionada mostr&#xF3; afinidad mejorada para HSA en comparaci&#xF3;n con la mol&#xE9;cula parental. Este dominio nueva prote&#xED;na se ha caracterizado con respecto a la estructura secundaria y la afinidad de los dos ligandos diferentes. La posibilidad para la purificaci&#xF3;n de afinidad en dos matrices diferentes ha sido investigada utilizando los dos ligandos, la matriz de HSA y la prote&#xED;na A-basado, matriz MabSelect Claro, y el dominio nueva prote&#xED;na se purific&#xF3; hasta la homogeneidad. Por otra parte, las fusiones de genes entre el nuevo dominio y tres prote&#xED;nas diana diferentes con caracter&#xED;sticas diferentes se hicieron. Para aprovechar las ventajas de ambos afinidades, una estrategia de purificaci&#xF3;n conocido como purificaci&#xF3;n por afinidad ortogonal con dos diferentes matrices se ha creado. La purificaci&#xF3;n exitosa de las tres versiones se llev&#xF3; a cabo de manera eficiente utilizando esta estrategia.

Una peque&#xF1;a prote&#xED;na biespec&#xED;fico seleccionados para purificaci&#xF3;n por afinidad ortogonal

&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x6297;&#x4F53;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x975E;&#x514D;&#x75AB;&#x7403;&#x86CB;&#x767D;&#x57FA;&#x4E8E;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x4EB2;&#x548C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x88AB;&#x8BA4;&#x4E3A;&#x5177;&#x6709;&#x5F88;&#x9AD8;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x672A;&#x6765;&#x4E2D;&#x5E94;&#x7528;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B0;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6781;&#x5C0F;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x7EC4;&#x6210;&#x7684;&#x4EC5;&#x6709;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7ED3;&#x6784;&#x57DF;&#x7684;&#x4E00;&#x4EE3;&#x3002;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x80BF;&#x7624;&#x574F;&#x6B7B;&#x56E0;&#x5B50;-&alpha; (TNF-&alpha;) &#x5230;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x57DF;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x540C;&#x65F6;&#x4ECD;&#x4FDD;&#x7559;&#x539F;&#x59CB;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x4E3A;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x5BFC;&#x81F4;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x7EC4;&#x6210;&#x7684;&#x53EA;&#x662F; 46 &#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x3002;&#x975E;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x4E00;&#x4FA7;&#x7684;&#x4E09;&#x87BA;&#x65CB;&#x675F;&#x57DF;&#x540D;&#xFF0C;&#xFF0C;&#x7136;&#x540E;&#x663E;&#x793A;&#x7ED3;&#x679C;&#x5E93;&#x5BF9;&#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x9897;&#x7C92;&#xFF0C;&#x591A;&#x6837;&#x5316;&#x7684;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x5355;&#x7ED3;&#x6784;&#x57DF;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x662F;&#x5B64;&#x7ACB;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E0E;&#x80BF;&#x7624;&#x574F;&#x6B7B;&#x56E0;&#x5B50;-&alpha; &#x7684;&#x9009;&#x62E9;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x76EE;&#x6807;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x57FA;&#x4E8E;&#x4ECE;&#x566C;&#x83CC;&#x4F53;&#x9009;&#x62E9;&#x83B7;&#x5F97;&#x5E8F;&#x5217;&#xFF0C;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x4EE3;&#x5E93;&#x65E8;&#x5728;&#x4E3A;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x589E;&#x52A0;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x7684;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x5019;&#x9009;&#x4EBA;&#x3002;&#x91D1;&#x9EC4;&#x8272;&#x8461;&#x8404;&#x7403;&#x83CC;&#x8868;&#x9762;&#x663E;&#x793A;&#x88AB;&#x96C7;&#x7528;&#x7684;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x6210;&#x719F;&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x5728;&#x540C;&#x4E00;&#x9009;&#x62E9;&#x76EE;&#x6807;&#x5468;&#x671F;&#x4F7F;&#x6539;&#x8FDB;&#x8054;&#x7F16;&#x7A0B;&#x5E8F;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x57FA;&#x4E8E;&#x591A;&#x53C2;&#x6570;&#x7684;&#x6392;&#x5E8F;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0E;&#x80BF;&#x7624;&#x574F;&#x6B7B;&#x56E0;&#x5B50;-&alpha; &#x548C;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x9AD8;&#x6548;&#x5206;&#x79BB;&#x3002;&#x5B64;&#x7ACB;&#x7684;&#x53D8;&#x79CD;&#x88AB;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x548C;&#x5206;&#x6790;&#x7684;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x548C;&#x80BF;&#x7624;&#x574F;&#x6B7B;&#x56E0;&#x5B50;-&alpha; &#x7684;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x4E86;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x5206;&#x6790;&#x63ED;&#x793A;&#x80BF;&#x7624;&#x574F;&#x6B7B;&#x56E0;&#x5B50;-&alpha; &#x7684;&#x4EB2;&#x548C;&#x6027;&#xFF0C;&#x4F4E;&#x4E8E; 5 nM &#x7684;&#x6700;&#x5F3A;&#x7684;&#x7C98;&#x5408;&#x5242;&#x3002;&#x4ECE;&#x591A;&#x53C2;&#x6570;&#x8FDB;&#x884C;&#x6392;&#x5E8F;&#x540C;&#x65F6;&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x7684;&#x80BF;&#x7624;&#x574F;&#x6B7B;&#x56E0;&#x5B50;-&alpha; &#x548C;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x51E0;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x5019;&#x9009;&#x4EBA;&#x5B64;&#x7ACB;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A;&#x6297;&#x539F;&#x7684;&#x9AD8;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#xFF0C;&#x8868;&#x660E;&#x8BE5;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x663E;&#x793A;&#x8367;&#x5149;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5206;&#x9009;&#x7684;&#x7ED3;&#x5408;&#x662F;&#x53CC;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x9002;&#x7528;&#x6280;&#x672F;&#x3002;&#x5C31;&#x6211;&#x4EEC;&#x6240;&#x77E5;&#xFF0C;&#x65B0;&#x8054;&#x7F16;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x4EE3;&#x8868;&#x62A5;&#x544A;&#x5230;&#x76EE;&#x524D;&#x4E3A;&#x6B62;&#x7684;&#x6700;&#x5C0F;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x53CC;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x3002;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x548C;&#x6311;&#x6218;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B0;&#x578B;&#x6218;&#x7565;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x672A;&#x6765;&#x7684;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x3002;

