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High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

University of California Los Angeles 

&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x9634;&#x79BB;&#x5B50;&#x901A;&#x9053; (VDAC) &#x8DE8;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x7684;&#x5916;&#x819C;&#x6784;&#x6210;&#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x9014;&#x5F84;&#x5165;&#x5883;&#x548C;&#x51FA;&#x5883;&#x7684;&#x4EE3;&#x8C22;&#x7269;&#xFF0C;&#x5E76;&#x53EF;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x652F;&#x67B6;&#x7684;&#x8C03;&#x8282;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5668;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A; beta &#x6876;&#x771F;&#x6838;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x5C0F;&#x9F20;&#x7684; VDAC1 &#x7684;&#x6676;&#x4F53;&#x7ED3;&#x6784; (mVDAC1) &#x5728; 2.3 A &#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#xFF0C;&#x63ED;&#x793A;&#x5176;&#x4F53;&#x7CFB;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x9AD8;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x56FE;&#x50CF;&#x7531; 19 beta &#x675F;&#x7EC4;&#x6210;&#x3002;&#x4E0E;&#x6700;&#x8FD1;&#x7684;&#x4EBA;&#x7C7B; VDAC1 &#x6838;&#x78C1;&#x5171;&#x632F;&#x7ED3;&#x6784;&#xFF0C;&#x4E0D;&#x540C;&#x7535;&#x538B;&#x611F;&#x5E94; N-&#x672B;&#x7AEF;&#x7684;&#x7ACB;&#x573A;&#x662F;&#x660E;&#x786E;&#x89E3;&#x51B3;&#x3002;N-&#x672B;&#x7AEF;&#x7684;&#x963F;&#x5C14;&#x6CD5;&#x87BA;&#x65CB;&#x662F;&#x9762;&#x5411;&#x5BA4;&#x5185;&#x5899;&#x58C1;&#xFF0C;&#x5BFC;&#x81F4;&#x90E8;&#x5206;&#x7F29;&#x5C0F;&#x6BDB;&#x5B54;&#x7684;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E00;&#x6BB5;&#x662F;&#x6700;&#x7406;&#x60F3;&#x7684;&#x88AB;&#x5B9A;&#x4F4D;&#x4E8E;&#x89C4;&#x7BA1;&#x7684;&#x79BB;&#x5B50;&#x548C;&#x4EE3;&#x8C22;&#x4EA7;&#x7269;&#x901A;&#x8FC7; VDAC &#x5B54;&#x9699;&#x7535;&#x5BFC;&#x3002;

&#x9F20;&#x6807; VDAC1 2.3 A &#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x7684;&#x6676;&#x4F53;&#x7ED3;&#x6784;&#x63ED;&#x793A;&#x4E86;&#x4EE3;&#x8C22;&#x7269;&#x6D47;&#x6CE8;&#x673A;&#x68B0;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3002;

The voltage-dependent anion channel (VDAC) constitutes the major pathway for the entry and exit of metabolites across the outer membrane of the mitochondria and can serve as a scaffold for molecules that modulate the organelle. We report the crystal structure of a beta-barrel eukaryotic membrane protein, the murine VDAC1 (mVDAC1) at 2.3 A resolution, revealing a high-resolution image of its architecture formed by 19 beta-strands. Unlike the recent NMR structure of human VDAC1, the position of the voltage-sensing N-terminal segment is clearly resolved. The alpha-helix of the N-terminal segment is oriented against the interior wall, causing a partial narrowing at the center of the pore. This segment is ideally positioned to regulate the conductance of ions and metabolites passing through the VDAC pore.

The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.

Le canal d&#x26;#39;anions d&#xE9;pendant de la tension (VDAC) constitue la principale voie d&#x26;#39;entr&#xE9;e et de sortie de m&#xE9;tabolites &#xE0; travers la membrane externe de la mitochondrie et peut servir comme un &#xE9;chafaudage de mol&#xE9;cules qui modulent l&#x26;#39;organite. Nous rapportons la structure cristalline d&#x26;#39;une prot&#xE9;ine b&#xEA;ta-baril membrane eucaryote, l&#x26;#39;VDAC1 murin (mVDAC1) &#xE0; 2,3 A de r&#xE9;solution, r&#xE9;v&#xE9;lant une image haute r&#xE9;solution de son architecture form&#xE9;e par 19 b&#xEA;ta-brins. La diff&#xE9;rence de la structure de RMN r&#xE9;cente d&#x26;#39;VDAC1 humaine, la position de la tension de d&#xE9;tection-N-terminale du segment est clairement r&#xE9;solue. L&#x26;#39;h&#xE9;lice alpha du segment N-terminal est orient&#xE9; contre la paroi int&#xE9;rieure, provoquant un r&#xE9;tr&#xE9;cissement partiel au centre du pore. Ce segment est id&#xE9;alement positionn&#xE9; pour r&#xE9;guler la conductance des ions et des m&#xE9;tabolites passent &#xE0; travers le pore VDAC.

La structure cristalline de la souris VDAC1 &#xE0; 2,3 Une r&#xE9;solution r&#xE9;v&#xE8;le id&#xE9;es m&#xE9;canistes dans Gating M&#xE9;tabolite

Der Spannung-abh&auml;ngigen Anion Channel (VDAC) kann stellt die wichtigen Wegbereiter f&uuml;r die ein- und Ausreise von Metaboliten durch die &auml;u&szlig;ere Membran der Mitochondrien und als ein Ger&uuml;st f&uuml;r Molek&uuml;le, die die Organellen zu modulieren. Wir berichten die Kristallstruktur von einem Beta-Fass-eukaryotischen Membranprotein, das murine VDAC1 (mVDAC1) bei 2,3 A Aufl&ouml;sung, offenbart ein Bild in hoher Aufl&ouml;sung seiner Architektur von 19 Beta-Str&auml;nge gebildet. Anders als die j&uuml;ngsten NMR-Struktur des menschlichen VDAC1 wird die Position des Segments N-terminalen Spannung Erkennung eindeutig aufgel&ouml;st. Die Alpha-Helix des Segments N-terminalen richtet sich gegen die innere Wand, wodurch eine partielle Verengung in der Mitte der Pore. Dieses Segment ist ideal positioniert, um die Leitf&auml;higkeit von Ionen und Metaboliten, die durch die Pore VDAC regulieren.

Die Kristallstruktur von Maus VDAC1 bei 2,3 A Aufl&ouml;sung zeigt mechanistische Einblicke in Metabolit Anspritzung.

Il canale voltaggio-dipendente anione (VDAC) costituisce la principale via per l&#39;entrata e l&#39;uscita dei metaboliti attraverso la membrana esterna dei mitocondri e pu&ograve; servire come un&#39;impalcatura per molecole che modulano l&#39;organello. Riportiamo la struttura di cristallo di una proteina eucariotica membrana beta-barrel, la murino VDAC1 (mVDAC1) a 2,3 risoluzione, rivelando un&#39;immagine ad alta risoluzione della sua architettura formata da 19 beta-filamenti. A differenza della recente struttura NMR di VDAC1 umano, la posizione del segmento N-terminale rilevazione della tensione &egrave; chiaramente risolta. L&#39;alfa-elica del segmento N-terminale &egrave; orientata contro la parete interna, causando un restringimento parziale al centro del poro. Questo segmento &egrave; idealmente posizionato per regolamentare la conduttanza degli ioni e metaboliti passando attraverso il poro VDAC.

La struttura di cristallo del mouse VDAC1 a 2,3 risoluzione rivela meccanicistiche intuizioni metabolita gating.

&#x96FB;&#x4F4D;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30A2;&#x30CB;&#x30AA;&#x30F3;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#xFF08;VDAC&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x306E;&#x5916;&#x819C;&#x3092;&#x6A2A;&#x5207;&#x3063;&#x3066;&#x306E;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x7269;&#x306E;&#x5165;&#x53E3;&#x3068;&#x51FA;&#x53E3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x3092;&#x69CB;&#x6210;&#x3057;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x5C0F;&#x5668;&#x5B98;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x8DB3;&#x5834;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;19&#x306E;&#x3B2;-&#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C9;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5F62;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x30A2;&#x30FC;&#x30AD;&#x30C6;&#x30AF;&#x30C1;&#x30E3;&#x306E;&#x9AD8;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x306E;&#x753B;&#x50CF;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3B2;-&#x30D0;&#x30EC;&#x30EB;&#x306E;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3001;2.3&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x3067;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;VDAC1&#xFF08;mVDAC1&#xFF09;&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4EBA;&#x9593;VDAC1&#x6700;&#x8FD1;&#x306E;NMR&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x306F;&#x7570;&#x306A;&#x308A;&#x3001;&#x96FB;&#x5727;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;N&#x672B;&#x7AEF;&#x30BB;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x304C;&#x660E;&#x78BA;&#x306B;&#x89E3;&#x6C7A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; N&#x672B;&#x7AEF;&#x30BB;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x3B1;-&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306F;&#x7D30;&#x5B54;&#x306E;&#x4E2D;&#x5FC3;&#x306B;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x306A;&#x72ED;&#x7A84;&#x3092;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3057;&#x3001;&#x5185;&#x58C1;&#x306B;&#x5BFE;&#x3057;&#x3066;&#x6307;&#x5411;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30BB;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306F;&#x3001;&#x7406;&#x60F3;&#x7684;&#x306A;VDAC&#x5B54;&#x3092;&#x901A;&#x904E;&#x3059;&#x308B;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x3084;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x7523;&#x7269;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C0;&#x30AF;&#x30BF;&#x30F3;&#x30B9;&#x3092;&#x5236;&#x5FA1;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x914D;&#x7F6E;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

2.3&#x3067;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;VDAC1&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x69CB;&#x9020;&#x306F;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C8;&#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;

&#xC804;&#xC555; &#xC885;&#xC18D; &#xC74C;&#xC774;&#xC628; &#xCC44;&#xB110; (VDAC)&#xB294; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC;&#xB9AC; &#xC544;&#xC758; &#xBC14;&#xAE65;&#xCABD; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; &#xC785;&#xAD6C;&#xC640; &#xCD9C;&#xAD6C;&#xC758; &#xB300;&#xC0AC; &#xC0B0;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC8FC;&#xC694; &#xD1B5;&#xB85C; &#xAD6C;&#xC131; &#xD558; &#xACE0; &#xBCC0;&#xC870;&#xB97C; &#xD2B8;&#xB294; &#xBD84;&#xC790;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBC1C;&#xD310;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xBCF4;&#xACE0; murine VDAC1 &#xBCA0;&#xD0C0;-&#xD1B5; &#xC9C4; &#xD575; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xACB0;&#xC815; &#xAD6C;&#xC870; (mVDAC1) 2.3 A &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; 19 &#xBCA0;&#xD0C0; &#xAC00;&#xB2E5;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD615;&#xC131; &#xB41C; &#xADF8; &#xAC74;&#xCD95;&#xC758; &#xACE0;&#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0;&#xB97C; &#xACF5;&#xAC1C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC778;&#xAC04; vdac1&#xC758; &#xCD5C;&#xADFC; NMR &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; &#xB2EC;&#xB9AC; N &#xB2E8;&#xC790; &#xC804;&#xC555; &#xAC10;&#xC9C0; &#xC138;&#xADF8;&#xBA3C;&#xD2B8;&#xC758; &#xC704;&#xCE58;&#xB97C; &#xBA85;&#xD655; &#xD558; &#xAC8C; &#xD574;&#xACB0; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. N-&#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC138;&#xADF8;&#xBA3C;&#xD2B8;&#xC758; &#xC54C;&#xD30C; &#xD5EC;&#xB9AD;&#xC2A4;&#xB294; &#xAE30; &#xACF5; &#xC13C;&#xD130;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBD80;&#xBD84; &#xCD95;&#xC18C;&#xB97C; &#xC77C;&#xC73C;&#xD0A4;&#xB294; &#xC778;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC5B4; &#xBCBD;. &#xC774; &#xC138;&#xADF8;&#xBA3C;&#xD2B8;&#xB294; &#xC774;&#xC628; &#xBC0F; metabolites VDAC &#xAE30; &#xACF5; &#xD1B5;&#xACFC;&#xC758; &#xC804;&#xB3C4;&#xB3C4; &#xC870;&#xC808; &#xD558; &#xC774;&#xC0C1;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xBC30;&#xCE58; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB9C8;&#xC6B0;&#xC2A4; VDAC1 2.3 A &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4;&#xC758; &#xACB0;&#xC815; &#xAD6C;&#xC870; &#xAE30;&#xACC4; &#xB860;&#xC758; &#xB300;&#xC0AC; &#xC0B0;&#xBB3C; &#xAC8C;&#xC774;&#xD305; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC900;&#xB2E4;.