&#x5DE5;&#x7A0B;&#x53CC;&#x5230;&#x5355;&#x4E2A;&#x57DF;&#x4E2D;&#x767D;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x5408;&#x3002;

Bispecific antibodies as well as non-immunoglobulin based bispecific affinity proteins are considered to have a very high potential in future biotherapeutic applications. In this study, we report on a novel approach for generation of extremely small bispecific proteins comprised of only a single structural domain. Binding to tumor necrosis factor-Î± (TNF-Î±) was engineered into an albumin-binding domain while still retaining the original affinity for albumin, resulting in a bispecific protein composed of merely 46 amino acids. By diversification of the non albumin-binding side of the three-helix bundle domain, followed by display of the resulting library on phage particles, bispecific single-domain proteins were isolated using selections with TNF-Î± as target. Moreover, based on the obtained sequences from the phage selection, a second-generation library was designed in order to further increase the affinity of the bispecific candidates. Staphylococcal surface display was employed for the affinity maturation, enabling efficient isolation of improved binders as well as multiparameter-based sortings with both TNF-Î± and albumin as targets in the same selection cycle. Isolated variants were sequenced and the binding to albumin and TNF-Î± was analyzed. This analysis revealed an affinity for TNF-Î± below 5 nM for the strongest binders. From the multiparameter sorting that simultaneously targeted TNF-Î± and albumin, several bispecific candidates were isolated with high affinity to both antigens, suggesting that cell display in combination with fluorescence activated cell sorting is a suitable technology for engineering of bispecificity. To our knowledge, the new binders represent the smallest engineered bispecific proteins reported so far. Possibilities and challenges as well as potential future applications of this novel strategy are discussed.

Engineering bispecificity into a single albumin-binding domain.

Des anticorps bisp&#xE9;cifiques ainsi que non-immunoglobulines &#xE0; base de prot&#xE9;ines d&#x26;#39;affinit&#xE9; bisp&#xE9;cifiques sont consid&#xE9;r&#xE9;s comme ayant un tr&#xE8;s fort potentiel dans les futures applications bioth&#xE9;rapeutiques. Dans cette &#xE9;tude, nous pr&#xE9;sentons une nouvelle approche pour la g&#xE9;n&#xE9;ration de tr&#xE8;s petites prot&#xE9;ines bisp&#xE9;cifiques comprenant un seul domaine structurel. La liaison &#xE0; facteur de n&#xE9;crose tumorale &#x3B1;-(TNF-&#x3B1;) a &#xE9;t&#xE9; con&#xE7;u dans un domaine liant l&#x26;#39;albumine, tout en conservant l&#x26;#39;affinit&#xE9; pour l&#x26;#39;albumine d&#x26;#39;origine, r&#xE9;sultant en une prot&#xE9;ine compos&#xE9;e de seulement bisp&#xE9;cifique 46 acides amin&#xE9;s. Par la diversification de la non liant l&#x26;#39;albumine c&#xF4;t&#xE9; du domaine faisceau de trois h&#xE9;lices, suivie par l&#x26;#39;affichage de la biblioth&#xE8;que en r&#xE9;sulte sur les particules de phage, bisp&#xE9;cifiques &#xE0; domaine unique prot&#xE9;ines ont &#xE9;t&#xE9; isol&#xE9;es &#xE0; l&#x26;#39;aide des s&#xE9;lections avec le TNF-&#x3B1; comme cible. En outre, sur la base des s&#xE9;quences obtenues &#xE0; partir de la s&#xE9;lection du phage, une biblioth&#xE8;que de deuxi&#xE8;me g&#xE9;n&#xE9;ration a &#xE9;t&#xE9; con&#xE7;u en outre pour augmenter l&#x26;#39;affinit&#xE9; des candidats bisp&#xE9;cifiques. La surface d&#x26;#39;affichage staphylococcique a &#xE9;t&#xE9; employ&#xE9; pour la maturation d&#x26;#39;affinit&#xE9;, permettant d&#x26;#39;isoler efficacement liants am&#xE9;lior&#xE9;s ainsi que multiparam&#xE9;trique &#xE0; base de tris &#xE0; la fois avec le TNF-&#x3B1; et de l&#x26;#39;albumine comme cibles dans le cycle de s&#xE9;lection m&#xEA;me. Variantes isol&#xE9;es ont &#xE9;t&#xE9; s&#xE9;quenc&#xE9;s et la liaison &#xE0; l&#x26;#39;albumine et de TNF-&#x3B1; a &#xE9;t&#xE9; analys&#xE9;e. Cette analyse a r&#xE9;v&#xE9;l&#xE9; une affinit&#xE9; pour le TNF-&#x3B1; en dessous de 5 nM pour les plus forts liants. De la multiparam&#xE9;trique de tri qui, simultan&#xE9;ment, le TNF-&#x3B1; cibl&#xE9; et de l&#x26;#39;albumine, plusieurs candidats ont &#xE9;t&#xE9; isol&#xE9;s bisp&#xE9;cifiques avec une forte affinit&#xE9; pour les deux antig&#xE8;nes, ce qui sugg&#xE8;re que la cellule d&#x26;#39;affichage en combinaison avec le tri des cellules activ&#xE9; par fluorescence est une technologie appropri&#xE9;e pour l&#x26;#39;ing&#xE9;nierie des bispecificity. &#xC0; notre connaissance, les nouveaux liants repr&#xE9;sentent les plus petites d&#x26;#39;ing&#xE9;nierie des prot&#xE9;ines bisp&#xE9;cifiques signal&#xE9;s jusqu&#x26;#39;&#xE0; pr&#xE9;sent. Les possibilit&#xE9;s et les d&#xE9;fis ainsi que les applications futures potentielles de cette nouvelle strat&#xE9;gie sont discut&#xE9;s.