El canal de aniones dependiente de la tensi&#xF3;n (VDAC) constituye la principal v&#xED;a para la entrada y salida de metabolitos a trav&#xE9;s de la membrana externa de la mitocondria y puede servir como un andamio para mol&#xE9;culas que modulan el org&#xE1;nulo. Se presenta la estructura cristalina de una prote&#xED;na de membrana barril beta eucari&#xF3;tica, el VDAC1 murino (mVDAC1) en el 2,3 Una resoluci&#xF3;n, revelando una imagen de alta resoluci&#xF3;n de su arquitectura formada por 19 beta-cap&#xED;tulos. A diferencia de la estructura de RMN reciente de VDAC1 humano, la posici&#xF3;n de la detecci&#xF3;n de voltaje del segmento N-terminal se resuelve con claridad. La alfa-h&#xE9;lice del segmento N-terminal est&#xE1; orientado contra la pared interior, provocando un estrechamiento parcial en el centro del poro. Este segmento est&#xE1; en una posici&#xF3;n ideal para regular la conductividad de los iones y metabolitos que pasan a trav&#xE9;s del poro VDAC.

La estructura cristalina del rat&#xF3;n en el 2,3 VDAC1 Una Resoluci&#xF3;n revela una visi&#xF3;n mecanicista en la apertura de puerta metabolito

&#x6240;&#x6709;&#x7684;&#x771F;&#x6838;&#x7EC6;&#x80DE;&#x9700;&#x8981;&#x9AD8;&#x6548;&#x8D29;&#x8FD0;&#x7684;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x548C;&#x5176;&#x4F59;&#x7684;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x4EE3;&#x8C22;&#x4EA7;&#x7269;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x4EA4;&#x6D41;&#x88AB;&#x5F00;&#x5C55;&#x4E2D;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x5916;&#x819C; &#xFF08;OMM) &#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x9634;&#x79BB;&#x5B50;&#x901A;&#x9053; (VDAC)&#xFF0C;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x79BB;&#x5B50;&#x548C;&#x4EE3;&#x8C22;&#x4EA7;&#x7269;&#xFF0C;&#x5728;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x548C;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x7684;&#x95F4;&#x9699;&#x7A7A;&#x95F4;&#x4E4B;&#x95F4;&#x4EA4;&#x6D41;&#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x6E20;&#x9053;&#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;VDAC &#x7528;&#x4E8E;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x8C03;&#x5236;&#x5668;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x63D0;&#x4F9B;&#x811A;&#x624B;&#x67B6;&#x548C;&#x4E00;&#x76F4;&#x5728;&#x53C2;&#x4E0E;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x4F9D;&#x8D56;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6B7B;&#x4EA1;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x6700;&#x8FD1;&#x786E;&#x5B9A;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x5C0F;&#x9F20;&#x7684; VDAC1 (mVDAC1) &#x5728; 2.3 &#x4E00;&#x9879;&#x51B3;&#x8BAE;&#xFF0C;&#x4F53;&#x73B0;&#x5728;&#x672C;&#x673A;&#x6837;&#x53CC;&#x5C42;&#x7684;&#x73AF;&#x5883;&#x4E2D;&#x3002;&#x9AD8;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x7B80;&#x660E;&#x7ED3;&#x6784;&#x8BE6;&#x7EC6;&#x4FE1;&#x606F;&#x7684;&#x7535;&#x538B;&#x611F;&#x5E94; N &#x7EC8;&#x7AEF;&#x57DF;&#x548C;&#x50AC;&#x5316;&#x7684;&#x4EE3;&#x8C22;&#x4EA7;&#x7269;&#x548C;&#x8FC7;&#x5883; OMM &#x7684;&#x79BB;&#x5B50;&#x95E8;&#x63A7;&#x673A;&#x5236;&#x7684;&#x65B0;&#x5047;&#x8BF4;&#x3002;&#x5728;&#x6B64;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;mVDAC1 &#x7684;&#x6C34;&#x6676;&#x5305;&#x88C5;&#x88AB;&#x5206;&#x6790;&#x63ED;&#x793A;&#x5F3A;&#x9006;&#x4E8C;&#x805A;&#x4F53;&#xFF0C;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x4E3A; hexamers &#x6A21;&#x4EFF; OMM EM &#x548C;&#x539F;&#x5B50;&#x529B;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x56FE;&#x50CF;&#x4E2D;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7684;&#x672C;&#x673A;&#x5BE1;&#x805A;&#x5305;&#x88C5;&#x7EC4;&#x88C5;&#x3002;&#x9F50;&#x805A;&#x5DF2;&#x88AB;&#x8BC1;&#x660E;&#x662F;&#x91CD;&#x8981;&#x7684; VDAC &#x8C03;&#x8282;&#x4E0E;&#x529F;&#x80FD;&#xFF0C;&#x548C; mVDAC1 &#x6C34;&#x6676;&#x5305;&#x88C5;&#x8102;&#x7C7B;&#x4ECB;&#x8D28;&#x4E2D;&#x63ED;&#x793A;&#x4E86;&#x89C1;&#x89E3;&#x9F50;&#x805A;&#x662F;&#x5982;&#x4F55;&#x4F7F;&#x7528;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;-&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x548C;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;-&#x8102;&#x8D28;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x6765;&#x5B8C;&#x6210;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x5728; OMM VDAC &#x65B9;&#x5411;&#x4ECD;&#x7136;&#x4E0D;&#x660E;&#x6717;&#x7531;&#x4E8E;&#x6297;&#x4F53;&#x6807;&#x8BB0;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#x7684;&#x4E0D;&#x4E00;&#x81F4;&#x3002;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B0;&#x578B;&#x7684;&#x9006;&#x5B89;&#x6392;&#x5BF9;&#x751F;&#x7406;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x5F97;&#x5230;&#x89E3;&#x51B3;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x6F84;&#x6E05;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x51B2;&#x7A81;&#x7684;&#x751F;&#x5316;&#x6570;&#x636E;&#x3002;

&#x6C34;&#x6676;&#x5728;&#x6CB9;&#x8102;&#x73AF;&#x5883;&#x4E2D;&#x5305;&#x88C5;&#x7684;&#x5C0F;&#x9F20; VDAC1 &#x6676;&#x4F53;&#x5206;&#x6790;&#x63ED;&#x793A;&#x4E86;&#x9F50;&#x805A;&#x548C;&#x65B9;&#x5411;&#x4E0A;&#x7684;&#x65B0;&#x9896;&#x89C1;&#x89E3;&#x3002;

All eukaryotic cells require efficient trafficking of metabolites between the mitochondria and the rest of the cell. This exchange is carried out by the dominant protein in the outer mitochondrial membrane (OMM), the Voltage Dependent Anion Channel (VDAC), which serves as the primary pathway for the exchange of ions and metabolites between the cytoplasm and the intermembrane space of the mitochondria. Additionally, VDAC provides a scaffold for the binding of modulator proteins to the mitochondria and has been implicated in mitochondria-dependent cell death. We recently determined the structure of the murine VDAC1 (mVDAC1) at 2.3 A resolution crystallized in a native-like bilayer environment. The high-resolution structure provided concise structural details about the voltage-sensing N-terminal domain and catalyzed new hypotheses regarding the gating mechanisms for metabolites and ions that transit the OMM. In this study, the crystal packing of mVDAC1 is analyzed revealing a strong antiparallel dimer that further assemble as hexamers mimicking the native oligomeric packing observed in EM and AFM images of the OMM. Oligomerization has been shown to be important for VDAC regulation and function, and mVDAC1 crystal packing in a lipidic medium reveals insights on how oligomerization is accomplished using protein-protein and protein-lipid interactions. Furthermore, orientation of VDAC in the OMM remains uncertain due to inconsistencies in antibody labeling studies. The physiological implications of a novel antiparallel arrangement are addressed that may clarify these conflicting biochemical data.

Crystal packing analysis of murine VDAC1 crystals in a lipidic environment reveals novel insights on oligomerization and orientation.

Toutes les cellules eucaryotes n&#xE9;cessitent traite efficace de m&#xE9;tabolites entre les mitochondries et le reste de la cellule. Cet &#xE9;change est r&#xE9;alis&#xE9;e par la prot&#xE9;ine dominante dans la membrane mitochondriale externe (OMM), l&#x26;#39;anion Cha&#xEE;ne de tension d&#xE9;pendante (VDAC), qui sert de la voie principale pour l&#x26;#39;&#xE9;change d&#x26;#39;ions et de m&#xE9;tabolites entre le cytoplasme et l&#x26;#39;espace inter des mitochondries . En outre, VDAC fournit un &#xE9;chafaudage pour la liaison des prot&#xE9;ines de modulation de la mitochondrie et a &#xE9;t&#xE9; impliqu&#xE9; dans la mort cellulaire d&#xE9;pendante des mitochondries. Nous avons r&#xE9;cemment d&#xE9;termin&#xE9; la structure de l&#x26;#39;VDAC1 murin (mVDAC1) &#xE0; 2,3 Une r&#xE9;solution cristallis&#xE9; dans un environnement natif bicouche-like. La structure &#xE0; haute r&#xE9;solution fournies concis d&#xE9;tails de la structure sur la tension &#xE0; d&#xE9;tection domaine N-terminal et catalys&#xE9;es par de nouvelles hypoth&#xE8;ses concernant les m&#xE9;canismes de d&#xE9;clenchement pour les m&#xE9;tabolites et des ions que le transit, l&#x26;#39;OMM. Dans cette &#xE9;tude, l&#x26;#39;emballage cristal de mVDAC1 est analys&#xE9;e r&#xE9;v&#xE8;le un dim&#xE8;re antiparall&#xE8;le forte que la poursuite assembler comme hexam&#xE8;res mimant l&#x26;#39;emballage oligom&#xE8;re natif observ&#xE9; dans EM et les images AFM de l&#x26;#39;OMM. Oligom&#xE9;risation a &#xE9;t&#xE9; d&#xE9;montr&#xE9; &#xEA;tre important pour la r&#xE9;gulation et la fonction VDAC et mVDAC1 emballage cristal dans un milieu lipidique r&#xE9;v&#xE8;le id&#xE9;es sur la fa&#xE7;on d&#x26;#39;oligom&#xE9;risation est r&#xE9;alis&#xE9;e en utilisant la prot&#xE9;ine-prot&#xE9;ine et prot&#xE9;ine-lipide interactions. En outre, l&#x26;#39;orientation des VDAC dans le OMM demeure incertain en raison d&#x26;#39;incoh&#xE9;rences dans les &#xE9;tudes en mati&#xE8;re d&#x26;#39;&#xE9;tiquetage des anticorps. Les implications physiologiques d&#x26;#39;un nouvel arrangement antiparall&#xE8;le sont abord&#xE9;es qui peuvent clarifier ces donn&#xE9;es contradictoires biochimiques.

Cristal d&#x26;#39;emballage Analyse de murins VDAC1 cristaux dans un environnement lipidique r&#xE9;v&#xE8;le des informations nouvelles sur oligom&#xE9;risation et de l&#x26;#39;orientation

Alle eukaryotische Zellen erfordern effiziente Menschenhandel Metaboliten zwischen den Mitochondrien und dem Rest der Zelle. Dieser Austausch erfolgt durch das dominante Protein in der &auml;u&szlig;eren mitochondrischen Membrane (OMM), die Voltage Dependent Anion Channel (VDAC), der als der prim&auml;re Weg f&uuml;r den Austausch von Ionen und Metaboliten zwischen Zytoplasma und der Intermembranraum der Mitochondrien dient. Dar&uuml;ber hinaus VDAC stellt ein Ger&uuml;st f&uuml;r die Bindung der Modulator Proteine in den Mitochondrien und hat in die Mitochondrien-abh&auml;ngige Zellentod verwickelt worden. Wir k&uuml;rzlich bestimmt die Struktur des murinen VDAC1 (mVDAC1) auf 2,3 eine Aufl&ouml;sung in einer Native-wie Bilayer-Umgebung kristallisiert. Die hochaufl&ouml;sende Struktur vorgesehen pr&auml;gnante strukturelle Details &uuml;ber die Spannung Erkennung N-terminalen Dom&auml;ne und katalysierte neue Hypothesen &uuml;ber die gating Mechanismen f&uuml;r die Metaboliten und Ionen, die das OMM Durchfuhr. In dieser Studie wird die Kristall-Verpackung von mVDAC1 analysiert, offenbart eine starke antiparallel Dimer, die weiter als Hexamers imitiert die native Oligomere Verpackung in EM und AFM-Bilder von der OMM beobachtet zusammenstellen. Nachweislich Oligomerisierung f&uuml;r VDAC-Verordnung und Funktion wichtig sein, und mVDAC1-Kristall, die Verpackung in einem lipidischen Medium offenbart Einblicke, wie Oligomerisierung ist mithilfe von Protein-Protein und Protein-Lipid-Interaktionen. Ausrichtung des VDAC in der OMM ungewiss zudem aufgrund von Inkonsistenzen in Antik&ouml;rper-Kennzeichnung-Studien zur Verf&uuml;gung. Die physiologischen Auswirkungen einer neuartigen antiparallele Anordnung richten kann, klarzustellen, dass diese biochemischen Konfliktdaten.

Crystal Verpackung Analyse des murinen VDAC1-Kristalle in einer lipidischen Umgebung enth&uuml;llt neue Einblicke auf Oligomerisierung und Orientierung.

Tutte le cellule eucariotiche richiedono efficiente traffico di metaboliti tra i mitocondri e il resto della cellula. Questo scambio avviene tramite la proteina dominante nella membrana mitocondriale esterna (OMM), la tensione dipendente anione canale (VDAC), che serve come la via principale per lo scambio di ioni e metaboliti tra il citoplasma e lo spazio intermembrana dei mitocondri. Inoltre, VDAC fornisce un&#39;impalcatura per l&#39;associazione di proteine di modulatore di mitocondri ed &egrave; stato implicato nella morte cellulare mitocondrio-dipendente. Recentemente abbiamo determinato la struttura della VDAC1 murino (mVDAC1) a 2,3 risoluzione cristallizzata in un ambiente nativo-come doppio strato. La struttura ad alta risoluzione forniti dettagli strutturali concisi circa il dominio N-terminale di rilevazione della tensione e catalizzate nuove ipotesi per quanto riguarda i meccanismi di controllo per i metaboliti e ioni che l&#39;OMM di transito. In questo studio, l&#39;imballaggio di cristallo di mVDAC1 &egrave; analizzato rivelando un dimero antiparallelo forte che ulteriormente montare come esameri mimando l&#39;imballaggio oligomerici nativo osservato nelle immagini EM e AFM dell&#39;OMM. Oligomerizzazione ha dimostrato di essere importante per regolamento VDAC e funzione, e mVDAC1 cristallo di imballaggio in un mezzo lipidico rivela intuizioni su come oligomerizzazione &egrave; compiuta usando le interazioni della proteina-proteina e proteina-lipidi. Inoltre, orientamento di VDAC nell&#39;OMM rimane incerto a causa di incongruenze negli studi di etichettatura dell&#39;anticorpo. Sono affrontate le implicazioni fisiologiche di un arrangiamento antiparallelo romanzo che pu&ograve; chiarire questi dati biochimici in conflitto.

Crystal analysis of murine VDAC1 cristalli di imballaggio in un ambiente lipidico rivela nuovi approfondimenti su oligomerizzazione e orientamento.

&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;&#x771F;&#x6838;&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x3001;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x6B8B;&#x308A;&#x306E;&#x90E8;&#x5206;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x7523;&#x7269;&#x306E;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x58F2;&#x8CB7;&#x3092;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x4EA4;&#x63DB;&#x306F;&#x3001;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x5916;&#x819C;&#xFF08;OMM&#xFF09;&#x3067;&#x652F;&#x914D;&#x7684;&#x306A;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x3068;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x306E;&#x819C;&#x9593;&#x7A7A;&#x9593;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x3084;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x7523;&#x7269;&#x3092;&#x4EA4;&#x63DB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3059;&#x308B;&#x96FB;&#x4F4D;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x9670;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#xFF08;VDAC&#xFF09;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x884C;&#x308F;&#x308C;&#x308B;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;VDAC&#x306F;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x306B;&#x5909;&#x8ABF;&#x5668;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8DB3;&#x5834;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3001;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x7D30;&#x80DE;&#x6B7B;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x6700;&#x8FD1;&#x3001;2.3&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x4E8C;&#x91CD;&#x74B0;&#x5883;&#x3067;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x3057;&#x305F;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x3067;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;VDAC1&#xFF08;mVDAC1&#xFF09;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x3092;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x9AD8;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x306F;&#x3001;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x7269;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x3092;&#x8F38;&#x9001;OMM&#x306E;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x6A5F;&#x69CB;&#x306B;&#x95A2;&#x3059;&#x308B;&#x96FB;&#x5727;&#x30BB;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;N-&#x672B;&#x7AEF;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3068;&#x89E6;&#x5A92;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x4EEE;&#x8AAC;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x306E;&#x7C21;&#x6F54;&#x306A;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x8A73;&#x7D30;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;mVDAC1&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x30D1;&#x30C3;&#x30AD;&#x30F3;&#x30B0;&#x306F;&#x3055;&#x3089;&#x306B;EM&#x3068;OMM&#x306E;AFM&#x50CF;&#x3067;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x306E;&#x30D1;&#x30C3;&#x30AD;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x6A21;&#x5023;&#x3057;&#x305F;&#x30D8;&#x30AD;&#x30B5;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x308B;&#x5F37;&#x529B;&#x306A;&#x5E73;&#x884C;&#x4E8C;&#x91CF;&#x4F53;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x5206;&#x6790;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x5316;&#x306F;&#x3001;VDAC&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3068;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x8102;&#x8CEA;&#x57F9;&#x5730;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x5316;&#x304C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; - &#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x53CA;&#x3073;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; - &#x8102;&#x8CEA;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x9054;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x306E;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;mVDAC1&#x7D50;&#x6676;&#x306E;&#x30D1;&#x30C3;&#x30AD;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;OMM&#x3067;VDAC&#x306E;&#x5411;&#x304D;&#x304C;&#x539F;&#x56E0;&#x6297;&#x4F53;&#x6A19;&#x8B58;&#x7814;&#x7A76;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x77DB;&#x76FE;&#x304C;&#x4E0D;&#x660E;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x5C0F;&#x8AAC;&#x5E73;&#x884C;&#x914D;&#x7F6E;&#x306E;&#x751F;&#x7406;&#x7684;&#x5F71;&#x97FF;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x76F8;&#x53CD;&#x3059;&#x308B;&#x751F;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x306A;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x3092;&#x660E;&#x78BA;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x304B;&#x3082;&#x3057;&#x308C;&#x306A;&#x3044;&#x6271;&#x308F;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x8102;&#x8CEA;&#x74B0;&#x5883;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;VDAC1&#x7D50;&#x6676;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x3092;&#x30D1;&#x30C3;&#x30AD;&#x30F3;&#x30B0;&#x7D50;&#x6676;&#x304C;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30DE;&#x30FC;&#x5316;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30AA;&#x30EA;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C6;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306B;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;

&#xBAA8;&#xB4E0; &#xC9C4; &#xD575; &#xC138;&#xD3EC;&#xB294; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC;&#xB9AC; &#xC544;&#xC640; &#xC140;&#xC758; &#xB098;&#xBA38;&#xC9C0; &#xBD80;&#xBD84; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xB300;&#xC0AC; &#xC0B0;&#xBB3C;&#xC758; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xB9E4;&#xB9E4; &#xD544;&#xC694;. &#xC774; exchange&#xB294; &#xC678;&#xBD80; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC; &#xB9AC;&#xC544; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; (OMM)&#xB294; &#xC804;&#xC555; &#xC758;&#xC874; &#xC74C;&#xC774;&#xC628; &#xCC44;&#xB110; (VDAC), &#xC774;&#xC628; &#xAD50;&#xD658; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC;&#xB9AC; &#xC544;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; intermembrane &#xACF5;&#xAC04; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xB300;&#xC0AC; &#xC0B0;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC8FC;&#xC694; &#xD1B5;&#xB85C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xD558;&#xB294; &#xC9C0;&#xBC30;&#xC801;&#xC778; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC218;&#xD589; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, VDAC &#xBCC0;&#xC870;&#xAE30;&#xB294; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC;&#xB9AC; &#xC544; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD55C; &#xBE44; &#xACC4;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558; &#xACE0; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC;&#xB9AC; &#xC544;&#xC5D0; &#xC885;&#xC18D;&#xC801;&#xC778; &#xC138;&#xD3EC;&#xC758; &#xC8FD;&#xC74C;&#xC5D0; &#xC5F0;&#xB8E8; &#xB418;&#xC5B4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xCD5C;&#xADFC;&#xC5D0; murine vdac1&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xACB0;&#xC815; (mVDAC1) &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xB124;&#xC774;&#xD2F0;&#xBE0C; &#xCC98;&#xB7FC; bilayer &#xD658;&#xACBD;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xC815; &#xD654; &#xB41C; 2.3&#xC5D0;&#xC11C;. &#xACE0;&#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xAD6C;&#xC870; N &#xB9E8;&#xB05D; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xC804;&#xC555; &#xAC10;&#xC9C0; &#xBC0F; &#xB300;&#xC0AC; &#xC0B0;&#xBB3C; &#xBC0F; &#xD658;&#xC2B9; OMM &#xC774;&#xC628;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC81C;&#xC5B4; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC5D0; &#xAD00;&#xD55C; &#xCD09;&#xB9E4; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xAC00;&#xC124;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC04;&#xACB0;&#xD55C; &#xAD6C;&#xC870; &#xC138;&#xBD80; &#xC815;&#xBCF4;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C;&#xB294; Mvdac1&#xC758; &#xD06C;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xD0C8; &#xD328;&#xD0B9; hexamers OMM&#xC758; EM &#xBC0F; AFM &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xCC30; &#xD558;&#xB294; &#xB124;&#xC774;&#xD2F0;&#xBE0C; oligomeric &#xD3EC;&#xC7A5;&#xC744; &#xD749;&#xB0B4; &#xB0B8;&#xB85C; &#xC870;&#xB9BD; &#xB354; &#xAC15;&#xD55C; antiparallel dimer &#xACF5;&#xAC1C; &#xBD84;&#xC11D; &#xC774;&#xB2E4;. Oligomerization VDAC &#xADDC;&#xC81C; &#xBC0F; &#xAE30;&#xB2A5;, &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAC83;&#xC73C;&#xB85C; &#xD45C;&#xC2DC; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBC0F; mVDAC1 &#xD06C;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xD0C8; lipidic &#xB9E4;&#xCCB4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD3EC;&#xC7A5; oligomerization&#xB294; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC900;&#xB2E4; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xBC0F; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;-&#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC218;&#xD589; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, VDAC&#xB294; OMM&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC29;&#xD5A5;&#xC744; &#xD56D; &#xCCB4; &#xB77C;&#xBCA8; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC758; &#xBE44;&#xC77C;&#xAD00;&#xC131;&#xC73C;&#xB85C; &#xC778;&#xD574; &#xBD88;&#xD655;&#xC2E4;. &#xC18C;&#xC124; antiparallel &#xBC30;&#xCE58;&#xC758; &#xC0DD;&#xB9AC; &#xC801;&#xC778; &#xC758;&#xBBF8;&#xB97C; &#xD574;&#xACB0; &#xD558;&#xB294; &#xC788;&#xB294;&#xC774; &#xCDA9;&#xB3CC; &#xD558;&#xB294; &#xC0DD; &#xD654; &#xD655; &#xC801;&#xC778; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xB97C; &#xBA85;&#xD655;&#xD788; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Lipidic &#xD658;&#xACBD;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBD84;&#xC11D; murine VDAC1 &#xD06C;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xD0C8;&#xC758; &#xD3EC;&#xC7A5; &#xD06C;&#xB9AC;&#xC2A4;&#xD0C8; oligomerization &#xBC0F; &#xBC29;&#xD5A5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC900;&#xB2E4;.