Bispecificity g&#xE9;nie dans un unique liant l&#x26;#39;albumine de domaine

Bispezifischer Antik&ouml;rper als auch nicht-Immunglobulin basierend Bispezifischer Affinit&auml;t Proteine werden als eine sehr hohe k&uuml;nftig biotherapeutische Anwendungsm&ouml;glichkeiten haben. In dieser Studie berichten wir &uuml;ber einen neuen Ansatz zur Generierung von extrem kleinen Bispezifischer Proteine bestehen aus nur einer einzigen strukturellen Dom&auml;ne. Bindung an Tumor-Nekrose-Faktor-&alpha; (TNF-&alpha;) wurde in eine Dom&auml;ne im Eiwei&szlig;-Bindung entwickelt, w&auml;hrend noch die Beibehaltung der urspr&uuml;nglichen Affinit&auml;t f&uuml;r Albumin, wodurch ein Bispezifischer Protein setzt sich aus lediglich 46 Aminos&auml;uren. Durch Diversifikation der unverbindlichen Albumin-Seite des drei-Helix-B&uuml;ndel Dom&auml;ne, gefolgt vom Display der resultierende Bibliothek auf Bakteriophagenpartikel wurden Bispezifischer einzelnen Dom&auml;ne Proteine isoliert mit Auswahlen mit TNF-&alpha; als Ziel. Dar&uuml;ber hinaus wurde auf der Grundlage der erhaltenen Sequenzen aus der Phage-Auswahl, eine zweite Generation Bibliothek entworfen um die Affinit&auml;t der Bispezifischer Kandidaten zu steigern. Staphylokokken Oberfl&auml;che Display war f&uuml;r die Affinit&auml;t-Reifung, erm&ouml;glicht effiziente Isolierung verbesserte Bindemittel sowie Multiparameter-basierte Sortings mit TNF-&alpha; und Albumin als Ziele in der gleichen Auswahl Zyklus besch&auml;ftigt. Isolierte Varianten wurden sequenziert und die Bindung an Albumin und TNF-&alpha; wurde analysiert. Diese Analyse ergab eine Affinit&auml;t f&uuml;r TNF-&alpha; unter 5 nM f&uuml;r die st&auml;rkste Bindemittel. Aus der Multiparameter sortieren, dass mehrere Bispezifischer Kandidaten gleichzeitig gezielte TNF-&alpha; und Albumin, isoliert mit hoher Affinit&auml;t zu beide Antigene waren, was darauf hindeutet, dass Zelle ist Display in Kombination mit Fluoreszenz aktivierten Zellsortierung eine geeignete Technologie f&uuml;r Engineering von Bispecificity. Unseres Wissens darstellen der neuen Bindemittel die kleinste ver&auml;nderter Bispezifischer Proteine wurden bisher beschrieben. M&ouml;glichkeiten und Herausforderungen sowie m&ouml;gliche zuk&uuml;nftige Anwendungen dieser neuartige Strategie werden diskutiert.

Ingenieur-Bispecificity in eine einzige Dom&auml;ne Albumin-Bindung.

Anticorpi Bispecific cos&igrave; come proteine affinit&agrave; non-immunoglobulina bispecific base sono considerate avere una molto alta in futuro bioterapeutici potenziali applicazioni. In questo studio, riportiamo su un approccio innovativo per la generazione di proteine estremamente piccolo bispecific composto da un singolo dominio strutturale. Associazione al fattore di necrosi tumorale-&alpha; (TNF-&alpha;) &egrave; stato progettato in un dominio di albumina-Associazione pur mantenendo l&#39;originale affinit&agrave; per l&#39;albumina, proteina risultante in un bispecific composto soltanto 46 amminoacidi. Dalla diversificazione del lato albumina vincolante del dominio tre-helix bundle, seguito dalla visualizzazione della libreria risultante su particelle dei fagi, proteine di dominio singolo bispecific sono state isolate mediante selezioni con TNF-&alpha; come destinazione. Inoltre, basato sulle sequenze ottenute dalla selezione dei fagi, una libreria di seconda generazione &egrave; stata progettata al fine di aumentare ulteriormente l&#39;affinit&agrave; dei candidati bispecific. Visualizzazione superficie stafilococcica &egrave; stata impiegata per la maturazione di affinit&agrave;, abilitazione efficiente isolamento dei leganti migliorati cos&igrave; come basata su multiparametro cernite con TNF-&alpha; e albumina come obiettivi della selezione stessa del ciclo. Varianti isolate sono stati sequenziati e l&#39;associazione di albumina e TNF-&alpha; &egrave; stato analizzato. Questa analisi ha rivelato un&#39;affinit&agrave; per il TNF-&alpha; di sotto di 5 nM per i leganti pi&ugrave; forti. Da multiparametro ordinamento che contemporaneamente mirate TNF-&alpha; e albumina, diversi bispecific candidati sono stati isolati con alta affinit&agrave; per entrambi gli antigeni, suggerendo che la cella display in combinazione con fluorescenza attivata ordinamento delle cellule &egrave; una tecnologia adatta per l&#39;ingegneria delle bispecificity. A nostra conoscenza, i nuovi leganti rappresentano le proteine pi&ugrave; piccolo ingegnerizzati bispecific riferite finora. Possibilit&agrave; e sfide cos&igrave; come potenziali applicazioni future di questa romanzo strategia sono discussi.