Todas las c&#xE9;lulas eucariotas requieren el tr&#xE1;fico eficiente de los metabolitos entre la mitocondria y el resto de la c&#xE9;lula. Este intercambio se lleva a cabo por la prote&#xED;na dominante en la membrana externa mitocondrial (OMM), el canal de tensi&#xF3;n de aniones dependiente (VDAC), que sirve como la v&#xED;a principal para el intercambio de iones y metabolitos entre el citoplasma y el espacio intermembrana de la mitocondria . Adem&#xE1;s, VDAC proporciona un andamio para la uni&#xF3;n de prote&#xED;nas moduladoras de la mitocondria y se ha implicado en la muerte celular dependiente de las mitocondrias. Recientemente hemos determinado la estructura de la VDAC1 murino (mVDAC1) a 2,3 Una resoluci&#xF3;n cristaliz&#xF3; en un entorno bicapa como nativo. La estructura de alta resoluci&#xF3;n proporciona breves detalles estructurales sobre el voltaje de detecci&#xF3;n de dominio N-terminal y catalizadas por nuevas hip&#xF3;tesis sobre los mecanismos de compuerta de metabolitos e iones que el tr&#xE1;nsito de la OMM. En este estudio, el cristal de embalaje de mVDAC1 se analiza revela una fuerte d&#xED;mero antiparalelo que adem&#xE1;s reunirse como hex&#xE1;meros que imitan el embalaje olig&#xF3;mero nativo se observa en EM y las im&#xE1;genes de AFM de la OMM. Oligomerizaci&#xF3;n ha demostrado ser importante para la regulaci&#xF3;n VDAC y funci&#xF3;n, y mVDAC1 cristal de embalaje en un medio lip&#xED;dico revela informaci&#xF3;n sobre c&#xF3;mo oligomerizaci&#xF3;n se realiza utilizando la prote&#xED;na-prote&#xED;na y las interacciones prote&#xED;na-l&#xED;pido. Por otra parte, la orientaci&#xF3;n de VDAC en la OMM sigue siendo incierto debido a las inconsistencias en los estudios de etiquetado de anticuerpos. Las consecuencias fisiol&#xF3;gicas de una novela disposici&#xF3;n antiparalela se dirigen que pueden aclarar estos datos bioqu&#xED;micos en conflicto.

Crystal embalaje An&#xE1;lisis de murinos VDAC1 cristales en un entorno lip&#xED;dico revela nuevos conocimientos sobre la oligomerizaci&#xF3;n y Orientaci&#xF3;n

&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x9634;&#x79BB;&#x5B50;&#x901A;&#x9053; &#xFF08;VDAC&#xFF09; &#x662F;&#x8C03;&#x89E3;&#x8DE8;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x5916;&#x819C;&#x7684;&#x4EE3;&#x8C22;&#x7269;&#x548C;&#x79BB;&#x5B50;&#x8F6C;&#x79FB;&#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x9014;&#x5F84;&#x3002;&#x901A;&#x9053;&#x5904;&#x4E8E;&#x6253;&#x5F00;&#x72B6;&#x6001;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x7279;&#x70B9;&#x662F;&#x9AD8;&#x4EE3;&#x8C22;&#x901A;&#x91CF;&#x548C;&#x9634;&#x79BB;&#x5B50;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#xFF0C;&#x800C;&#x90E8;&#x5206;&#x5173;&#x95ED;&#x7684;&#x72B6;&#x6001;&#x963B;&#x6B62;&#x4EE3;&#x8C22;&#x7269;&#xFF0C;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x4ECE;&#x5BF9;&#x5C0F;&#x9F20; VDAC1 &#x6700;&#x8FD1;&#x786E;&#x5B9A;&#x9AD8;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x7ED3;&#x6784;&#x8FDB;&#x884C;&#x9759;&#x7535;&#x8BA1;&#x7B97;&#x7ED3;&#x679C;&#x62A5;&#x544A; (mVDAC1)&#x3002;&#x6CCA;&#x677E;-&#x73BB;&#x5C14;&#x5179;&#x66FC;&#x8BA1;&#x7B97;&#x8868;&#x660E;&#x79BB;&#x5B50;&#x8F6C;&#x79FB;&#x81EA;&#x7531;&#x80FD;&#x901A;&#x8FC7;&#x6E20;&#x9053;&#x662F;&#x6709;&#x5229;&#x7684;&#x9634;&#x79BB;&#x5B50;&#xFF0C;&#x6697;&#x793A;&#x8BE5; mVDAC1 &#x8868;&#x793A;&#x6253;&#x5F00;&#x7684;&#x72B6;&#x6001;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x8BF4;&#x6CD5;&#x662F;&#x7531;&#x9884;&#x6D4B;&#x8868;&#x660E;&#x6253;&#x5F00;&#x72B6;&#x6001;&#x548C; 1.75 &mdash; &mdash; &#x51E0;&#x4E4E;&#x8D85;&#x8FC7;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x9634;&#x79BB;&#x5B50;&#x7684;&#x53CC;&#x91CD;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x9634;&#x79BB;&#x5B50;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x9AD8;&#x5355;&#x901A;&#x9053;&#x7535;&#x5BFC;&#x7684;&#x6CCA;&#x677E;-&#x80FD;&#x65AF;&#x7279;-&#x666E;&#x6717;&#x514B;&#x8BA1;&#x7B97;&#x652F;&#x6491;&#x7684;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x8BA1;&#x7B97;&#x4E0A;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684;&#x6E20;&#x9053;&#x91CD;&#x590D;&#x548C;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x89C2;&#x6D4B;&#x7B26;&#x5408;&#x4E86;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x7684;&#x66F4;&#x6539;&#x3002;&#x7136;&#x540E;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F97;&#x4EE5;&#x5DE5;&#x7A0B;&#x5E08;&#x5728;&#x7845; mVDAC1 &#x8F6C;&#x5316;&#x4E3A;&#x504F;&#x7231;&#x7528;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x901A;&#x9053;&#x7684;&#x4E09;&#x4E2A;&#x70B9;&#x7A81;&#x53D8;&#x7A81;&#x53D8;&#x901A;&#x9053;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5BF9;&#x5982;&#x4F55;&#x5728;&#x901A;&#x9053;&#x95F8;&#x95E8;&#x6253;&#x5F00;&#x548C;&#x5173;&#x95ED;&#x7684;&#x72B6;&#x6001;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x63D0;&#x6848;&#x8FDB;&#x884C;&#x8C03;&#x67E5;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A;&#x6A21;&#x578B;&#x6D89;&#x53CA;&#x7684; N-&#x672B;&#x7AEF;&#x87BA;&#x65CB;&#x7EBF;&#x8FD0;&#x52A8;&#xFF0C;&#x4F46;&#x65E2;&#x4E0D;&#x8FD0;&#x52A8;&#x4EA7;&#x751F;&#x89C2;&#x5BDF;&#x7684;&#x7535;&#x538B;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#xFF0C;&#x4E5F;&#x4EFB;&#x4E00;&#x6A21;&#x578B;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x7684;&#x901A;&#x9053;&#xFF0C;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x4E2D;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#xFF0C;&#x5E76;&#x6CA1;&#x6709;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F97;&#x4EE5;&#x6392;&#x9664;&#x67D0;&#x4E9B;&#x578B;&#x53F7;&#x7684;&#x901A;&#x9053;&#x95E8;&#x63A7;&#xFF0C;&#x4F46;&#x771F;&#x5B9E;&#x7684;&#x8FD0;&#x52A8;&#x5C1A;&#x672A;&#x786E;&#x5B9A;&#x3002;

VDAC &#x7684;&#x9759;&#x7535;&#xFF1A; &#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x548C;&#x6D47;&#x6CE8;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;

The voltage-dependent anion channel (VDAC) is the major pathway mediating the transfer of metabolites and ions across the mitochondrial outer membrane. Two hallmarks of the channel in the open state are high metabolite flux and anion selectivity, while the partially closed state blocks metabolites and is cation selective. Here we report the results from electrostatics calculations carried out on the recently determined high-resolution structure of murine VDAC1 (mVDAC1). Poisson-Boltzmann calculations show that the ion transfer free energy through the channel is favorable for anions, suggesting that mVDAC1 represents the open state. This claim is buttressed by Poisson-Nernst-Planck calculations that predict a high single-channel conductance indicative of the open state and an anion selectivity of 1.75--nearly a twofold selectivity for anions over cations. These calculations were repeated on mutant channels and gave selectivity changes in accord with experimental observations. We were then able to engineer an in silico mutant channel with three point mutations that converted mVDAC1 into a channel with a preference for cations. Finally, we investigated two proposals for how the channel gates between the open and the closed state. Both models involve the movement of the N-terminal helix, but neither motion produced the observed voltage sensitivity, nor did either model result in a cation-selective channel, which is observed experimentally. Thus, we were able to rule out certain models for channel gating, but the true motion has yet to be determined.

The electrostatics of VDAC: implications for selectivity and gating.

Le canal d&#x26;#39;anions d&#xE9;pendant de la tension (VDAC) est la principale voie de m&#xE9;diation du transfert des m&#xE9;tabolites et des ions &#xE0; travers la membrane mitochondriale externe. Deux caract&#xE9;ristiques de la cha&#xEE;ne &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;tat ouvert de flux de forte sont m&#xE9;tabolite et la s&#xE9;lectivit&#xE9; d&#x26;#39;anions, tout en les blocs d&#x26;#39;&#xE9;tat partiellement ferm&#xE9;s et m&#xE9;tabolites est s&#xE9;lective aux cations. Nous rapportons ici les r&#xE9;sultats des calculs effectu&#xE9;s &#xE9;lectrostatique sur la structure r&#xE9;cemment d&#xE9;termin&#xE9;e &#xE0; haute r&#xE9;solution de VDAC1 murin (mVDAC1). Poisson-Boltzmann calculs montrent que le transfert d&#x26;#39;&#xE9;nergie des ions libres &#xE0; travers le canal est favorable pour les anions, ce qui sugg&#xE8;re que mVDAC1 repr&#xE9;sente l&#x26;#39;&#xE9;tat ouvert. Cette affirmation est &#xE9;tay&#xE9;e par de Poisson-Nernst-Planck calculs qui pr&#xE9;disent une forte mono-canal de conductance indicative de l&#x26;#39;&#xE9;tat ouvert et une s&#xE9;lectivit&#xE9; anion de 1,75 - pr&#xE8;s d&#x26;#39;un double s&#xE9;lectivit&#xE9; pour les anions plus cations. Ces calculs ont &#xE9;t&#xE9; r&#xE9;p&#xE9;t&#xE9;s sur les cha&#xEE;nes de mutants et a donn&#xE9; les changements de s&#xE9;lectivit&#xE9; en accord avec les observations exp&#xE9;rimentales. Nous &#xE9;tions alors en mesure de concevoir in silico mutant canal avec trois mutations ponctuelles qui se sont convertis mVDAC1 dans un canal avec une pr&#xE9;f&#xE9;rence pour les cations. Enfin, nous avons &#xE9;tudi&#xE9; deux propositions de la fa&#xE7;on dont les portes de canaux entre l&#x26;#39;ouvert et l&#x26;#39;&#xE9;tat ferm&#xE9;. Les deux mod&#xE8;les impliquent le mouvement de l&#x26;#39;h&#xE9;lice N-terminale, mais ni mouvement produit la sensibilit&#xE9; de tension observ&#xE9;e, ni ne soit r&#xE9;sultat du mod&#xE8;le dans un canal s&#xE9;lective pour les cations, ce qui est observ&#xE9; exp&#xE9;rimentalement. Ainsi, nous avons pu exclure certains mod&#xE8;les pour d&#xE9;clenchement voie, mais le vrai mouvement doit encore &#xEA;tre d&#xE9;termin&#xE9;e.

Les Electrostatique de VDAC: implications pour la s&#xE9;lectivit&#xE9; et ouverture de porte

Der Spannung-abh&auml;ngigen Anion Channel (VDAC) ist der gro&szlig;e Weg, die Vermittlung des Transfers von Metaboliten und Ionen in der mitochondrialen Au&szlig;enmembran. Zwei Markenzeichen des Kanals in den ge&ouml;ffneten Zustand sind hohe Metabolit Flussmittel und Anion Selektivit&auml;t, w&auml;hrend der teilweise geschlossene Zustand Metaboliten blockiert und kation selektiv ist. Hier melden wir die Ergebnisse von Elektrostatik-Berechnungen, die auf die vor kurzem ermittelte hochaufl&ouml;sende Struktur des murinen VDAC1 durchgef&uuml;hrt (mVDAC1). Poisson-Boltzmann-Berechnungen zeigen, dass die Ionen Transfer freie Energie durch den Kanal g&uuml;nstig f&uuml;r die Anionen ist, was darauf hindeutet, dass diese mVDAC1 den offenen Zustand darstellt. Im Gegensatz dazu diese Behauptung ist von Poisson-Nernst-Planck-Berechnungen, die eine hohe Einkanal-Leitwert deutet auf den ge&ouml;ffneten Zustand und ein Anion-Selektivit&auml;t von 1,75--fast eine doppelte Selektivit&auml;t f&uuml;r Anionen &uuml;ber kationen Vorhersagen. Diese Berechnungen wurden auf mutierten Kan&auml;le wiederholt und gab Selektivit&auml;t &Auml;nderungen in &Uuml;bereinstimmung mit der experimentellen Beobachtungen. Dann konnten wir eine in Silico Ingenieur Mutante Kanal mit drei Punktmutationen, die mVDAC1 in einen Kanal mit einer Vorliebe f&uuml;r kationen umgewandelt. Schlie&szlig;lich untersuchen wir zwei Vorschl&auml;ge f&uuml;r wie der Kanal zwischen offenen und geschlossenen Zustand Tore. Beide Modelle beinhalten die Bewegung der N-terminalen Helix, aber weder Bewegung produziert die beobachteten Spannung Empfindlichkeit, noch Tat entweder Modell resultieren in einem kation-selektive Kanal, das experimentell beobachtet wird. So konnten wir bestimmte Modelle f&uuml;r Kanal Anspritzung ausschlie&szlig;en, aber die wahre Bewegung muss noch ermittelt werden.

Die elektrostatische Aufladung des VDAC: Implikationen f&uuml;r Selektivit&auml;t und Anspritzung.

Il canale voltaggio-dipendente anione (VDAC) &egrave; la principale via mediando il trasferimento di metaboliti e ioni attraverso la membrana mitocondriale esterna. Due tratti distintivi del canale nello stato aperto sono selettivit&agrave; disossidante e anione alta metabolita, mentre stato parzialmente chiuso &egrave; cationico selettivo e blocchi di metaboliti. Riportiamo i risultati di electrostatics calcoli effettuati sulla struttura recentemente determinata ad alta risoluzione di VDAC1 murino (mVDAC1). Poisson-Boltzmann calcoli mostrano che l&#39;energia libera di trasferimento dello ione attraverso il canale &egrave; favorevole per gli anioni, suggerendo che mVDAC1 rappresenta lo stato di aperto. Questo reclamo &egrave; sostenuto da calcoli Poisson-Nernst-Planck che prevedono un&#39;elevata conduttanza monocanale indicativa dello stato aperto e una selettivit&agrave; anione di 1,75 - quasi una duplice selettivit&agrave; per gli anioni sopra cationi. Questi calcoli sono stati ripetuti su canali mutanti e ha dato le modifiche selettivit&agrave; in accordo con le osservazioni sperimentali. Siamo stati poi in grado di progettare un in silico canale mutante con tre mutazioni puntiformi che convertito mVDAC1 in un canale con una preferenza per i cationi. Infine, abbiamo studiato due proposte per come il canale cancelli tra l&#39;aperto e stato chiuso. Entrambi i modelli prevedono il movimento dell&#39;elica N-terminale, ma n&eacute; movimento prodotto la sensibilit&agrave; osservata tensione, n&eacute; ha o modello risultato in un canale cationico selettivo, che &egrave; stato osservato sperimentalmente. Cos&igrave;, siamo stati in grado di escludere alcuni modelli per canale gating, ma il moto vero deve ancora essere determinato.

Il electrostatics di VDAC: implicazioni per la selettivit&agrave; e gating.

&#x96FB;&#x4F4D;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30A2;&#x30CB;&#x30AA;&#x30F3;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#xFF08;VDAC&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x5916;&#x819C;&#x3092;&#x6A2A;&#x5207;&#x3063;&#x3066;&#x306E;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x7269;&#x3068;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x306E;&#x79FB;&#x52D5;&#x3092;&#x5A92;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x30AA;&#x30FC;&#x30D7;&#x30F3;&#x72B6;&#x614B;&#x306E;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;2&#x3064;&#x306E;&#x7279;&#x5FB4;&#x306F;&#x3001;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x306B;&#x9589;&#x3058;&#x305F;&#x72B6;&#x614B;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x3057;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x9AD8;&#x3044;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x7269;&#x30D5;&#x30E9;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3068;&#x9670;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x9078;&#x629E;&#x6027;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x3001;&#x967D;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x9078;&#x629E;&#x7684;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;VDAC1&#xFF08;mVDAC1&#xFF09;&#x306E;&#x6700;&#x8FD1;&#x306E;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x9AD8;&#x5206;&#x89E3;&#x80FD;&#x69CB;&#x9020;&#x3067;&#x884C;&#x308F;&#x9759;&#x96FB;&#x6C17;&#x8A08;&#x7B97;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x30DD;&#x30A2;&#x30BD;&#x30F3; - &#x30DC;&#x30EB;&#x30C4;&#x30DE;&#x30F3;&#x306E;&#x8A08;&#x7B97;&#x306F;mVDAC1&#x304C;&#x958B;&#x3044;&#x305F;&#x72B6;&#x614B;&#x3092;&#x8868;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3001;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x79FB;&#x52D5;&#x81EA;&#x7531;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x304C;&#x9670;&#x306B;&#x6709;&#x5229;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x4E0A;&#x306E;&#x30A2;&#x30CB;&#x30AA;&#x30F3;&#x306E;&#x307B;&#x307C;&#x4E8C;&#x91CD;&#x306E;&#x9078;&#x629E; - &#x3053;&#x306E;&#x4E3B;&#x5F35;&#x306F;&#x3001;&#x30AA;&#x30FC;&#x30D7;&#x30F3;&#x72B6;&#x614B;&#x3068;1.75&#x306E;&#x30A2;&#x30CB;&#x30AA;&#x30F3;&#x9078;&#x629E;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x9AD8;&#x3044;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x30EB;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C0;&#x30AF;&#x30BF;&#x30F3;&#x30B9;&#x3092;&#x4E88;&#x6E2C;&#x30DD;&#x30A2;&#x30BD;&#x30F3;&#xB7;&#x30CD;&#x30EB;&#x30F3;&#x30B9;&#x30C8; - &#x30D7;&#x30E9;&#x30F3;&#x30AF;&#x306E;&#x8A08;&#x7B97;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5F37;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x8A08;&#x7B97;&#x306F;&#x3001;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x4E0A;&#x3067;&#x7E70;&#x308A;&#x8FD4;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x5B9F;&#x9A13;&#x7D50;&#x679C;&#x3068;&#x4E00;&#x81F4;&#x3057;&#x3066;&#x9078;&#x629E;&#x6027;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x305F;&#x3002;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x3001;&#x967D;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x306E;&#x512A;&#x5148;&#x9806;&#x4F4D;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306B;mVDAC1&#x5909;&#x63DB;3&#x70B9;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x3068;&#x30B7;&#x30EA;&#x30B3;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30B8;&#x30CB;&#x30A2;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3069;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x30AA;&#x30FC;&#x30D7;&#x30F3;&#x3068;&#x9589;&#x9396;&#x72B6;&#x614B;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C8;&#x306E;2&#x3064;&#x306E;&#x63D0;&#x6848;&#x3092;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x306F;&#x3001;N&#x672B;&#x7AEF;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x52D5;&#x304D;&#x3092;&#x4F34;&#x3046;&#x304C;&#x3001;&#x3069;&#x3061;&#x3089;&#x3082;&#x52D5;&#x304D;&#x306F;&#x89B3;&#x6E2C;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x96FB;&#x5727;&#x611F;&#x5EA6;&#x3092;&#x751F;&#x7523;&#x3057;&#x3001;&#x307E;&#x305F;&#x5B9F;&#x9A13;&#x7684;&#x306B;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x967D;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x9078;&#x629E;&#x6027;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x7D50;&#x679C;&#x306E;&#x3044;&#x305A;&#x308C;&#x304B;&#x3092;&#x884C;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x305D;&#x3053;&#x3067;&#x3001;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3092;&#x6392;&#x9664;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x771F;&#x306E;&#x52D5;&#x304D;&#x304C;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x3002;

VDAC&#x306E;&#x9759;&#x96FB;&#x6C17;&#xFF1A;&#x9078;&#x629E;&#x3068;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C8;&#x3078;&#x306E;&#x30A4;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;