Ingegneria bispecificity in un singolo dominio di albumina-associazione.

&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x6297;&#x4F53;&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x975E;&#x514D;&#x75AB;&#x30B0;&#x30ED;&#x30D6;&#x30EA;&#x30F3;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x5C06;&#x6765;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30AA;&#x533B;&#x85AC;&#x54C1;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x9AD8;&#x3044;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3092;&#x79D8;&#x3081;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3068;&#x8003;&#x3048;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x305D;&#x3053;&#x3067;&#x3001;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3067;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x5C0F;&#x3055;&#x3044;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x5831;&#x544A;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x307E;&#x3060;&#x5358;&#x306B;46&#x500B;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x304B;&#x3089;&#x306A;&#x308B;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x306E;&#x5143;&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x4FDD;&#x6301;&#x3057;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x816B;&#x760D;&#x58CA;&#x6B7B;&#x56E0;&#x5B50;-&#x3B1;&#xFF08;TNF-&#x3B1;&#xFF09;&#x3068;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306F;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002; 3&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x30D0;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EB;&#x306E;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x4EE5;&#x5916;&#x306E;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x5074;&#x306E;&#x591A;&#x69D8;&#x5316;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x7C92;&#x5B50;&#x4E0A;&#x306B;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x30FC;&#x306E;&#x8868;&#x793A;&#x306B;&#x7D9A;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x5358;&#x4E00;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x3057;&#x3066;TNF-&#x3B1;&#x3068;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x5358;&#x96E2;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x30D5;&#x30A1;&#x30FC;&#x30B8;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x304B;&#x3089;&#x5F97;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x914D;&#x5217;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x4E16;&#x4EE3;&#x306E;&#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x306F;&#x3001;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x306E;&#x5019;&#x88DC;&#x8005;&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x9AD8;&#x3081;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30D6;&#x30C9;&#x30A6;&#x7403;&#x83CC;&#x306E;&#x8868;&#x9762;&#x8868;&#x793A;&#x306F;&#x3001;TNF-&#x3B1;&#x3068;&#x540C;&#x3058;&#x9078;&#x629E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x3067;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306B;&#x6539;&#x826F;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C0;&#x30FC;&#x306E;&#x5206;&#x96E2;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D1;&#x30E9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x4E26;&#x3079;&#x66FF;&#x3048;&#x304C;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3057;&#x3001;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x6210;&#x719F;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x63A1;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x9694;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30D0;&#x30EA;&#x30A2;&#x30F3;&#x30C8;&#x304C;&#x914D;&#x5217;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3068;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3057;&#x3001;TNF-&#x3B1;&#x3092;&#x5206;&#x6790;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x306F;&#x3001;&#x6700;&#x5F37;&#x306E;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C0;&#x30FC;&#x306F;5 nm&#x4EE5;&#x4E0B;&#x306E;TNF-&#x3B1;&#x3068;&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x540C;&#x6642;&#x306B;TNF-&#x3B1;&#x3092;&#x6A19;&#x7684;&#x3068;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x9078;&#x5225;&#x30DE;&#x30EB;&#x30C1;&#x30D1;&#x30E9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x5019;&#x88DC;&#x304C;bispecificity&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B8;&#x30CB;&#x30A2;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x9069;&#x3057;&#x305F;&#x6280;&#x8853;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x30BB;&#x30EB;&#x30BD;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3067;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x30BB;&#x30EB;&#x306E;&#x8868;&#x793A;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x6297;&#x539F;&#x306B;&#x5BFE;&#x3059;&#x308B;&#x9AD8;&#x3044;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3067;&#x5358;&#x96E2;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x77E5;&#x8B58;&#x306B;&#x3001;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C0;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x307E;&#x3067;&#x306B;&#x5831;&#x544A;&#x6700;&#x5C0F;&#x4EBA;&#x5DE5;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3092;&#x8868;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x3068;&#x8AB2;&#x984C;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x65B0;&#x305F;&#x306A;&#x6226;&#x7565;&#x306E;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x5C06;&#x6765;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x304C;&#x8AAC;&#x660E;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x30EB;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D6;&#x30DF;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306B;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B8;&#x30CB;&#x30A2;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;Bispecificity