&#xC804;&#xC555; &#xC885;&#xC18D; &#xC74C;&#xC774;&#xC628; &#xCC44;&#xB110; (VDAC) &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC;&#xB9AC; &#xC544; &#xBC14;&#xAE65; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; &#xB300;&#xC0AC; &#xC0B0;&#xBB3C; &#xBC0F; &#xC774;&#xC628;&#xC758; &#xC591;&#xB3C4; &#xC911;&#xC7AC; &#xD558;&#xB294; &#xC8FC;&#xC694; &#xD1B5;&#xB85C; &#xC774;&#xB2E4;. &#xC624;&#xD508; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC740; &#xB192;&#xC740; &#xB300;&#xC0AC; &#xC0B0;&#xBB3C; &#xD50C;&#xB7ED;&#xC2A4;&#xC640; &#xC74C;&#xC774;&#xC628; &#xC120;&#xD0DD;&#xB3C4; &#xBD80;&#xBD84;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xB2EB;&#xD78C;&#xB41C; &#xC0C1;&#xD0DC; metabolites&#xB97C; &#xCC28;&#xB2E8; &#xD558; &#xACE0; &#xC591;&#xC774;&#xC628; &#xC120;&#xD0DD;&#xC801;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; murine VDAC1 &#xCD5C;&#xADFC;&#xC5D0; &#xD655;&#xC778;&#xB41C; &#xB41C; &#xACE0;&#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0; &#xB354;&#xD574;&#xC9C0;&#xBA74; &#xACC4;&#xC0B0;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xACFC; &#xBCF4;&#xACE0; (mVDAC1). &#xD3EC;&#xC544;&#xC1A1; &#xBCFC;&#xCE20;&#xB9CC; &#xACC4;&#xC0B0; &#xC774;&#xC628; &#xC804;&#xC1A1; &#xC790;&#xC720; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xCC44;&#xB110;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC74C;&#xC774;&#xC628;, &#xADF8; mVDAC1 &#xC624;&#xD508; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC81C;&#xC548;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC720;&#xB9AC;&#xD55C; &#xAC83;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xD074;&#xB808;&#xC784;&#xC740; &#xC5F4;&#xB9B0; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC640; 1.75-&#xC74C;&#xC774;&#xC628; &#xC591;&#xC774;&#xC628;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC70;&#xC758; 2 &#xC911; &#xC120;&#xD0DD;&#xB3C4; &#xC74C;&#xC774;&#xC628; &#xC120;&#xD0DD;&#xB3C4; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xB192;&#xC740; &#xB2E8;&#xC77C; &#xCC44;&#xB110; &#xC804;&#xB3C4;&#xB3C4; &#xC608;&#xCE21; &#xD558;&#xB294; &#xD3EC;&#xC544;&#xC1A1;-&#xB124;&#xB978;&#xC2A4;&#xD2B8;-&#xD50C;&#xB791;&#xD06C; &#xACC4;&#xC0B0; buttressed. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACC4;&#xC0B0;&#xACFC; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xCC44;&#xB110;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC18;&#xBCF5; &#xB41C; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xAD00;&#xCC30;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xC120;&#xD0DD;&#xB3C4; &#xBCC0;&#xD654;&#xB97C; &#xC8FC;&#xC5C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB2E4;&#xC74C;&#xC5D0; silico &#xC5D4;&#xC9C0;&#xB2C8;&#xC5B4; &#xC218; &#xC788;&#xC5C8;&#xB2E4; Mvdac1&#xC744; &#xC591;&#xC774;&#xC628;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC120;&#xD638;&#xC640; &#xCC44;&#xB110;&#xC744; &#xBCC0;&#xD658; &#xD558;&#xB294; &#xC138; &#xC810; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC640; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xCC44;&#xB110;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xCC44;&#xB110; &#xC624;&#xD508; &#xBC0F; &#xB2EB;&#xD78C;&#xB41C; &#xC0C1;&#xD0DC; &#xC0AC;&#xC774; &#xAC8C;&#xC774;&#xCE20; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC81C;&#xC548;&#xC744; &#xC870;&#xC0AC; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB450; &#xBAA8;&#xB378; &#xBAA8;&#xB450; N &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xB098;&#xC120;&#xD615;&#xC758; &#xC6C0;&#xC9C1;&#xC784;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xB450; &#xBAA8;&#xC158; &#xC81C;&#xC791; &#xAD00;&#xCC30; &#xB41C; &#xC804;&#xC555; &#xAC10;&#xB3C4; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB418;&#xC5B4; &#xC591;&#xC774;&#xC628; &#xC120;&#xD0DD;&#xC801; &#xCC44;&#xB110; &#xC911; &#xBAA8;&#xB378; &#xACB0;&#xACFC; &#xC54A;&#xC558;&#xB2E4;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, &#xC6B0;&#xB9AC; &#xCC44;&#xB110; &#xAC8C;&#xC774;&#xD305;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD2B9;&#xC815; &#xBAA8;&#xB378;&#xC744; &#xC81C;&#xC678;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC5C8;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC9C4;&#xC815;&#xD55C; &#xBAA8;&#xC158; &#xC544;&#xC9C1; &#xACB0;&#xC815; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;.

VDAC &#xB354;&#xD574;&#xC9C0;&#xBA74;: &#xAC8C;&#xC774;&#xD305; &#xBC0F; &#xC120;&#xD0DD;&#xB3C4; &#xB300; &#xD55C; &#xC758;&#xBBF8;.

El canal de aniones dependiente de la tensi&#xF3;n (VDAC) es la principal v&#xED;a de mediaci&#xF3;n de la transferencia de los metabolitos y los iones a trav&#xE9;s de la membrana externa mitocondrial. Dos caracter&#xED;sticas de la canal en el estado abierto son de alto flujo y selectividad metabolito ani&#xF3;n, mientras que los bloques parcialmente cerrados estado metabolitos y es cati&#xF3;nico selectivo. Aqu&#xED; mostramos los resultados de los c&#xE1;lculos de la electrost&#xE1;tica llevadas a cabo en la estructura de determinado recientemente de alta resoluci&#xF3;n de VDAC1 murino (mVDAC1). Poisson-Boltzmann c&#xE1;lculos muestran que la energ&#xED;a libre de transferencia de iones a trav&#xE9;s del canal es favorable para los aniones, lo que sugiere que mVDAC1 representa el estado abierto. Esta afirmaci&#xF3;n se ve reforzada por Poisson-Nernst-Planck c&#xE1;lculos que predicen un solo canal de alta conductancia de indicativo del estado de apertura y una selectividad ani&#xF3;n de 1,75 - casi el doble para una selectividad m&#xE1;s de cationes aniones. Estos c&#xE1;lculos se repitieron en los canales mutantes y dio los cambios de selectividad de acuerdo con las observaciones experimentales. Est&#xE1;bamos entonces capaz de dise&#xF1;ar un canal de in silico mutante con tres mutaciones puntuales que se convirtieron en un canal de mVDAC1 con una preferencia para los cationes. Por &#xFA;ltimo, hemos investigado dos propuestas de c&#xF3;mo las puertas del canal entre la apertura y el estado cerrado. Ambos modelos implican el movimiento de la h&#xE9;lice N-terminal, pero tampoco movimiento producido la sensibilidad de voltaje observado, ni tampoco sea resultado modelo en un canal de cati&#xF3;n-selectiva, que se observa experimentalmente. Por lo tanto, hemos sido capaces de descartar ciertos modelos de canal gating, pero el movimiento real a&#xFA;n no se ha determinado.

Los Electrost&#xE1;tica de VDAC: Implicaciones para la Selectividad y de apertura de puerta

&#x79EF;&#x5206;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x4ECD;&#x7136;&#x5BF9;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7EC4;&#x5B66;&#x7684;&#x6311;&#x6218;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x5B83;&#x4EEC;&#x5305;&#x542B;&#x57DF;&#x4E0E;&#x7406;&#x5316;&#x6027;&#x8D28;&#x4E0D;&#x592A;&#x9002;&#x7528;&#x4E8E;&#x4ECA;&#x5929;&#x7684;&#x81EA;&#x4E0B;&#x800C;&#x4E0A;&#x7684;&#x534F;&#x8BAE;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x8DE8;&#x819C;&#x533A;&#x57DF;&#x6F5C;&#x5728;&#x53EF;&#x80FD;&#x5305;&#x542B;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x540E;&#x4FEE;&#x6539;&#x529F;&#x80FD;&#x610F;&#x4E49;&#x7684;&#x56E0;&#x6B64;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x57DF;&#x8986;&#x76D6;&#x9762;&#x6269;&#x5927;&#x534F;&#x8BAE;&#x7684;&#x53D1;&#x5C55;&#x662F;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x3002;&#x5B9E;&#x73B0;&#x8FD9;&#x4E00;&#x76EE;&#x6807;&#x7684;&#x4E00;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x662F;&#x901A;&#x8FC7;&#x4F7F;&#x7528;&#x81EA;&#x4E0A;&#x800C;&#x4E0B;&#x7684;&#x8D28;&#x8C31;&#x8D28;&#x8C31;&#x6CD5;&#x5373;&#x53D7;&#x5230;&#x5B8C;&#x6574;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x548C;&#x5206;&#x89E3;&#x3002;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x4ECB;&#x7ECD;&#x5085;&#x91CC;&#x53F6;&#x53D8;&#x6362;&#x4E0E; collisionally &#x6FC0;&#x6D3B;&#x89E3;&#x79BB;&#x7814;&#x7A76; polyhelix &#x675F;&#x548C;&#x8DE8;&#x819C;&#x5B54;&#x56FE;&#x6848;&#x4E0E;&#x5206;&#x5B50;&#x7FA4;&#x4F17;&#x5230; 35 kDa post-translationally &#x4FEE;&#x6539;&#x79EF;&#x5206;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x8D28;&#x8C31;&#x6CD5;&#x81EA;&#x4E0A;&#x800C;&#x4E0B;&#x7684;&#x9AD8;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x3002;&#x7EC6;&#x83CC;&#x89C6;&#x7D2B;&#x7EA2;&#x8D28; holoprotein &#x7684;&#x5728;&#x7EBF;&#x6DB2;&#x76F8;&#x8272;&#x8C31;-&#x8D28;&#x8C31;&#x5206;&#x6790;&#x4EA7;&#x751F; b-&#x548C; y-&#x79BB;&#x5B50;&#xFF0C;&#x6DB5;&#x76D6;&#x5168;&#x9762;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5E8F;&#x5217;&#x548C;&#x5206;&#x89E3; 79 247 &#x80BD;&#x503A;&#x5238; (32%)&#x3002;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x8BC1;&#x660E;&#x6210;&#x719F;&#x7684;&#x5E8F;&#x5217;&#x7EC4;&#x6210;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559; 14-261&#xFF0C;&#x786E;&#x8BA4; N-&#x672B;&#x7AEF;&#x80BD;&#x5288;&#x88C2;&#x548C;&#x5421;&#x54AF;&#x70F7;&#x916E;&#x7FA7;&#x9178; N &#x7EC8;&#x7AEF;&#x8C37;&#x6C28;&#x9170;&#x80FA;-14 &#x8F6C;&#x6362; &#xFF08;-17.02 Da) &#x548C; Asp 262 C &#x7EC8;&#x7AEF;&#x53BB;&#x9664;&#x3002;Collisionally &#x6D3B;&#x5316;&#x7684;&#x5206;&#x89E3;&#x788E;&#x7247;&#x4E4B;&#x95F4;&#x5728; Lys-229&#xFF0C;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E00;&#x7247;&#x7684;&#x552F;&#x4E00;&#x53EF;&#x7528;&#x80FA;&#x6B8B;&#x7559; 225 248 &#x672C;&#x5730;&#x5316; N(6)-(retinylidene) &#x4FEE;&#x6539; (266.20 Da)&#x3002;&#x79BB;&#x7EBF;&#x6BCD;&#x4F53;&#x7684;&#x6240;&#x6709;&#x516B;&#x4E2A;&#x4E9A;&#x57FA;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8272;&#x7D20; b (6) &#x4ECE;&#x5FF5;&#x73E0;&#x85FB; PCC 7120 &#x5B9A;&#x4E49;&#x5404;&#x79CD;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x540E;&#x7684;&#x4FEE;&#x6539;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC;&#x5171;&#x4EF7;&#x952E;&#x7684;&#x84DD;&#x85FB;&#x7684; f &#x590D;&#x6742;&#x8FDE;&#x63A5;&#x9ED1; (615.17 Da) c &#x6885;&#x65AF;&#x5BF9;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8272;&#x7D20; f &#x548C;&#x5C0F;&#x9F20;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x9634;&#x79BB;&#x5B50;&#x901A;&#x9053; b.&#x5206;&#x6790;&#x5EFA;&#x7ACB;&#x8DE8;&#x819C;&#x6BCF;&#x6876; beta &#x7684;&#x81EA;&#x4E0A;&#x800C;&#x4E0B;&#x7684; MS &#x7684;&#x53EF;&#x884C;&#x6027;&#x548C;&#x672C;&#x5730;&#x5316; Ro 68 3400 Cys 232 &#x5728;&#x6291;&#x5236;&#x4FEE;&#x6539;&#x7F51;&#x7AD9;&#x3002;&#x51E1;&#x4E2D;&#x6027;&#x4E22;&#x5931;&#x7684;&#x4FEE;&#x6539;&#x662F;&#x4E00;&#x4E2A;&#x56E0;&#x7D20;&#xFF0C;&#x8FDB;&#x884C;&#x4FEE;&#x6539;&#x7684;&#x4EA7;&#x54C1;&#x79BB;&#x5B50;&#x5E94;&#x8BE5;&#x7528;&#x4E8E;&#x5206;&#x914D;&#x5176;&#x7ACB;&#x573A;&#x3002;&#x867D;&#x7136;&#x503A;&#x5238;&#x5288;&#x88C2;&#x4E00;&#x4E9B;&#x8DE8;&#x819C; &alpha; &#x87BA;&#x65CB;&#x57DF;&#x4E2D;&#x7684;&#x6709;&#x6548;&#xFF0C;&#x4F46;&#x5176;&#x4ED6;&#x5730;&#x533A;&#x90FD;&#x96BE;&#x6CBB;&#x6027;&#x7B49;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E3B;&#x8981;&#x7ED3;&#x6784;&#x53EA;&#x53EF;&#x4EE5;&#x63A8;&#x65AD;&#x8FD9;&#x4E2A;&#x5DE7;&#x5408;&#x4E0E;&#x8DE8;&#x8D8A;&#x5B83;&#x4EEC;&#x7684;&#x524D;&#x4F53;&#x3001; &#x4EA7;&#x54C1;&#x79BB;&#x5B50;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x3002;

Collisionally &#x4E0E;&#x81EA;&#x4E0A;&#x800C;&#x4E0B;&#x7684;&#x5085;&#x91CC;&#x53F6;&#x53D8;&#x6362;&#x8D28;&#x8C31;&#x89E3;&#x6790;&#x79EF;&#x5206;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x7FFB;&#x8BD1;&#x540E;&#x4FEE;&#x6539;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x89E3;&#x79BB;&#x3002;

Integral membrane proteins remain a challenge to proteomics because they contain domains with physicochemical properties poorly suited to today's bottom-up protocols. These transmembrane regions may potentially contain post-translational modifications of functional significance, and thus development of protocols for improved coverage in these domains is important. One way to achieve this goal is by using top-down mass spectrometry whereby the intact protein is subjected to mass spectrometry and dissociation. Here we describe top-down high resolution Fourier transform mass spectrometry with collisionally activated dissociation to study post-translationally modified integral membrane proteins with polyhelix bundle and transmembrane porin motifs and molecular masses up to 35 kDa. On-line LC-MS analysis of the bacteriorhodopsin holoprotein yielded b- and y-ions that covered the full sequence of the protein and cleaved 79 of 247 peptide bonds (32%). The experiment proved that the mature sequence consists of residues 14-261, confirming N-terminal propeptide cleavage and conversion of N-terminal Gln-14 to pyrrolidone carboxylic acid (-17.02 Da) and C-terminal removal of Asp-262. Collisionally activated dissociation fragments localized the N(6)-(retinylidene) modification (266.20 Da) between residues 225-248 at Lys-229, the sole available amine in this stretch. Off-line nanospray of all eight subunits of the cytochrome b(6)f complex from the cyanobacterium Nostoc PCC 7120 defined various post-translational modifications, including covalently attached c-hemes (615.17 Da) on cytochromes f and b. Analysis of murine mitochondrial voltage-dependent anion channel established the amenability of the transmembrane beta-barrel to top-down MS and localized a modification site of the inhibitor Ro 68-3400 at Cys-232. Where neutral loss of the modification is a factor, only product ions that carry the modification should be used to assign its position. Although bond cleavage in some transmembrane alpha-helical domains was efficient, other regions were refractory such that their primary structure could only be inferred from the coincidence of genomic translation with precursor and product ions that spanned them.

Post-translational modifications of integral membrane proteins resolved by top-down Fourier transform mass spectrometry with collisionally activated dissociation.

Les prot&#xE9;ines membranaires int&#xE9;grales restent un d&#xE9;fi &#xE0; la prot&#xE9;omique, car ils contiennent des domaines ayant des propri&#xE9;t&#xE9;s physico-chimiques mal adapt&#xE9;es &#xE0; bottom-up d&#x26;#39;aujourd&#x26;#39;hui protocoles. Ces r&#xE9;gions transmembranaires peuvent potentiellement contenir des modifications post-traductionnelles de signification fonctionnelle, et donc le d&#xE9;veloppement de protocoles pour une meilleure couverture dans ces domaines est important. Une fa&#xE7;on d&#x26;#39;atteindre cet objectif est d&#x26;#39;utiliser la spectrom&#xE9;trie de masse de haut en bas dans lequel la prot&#xE9;ine intacte est soumis &#xE0; la spectrom&#xE9;trie de masse et de la dissociation. Nous d&#xE9;crivons ici de haut en bas de Fourier &#xE0; haute r&#xE9;solution par spectrom&#xE9;trie de masse &#xE0; transform&#xE9;e de collision avec dissociation activ&#xE9;e pour &#xE9;tudier modifications post-traductionnelles des prot&#xE9;ines membranaires int&#xE9;grales avec faisceau polyhelix et motifs transmembranaires porines et des masses mol&#xE9;culaires de 35 kDa. On-line analyse LC-MS de la bact&#xE9;riorhodopsine holoprot&#xE9;ine donn&#xE9; b-et y-ions qui couvraient la s&#xE9;quence compl&#xE8;te de la prot&#xE9;ine cliv&#xE9;e et 79 de 247 liaisons peptidiques (32%). L&#x26;#39;exp&#xE9;rience &#xE9;tabli que la s&#xE9;quence mature consiste en les r&#xE9;sidus 14-261 de clivage, confirmant propeptide N-terminale et la conversion de N-terminale Gln-14 &#xE0; l&#x26;#39;acide pyrrolidone carboxylique (-17,02 Da) et C-terminal de l&#x26;#39;enl&#xE8;vement de Asp-262. Collision dissociation activ&#xE9;e fragments localis&#xE9;e du N (6) - (r&#xE9;tinylid&#xE8;ne) la modification (266,20 Da) entre les r&#xE9;sidus 225-248 de Lys-229, l&#x26;#39;amine seule disponible dans ce tron&#xE7;on. Off-line nanospray des huit sous-unit&#xE9;s du cytochrome b (6) f complexe du PCC cyanobact&#xE9;rie Nostoc 7120 d&#xE9;fini diff&#xE9;rents modifications post-traductionnelles, y compris de mani&#xE8;re covalente c-h&#xE8;mes (615,17 Da) sur les cytochromes f et b. Analyse des murin canal anion mitochondrial d&#xE9;pendant de la tension a cr&#xE9;&#xE9; le la susceptibilit&#xE9; de la transmembranaire b&#xEA;ta-canon de haut en bas MS et localis&#xE9;e un site de modification de la Ro 68-3400 inhibiteur &#xE0; Cys-232. En cas de perte neutre de la modification est un facteur, les ions produits qui portent seulement la modification devrait &#xEA;tre utilis&#xE9; pour c&#xE9;der sa position. Bien clivage de la liaison dans certains transmembranaires en h&#xE9;lice alpha domaines a &#xE9;t&#xE9; efficace, d&#x26;#39;autres r&#xE9;gions &#xE9;taient r&#xE9;fractaires tels que leur structure primaire ne pouvait &#xEA;tre d&#xE9;duite de la co&#xEF;ncidence de la traduction g&#xE9;nomique avec des pr&#xE9;curseurs et des ions produits qui les fractionn&#xE9;s.

Modifications post-traductionnelles de prot&#xE9;ines membranaires int&#xE9;grales R&#xE9;solu par Top-down spectrom&#xE9;trie de masse &#xE0; transform&#xE9;e de Fourier avec collision Activ&#xE9; dissociation

Integrale Membranproteine bleiben eine Herausforderung f&uuml;r Proteomics, da diese Dom&auml;nen mit physikalisch-chemischen Eigenschaften schlecht geeignet, um heutige Bottom-up-Protokolle enthalten. Diese Transmembran Regionen k&ouml;nnen potenziell &Uuml;bersetzungs&auml;nderungen funktionale Bedeutung enthalten und somit die Entwicklung von Protokollen f&uuml;r verbesserte Abdeckung in diesen Dom&auml;nen ist wichtig. Eine M&ouml;glichkeit, dieses Ziel zu erreichen ist mithilfe von oben nach unten-Massenspektrometrie, wobei das intakte Protein Massenspektrometrie unterliegt, und Dissoziation. Hier beschreiben wir oben hochaufl&ouml;senden Fourier-Transformation Massenspektrometrie mit collisionally aktivierte Dissoziation, post-translationally ver&auml;nderten integrale Membranproteine mit Polyhelix B&uuml;ndel und Transmembran porin Motiven und Molekulare Massen bis zu 35 kDa zu studieren. On-line LC-MS-Analyse von der Bakteriorhodopsin Holoprotein hat b - und y-Ionen, die bedeckt die vollst&auml;ndige Sequenz des Proteins und zerspaltet 79 von 247 Peptidbindungen (32 %) ergeben. Das Experiment bewiesen, dass die Reife Sequenz von R&uuml;ckst&auml;nden 14-261, Best&auml;tigung N-terminale Propeptid Spaltung und Umwandlung von N-terminalen Gln-14 in pyrrolidon-Carbons&auml;ure besteht (-17.02 Da) und C-terminalen Entfernung von Asp-262. Collisionally aktivierte Dissoziation Fragmente lokalisiert die N(6)-(retinylidene) &Auml;nderung (266.20 Da) zwischen 225-248 R&uuml;ckst&auml;nde bei Lys-229, die alleinige verf&uuml;gbar Amin in dieser Strecke. Off-line Nanospray alle acht Untereinheiten der Cytochrom-b (6) f-Komplex aus der Cyanobacterium Nostoc PCC 7120 definiert verschiedene &Uuml;bersetzungs&auml;nderungen, einschlie&szlig;lich kovalent verbunden c-HEMEN (615.17 Da) auf Zellfarbstoff f und B. Analyse der murinen mitochondriale Spannung-abh&auml;ngigen Anionenkanal eingerichtet die auswirken auf oben MS die Transmembran Beta-Barrel und lokalisiert eine &Auml;nderung-Seite von der Hemmer Ro 68-3400 bei Cys-232. Neutraler Verlust der &Auml;nderung ein Faktor ist, sollte nur Produkt-Ionen, die die &Auml;nderung tragen seine Position zuweisen verwendet werden. Obwohl Bond Spaltung in einige Alpha-Kegelrad Transmembran-Dom&auml;nen effizient war, wurden andere Regionen feuerfeste, so, dass ihre prim&auml;re Struktur nur von der Koinzidenz von genomischen &Uuml;bersetzung mit Vorl&auml;ufer und Produkt Ionen abgeleitet werden k&ouml;nnten, die ihnen erstreckt.