Bispecific &#xD56D; &#xCCB4;&#xB85C; &#xBA74;&#xC5ED; &#xAE00;&#xB85C;&#xBD88;&#xB9B0; &#xBE44; &#xAE30;&#xBC18;&#xB41C; bispecific &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xB192;&#xC740; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xBBF8;&#xB798;&#xC5D0; biotherapeutic &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xAC04;&#xC8FC; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xAD6C;&#xC870; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xB9CC; &#xC774;&#xB8E8;&#xC5B4;&#xC9C4; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xC791;&#xC740; bispecific &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC0DD;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC744; &#xBCF4;&#xACE0;. &#xC885;&#xC591; &#xAD34; &#xC0AC; &#xC778;&#xC790;-&alpha; (TNF-&alpha;)&#xB97C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC6D0;&#xB798; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC720;&#xC9C0; &#xD558;&#xBA74;&#xC11C; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC73C;&#xB85C; &#xC124;&#xACC4; &#xB41C;, &#xACB0;&#xACFC; bispecific&#xC5D0; &#xB2E8;&#xC9C0; 46 &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAD6C;&#xC131; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0;. &#xC0B4; &#xADE0; &#xC18C; &#xC785;&#xC790;&#xC5D0; &#xACB0;&#xACFC; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xC758; &#xD45C;&#xC2DC; &#xC774;&#xC5B4;&#xC11C; 3 &#xB098;&#xC120; &#xBC88;&#xB4E4; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xAD6C;&#xC18D;&#xB825;&#xC774; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; &#xCABD;&#xC758; &#xB2E4;&#xC591;&#xD654;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; bispecific &#xB2E8;&#xC77C; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; TNF-&alpha;&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xC120;&#xD0DD; &#xC601;&#xC5ED;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xACE0;&#xB9BD; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC0B4; &#xADE0; &#xC18C; &#xC120;&#xD0DD;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC5BB;&#xC740; &#xC21C;&#xC11C;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; 2 &#xC138;&#xB300; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC; bispecific &#xD6C4;&#xBCF4;&#xC790;&#xC758; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xB354;&#xC6B1; &#xB192;&#xC774;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC124;&#xACC4; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD3EC;&#xB3C4; &#xD45C;&#xBA74; &#xB514;&#xC2A4;&#xD50C;&#xB808;&#xC774; &#xAC19;&#xC740; &#xC120;&#xD0DD;&#xC758; &#xB300;&#xC0C1; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074; TNF-&alpha;&#xC640; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; sortings multiparameter&#xC744; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xBC14;&#xC778;&#xB354;&#xC758; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xBD84;&#xB9AC; &#xAC00;&#xB2A5; &#xD558; &#xAC8C; &#xD558;&#xB294; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xC131;&#xC219;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xACE0;&#xC6A9; &#xD588;&#xB2E4;. &#xACA9;&#xB9AC; &#xB41C; &#xBCC0;&#xD615; &#xB41C; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1; &#xD558; &#xACE0; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; &#xBC0F; TNF-&alpha;&#xB97C; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBD84;&#xC11D; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBD84;&#xC11D; 5 TNF-&alpha;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xBC1D;&#xD600; &#xAC15;&#xD55C; &#xBC14;&#xC778;&#xB354;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB274; &#xBA55;&#xC2DC;&#xCF54;. &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0; &#xD0C0;&#xAC9F;&#xB41C; TNF-&alpha; &#xBC0F; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC;, &#xC5EC;&#xB7EC; bispecific &#xD6C4;&#xBCF4; &#xB450; &#xD56D; &#xC6D0;&#xC5D0; &#xB192;&#xC740; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4;&#xC640; &#xACE0;&#xB9BD; &#xB418;&#xC5C8;&#xB2E4; &#xC815;&#xB82C;, &#xADF8; &#xC140;&#xC744; &#xC81C;&#xC548; &#xD558;&#xB294; multiparameter&#xC5D0;&#xC11C; &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xD615;&#xAD11; &#xC138;&#xD3EC; &#xBD84;&#xB958;&#xC640; &#xD568;&#xAED8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB514;&#xC2A4;&#xD50C;&#xB808;&#xC774; bispecificity&#xC758; &#xC5D4;&#xC9C0;&#xB2C8;&#xC5B4;&#xB9C1;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC801;&#xD569; &#xD55C; &#xAE30;&#xC220;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC9C0;&#xC2DD;, &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBC14;&#xC778;&#xB354; &#xC9C0;&#xAE08;&#xAE4C;&#xC9C0; &#xBCF4;&#xACE0; &#xB41C; &#xAC00;&#xC7A5; &#xC791;&#xC740; &#xC870;&#xC791;&#xB41C; bispecific &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAC00;&#xB2A5;&#xC131;&#xACFC; &#xB3C4;&#xC804; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C;&#xC774; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC804;&#xB7B5;&#xC758; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xBBF8;&#xB798;&#xC758; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB2E8;&#xC77C; &#xC54C; &#xBD80; &#xBBFC; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC73C;&#xB85C; &#xACF5;&#xD559; bispecificity.

Los anticuerpos biespec&#xED;ficos, as&#xED; como no son de inmunoglobulina a base de prote&#xED;nas de afinidad biespec&#xED;ficos se considera que tienen un potencial muy alto en las futuras aplicaciones de bioterap&#xE9;uticos. En este estudio, se presenta un enfoque novedoso para la generaci&#xF3;n de prote&#xED;nas biespec&#xED;ficas muy peque&#xF1;as compuestas por s&#xF3;lo un &#xFA;nico dominio estructural. La uni&#xF3;n a factor de necrosis tumoral &#x3B1; (TNF-&#x3B1;) se ha dise&#xF1;ado en un dominio de uni&#xF3;n a la alb&#xFA;mina al tiempo que conserva la afinidad original para la alb&#xFA;mina, que resulta en una prote&#xED;na biespec&#xED;fico compuesto de solo 46 amino&#xE1;cidos. Por la diversificaci&#xF3;n de la alb&#xFA;mina no vinculante lado del dominio paquete tres-h&#xE9;lice, seguido por visualizaci&#xF3;n de la biblioteca resultante en part&#xED;culas de fago, biespec&#xED;ficos un solo dominio de las prote&#xED;nas se aislaron utilizando selecciones con TNF-&#x3B1; como objetivo. Adem&#xE1;s, bas&#xE1;ndose en las secuencias obtenidas a partir de la selecci&#xF3;n de fagos, una biblioteca de segunda generaci&#xF3;n se dise&#xF1;&#xF3; con el fin de aumentar a&#xFA;n m&#xE1;s la afinidad de los candidatos biespec&#xED;ficos. La superficie de la pantalla por estafilococos fue empleado para la maduraci&#xF3;n de la afinidad, lo que permite un aislamiento eficaz de las carpetas mejoradas, as&#xED; como clasificaciones basadas en m&#xFA;ltiples par&#xE1;metros, con el TNF-&#x3B1; tanto y la alb&#xFA;mina como objetivos en el ciclo de la misma selecci&#xF3;n. Variantes aislados fueron secuenciados y la uni&#xF3;n a la alb&#xFA;mina y el TNF-&#x3B1;-se analiz&#xF3;. Este an&#xE1;lisis revel&#xF3; una afinidad por el TNF-&#x3B1; por debajo de 5 nM para los m&#xE1;s fuertes aglutinantes. Desde el multipar&#xE1;metros clasificaci&#xF3;n que, simult&#xE1;neamente, dirigido TNF-&#x3B1; y la alb&#xFA;mina, varios candidatos biespec&#xED;ficos se aislaron con alta afinidad a ambos ant&#xED;genos, lo que sugiere que la pantalla de c&#xE9;lulas en combinaci&#xF3;n con la clasificaci&#xF3;n celular activado por fluorescencia es una tecnolog&#xED;a adecuada para la ingenier&#xED;a de bispecificity. A nuestro entender, los nuevos ligantes representan m&#xE1;s peque&#xF1;as que las prote&#xED;nas de ingenier&#xED;a biespec&#xED;ficos reportados hasta el momento. Posibilidades y desaf&#xED;os, as&#xED; como posibles aplicaciones futuras de esta nueva estrategia se discuten.

Johan Nilvebrant

School of Biotechnology,
Department of Proteomics,
School of Biotechnology, Department of Proteomics

Royal Institute of Technology

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Johan Nilvebrant

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Royal Institute of Technology

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

School of Biotechnology,
Department of Proteomics,
School of Biotechnology, Department of Proteomics