&Uuml;bersetzungs&auml;nderungen von integralen Membranproteinen gel&ouml;st von oben nach unten Fourier Transform Massenspektrometrie mit collisionally aktiviert Dissoziation.

Proteine integrali di membrana rimangono una sfida alla proteomica perch&eacute; contengono domini con propriet&agrave; fisico-chimiche scarsamente adatto ai protocolli bottom-up di oggi. Queste regioni transmembrane possono potenzialmente contenere traslazionali di significato funzionale, e quindi &egrave; importante lo sviluppo di protocolli per una migliore copertura in questi domini. &Egrave; un modo per raggiungere questo obiettivo mediante spettrometria di massa di top-down per cui la proteina intatta &egrave; sottoposto a spettrometria di massa e la dissociazione. Qui descriviamo top-down ad alta risoluzione di Fourier spettrometria di massa con dissociazione collisioni attivato per studiare le proteine di membrana integrale traduzionali modificato con polyhelix bundle e motivi porin transmembrane e masse molecolari fino a 35 kDa. Analisi LC-MS on-line di tutte le bacteriorhodopsin ha reso b-y-ioni e che coprivano l&#39;intera sequenza della proteina e spaccati 79 di 247 legami peptidici (32%). L&#39;esperimento ha dimostrato che la sequenza matura consiste di residui 14-261, confermando la scissione propeptide N-terminale e la conversione del N-terminale Gln-14 a Pirrolidone acido carbossilico (-17.02 Da) e la rimozione del C-terminale di Asp-262. Frammenti di collisioni attivato dissociazione localizzata la modificazione di N(6)-(retinylidene) (266.20 Da) tra residui 225-248 a Lys-229, l&#39;unico disponibile ammina in questo tratto. TGD off-line di tutte le otto subunit&agrave; del citocromo b (6) f complesso dal cyanobacterium Nostoc PCC 7120 definito traslazionali vari, tra cui covalentemente associata c-EMI (Da 615.17) su citocromi f e b. analisi del canale mitocondriale voltaggio-dipendenti murino anione stabilito la disponibilit&agrave; del beta-barilotto transmembrana a top-down MS e localizzato un sito modifica dell&#39;inibitore Ro 68-3400 a Cys-232. Dove neutro perdita della modifica &egrave; un fattore, solo gli ioni prodotti che portano la modifica dovrebbero essere utilizzati per assegnare la posizione. Sebbene legame scissione in alcuni domini transmembrana alfa-elicoidale era efficiente, altre regioni erano refrattari tali che la loro struttura primaria potrebbe solo essere dedotto dalla coincidenza di genomic traduzione con ioni precursore e prodotto che si estendeva su loro.

Traslazionali delle proteine integrali di membrana risolte dall&#39;alto verso il basso Fourier spettrometria di massa con collisioni attivato dissociazione.

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&#xFF08;retinylidene&#xFF09;&#x5909;&#x66F4;&#xFF08;266.20 Da&#xFF09;&#x306E;&#x306E;Lys-229&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30B9;&#x30C8;&#x30EC;&#x30C3;&#x30C1;&#x3067;&#x552F;&#x4E00;&#x5229;&#x7528;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x30A2;&#x30DF;&#x30F3;&#x306E;&#x6B8B;&#x57FA;225&#x304B;&#x3089;248&#x306E;&#x9593;&#x3067; - &#x885D;&#x7A81;&#x3067;&#x6709;&#x52B9;&#x306B;&#x89E3;&#x96E2;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306F;N&#xFF08;6&#xFF09;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x30C1;&#x30C8;&#x30AF;&#x30ED;&#x30FC;&#x30E0;b&#x306E;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x306E;8&#x3064;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#xFF08;6&#xFF09;&#x306E;&#x30AA;&#x30D5;&#xB7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30F3;&#x30CA;&#x30CE;&#x30B9;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x85FB;&#x30CD;&#x30F3;&#x30B8;&#x30E5;&#x30E2;PCC 7120&#x304B;&#x3089;f&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306F;&#x5171;&#x6709;&#x7D50;&#x5408;&#x30B7;&#x30C8;&#x30AF;&#x30ED;&#x30E0;f&#x3068;B&#x4E0A;&#x306E;c-&#x30D8;&#x30E0;&#xFF08;615.17 Da&#xFF09;&#x306E;&#x53D6;&#x308A;&#x4ED8;&#x3051;&#x306A;&#x3069;&#x3001;&#x3055;&#x307E;&#x3056;&#x307E;&#x306A;&#x7FFB;&#x8A33;&#x5F8C;&#x4FEE;&#x98FE;&#x3092;&#x3001;&#x5B9A;&#x7FA9;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x306E;&#x96FB;&#x4F4D;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30A2;&#x30CB;&#x30AA;&#x30F3;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x306F;&#x30C8;&#x30C3;&#x30D7;&#x30C0;&#x30A6;&#x30F3;&#x306E;MS&#x3068;Cys-232&#x3067;&#x963B;&#x5BB3;&#x5264;Ro&#x306E;68&#x304B;&#x3089;3400&#x306E;&#x30ED;&#x30FC;&#x30AB;&#x30E9;&#x30A4;&#x30BA;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x4FEE;&#x98FE;&#x90E8;&#x4F4D;&#x306B;&#x8CAB;&#x901A;&#x3B2;-&#x30D0;&#x30EC;&#x30EB;&#x306E;&#x5F93;&#x9806;&#x3092;&#x8A2D;&#x7ACB;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5909;&#x66F4;&#x306E;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30C8;&#x30E9;&#x30EB;&#x30ED;&#x30B9;&#x304C;&#x8981;&#x56E0;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x5834;&#x5408;&#x306B;&#x306F;&#x3001;&#x4FEE;&#x6B63;&#x3092;&#x904B;&#x3076;&#x552F;&#x4E00;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C0;&#x30AF;&#x30C8;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x3092;&#x5272;&#x308A;&#x5F53;&#x3066;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3079;&#x304D;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x3B1;-&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x958B;&#x88C2;&#x304C;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x304C;&#x3001;&#x4ED6;&#x306E;&#x5730;&#x57DF;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x4E00;&#x6B21;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x307F;&#x3092;&#x524D;&#x99C6;&#x4F53;&#x3068;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x3092;&#x30B9;&#x30D1;&#x30F3;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C0;&#x30AF;&#x30C8;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x3068;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x7FFB;&#x8A33;&#x306E;&#x4E00;&#x81F4;&#x304B;&#x3089;&#x63A8;&#x6E2C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x96E3;&#x6CBB;&#x6027;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002;

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&#xAC00;&#xB09C; &#xD558; &#xAC8C; &#xC624;&#xB298;&#xB0A0;&#xC758; &#xC0C1;&#xD5A5;&#xC2DD; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC5D0; &#xC801;&#xD569; &#xD55C; &#xBB3C;&#xB9AC; &#xD654;&#xD559;&#xC801; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xAC00;&#xC9C4; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; proteomics&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB3C4;&#xC804; &#xB0A8;&#xC544; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xC601;&#xC5ED; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801; &#xC911;&#xC694;&#xC131;&#xC758; &#xD3EC;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xBC88;&#xC5ED; &#xC0C1; &#xC218;&#xC815; &#xD3EC;&#xD568; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBC0F; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xBC94;&#xC704;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC758; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC774; &#xC911;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBAA9;&#xD45C;&#xB97C; &#xB2EC;&#xC131; &#xD558;&#xB294; &#xD55C; &#xAC00;&#xC9C0; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xADF8;&#xB300;&#xB85C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xBCF5;&#xC885; &#xB41C;&#xB2E4; &#xADF8;&#xAC83;&#xC5D0; &#xC758;&#xD558;&#xC5EC; &#xD558;&#xD5A5;&#xC2DD; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xAC83;&#xACFC; &#xBD84;&#xB9AC; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xD558;&#xD5A5;&#xC2DD; &#xACE0;&#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xD4E8; &#xB9AC;&#xC5D0; &#xBCC0;&#xD658; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; polyhelix &#xBC88;&#xB4E4; &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; porin &#xBAA8;&#xD2F0;&#xD504;&#xC640; 35 kDa &#xCD5C;&#xB300; &#xBD84;&#xC790; &#xC9C8;&#xB7C9; post-translationally &#xC218;&#xC815;&#xB41C; &#xC815;&#xC218; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC5F0;&#xAD6C; collisionally &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB41C; &#xBD84;&#xB9AC;&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Bacteriorhodopsin holoprotein&#xC758; &#xC628;&#xB77C;&#xC778; LC MS &#xBD84;&#xC11D; b-&#xBC0F; y-&#xC774;&#xC628;&#xC744; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC804;&#xCCB4; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xB97C; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558; &#xACE0; &#xD2B9;&#xD788; 79 247 &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xCC44;&#xAD8C; (32%)&#xC758; &#xC5BB;&#xC9C0; &#xBABB;&#xD588;&#xB2E4;. &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC99D;&#xBA85; &#xC131;&#xC219;&#xD55C; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; 14-261, N &#xB9E8;&#xB05D; propeptide &#xBD84;&#xC5F4; &#xBC0F; pyrrolidone carboxylic &#xC0B0; N &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; Gln 14 &#xBCC0;&#xD658;&#xD560; &#xD655;&#xC778; &#xAD6C;&#xC131; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4; (-17.02 Da)&#xC640; Asp-262&#xC758; C-&#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC81C;&#xAC70;. Collisionally &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB41C; &#xBD84;&#xB9AC; &#xC870;&#xAC01; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; 225-248 &#xB9AC;&#xC2A4;-229,&#xC774; &#xC2A4;&#xD2B8;&#xB808;&#xCE58;&#xC5D0; &#xB2E8;&#xB3C5; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xC544;&#xBBFC; &#xC0AC;&#xC774; N(6)-(retinylidene) &#xC218;&#xC815; (266.20 Da) &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654;. &#xC624;&#xD504; &#xB77C;&#xC778; nanospray&#xC758; &#xC2DC; &#xD1A0; &#xD06C;&#xB86C; b&#xC758; &#xBAA8;&#xB4E0; 8 &#xAC1C;&#xC758; &#xD558;&#xC704; &#xB2E8;&#xC704; (6) &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; f Nostoc PCC 7120 &#xC815;&#xC758; &#x70AD;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD55C; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xD3EC;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xBC88;&#xC5ED; &#xC0C1; &#xC218;&#xC815; cyanobacterium&#xC5D0;&#xC11C; c-hemes (615.17 Da) &#xD55C;&#xB2E4; f&#xC5D0; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; &#xBC0F; b. &#xBD84;&#xC11D; murine &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC; &#xB9AC;&#xC544; &#xC804;&#xC555; &#xC885;&#xC18D; &#xC74C;&#xC774;&#xC628; &#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xD0D1; &#xB2E4;&#xC6B4; MS &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xBC30;&#xB7F4;&#xC758; &#xC801;&#xC911;&#xC774; &#xACE0; &#xC5B5;&#xC81C;&#xC81C;&#xB85C; 68-3400 Cys-232&#xC5D0;&#xC11C;&#xC758; &#xC218;&#xC815; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xC9C0;&#xC5ED;&#xD654;. &#xC218;&#xC815; &#xC911;&#xB9BD; &#xC190;&#xC2E4; &#xC694;&#xC778;&#xC774; &#xC5B4;&#xB514; &#xC218;&#xC815;&#xC744; &#xC218;&#xD589; &#xD558;&#xB294; &#xC81C;&#xD488; &#xC774;&#xC628;&#xC758; &#xC704;&#xCE58;&#xB97C; &#xC9C0;&#xC815; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD574;&#xC57C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC77C;&#xBD80; &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xC54C;&#xD30C; &#xB098;&#xC120;&#xD615; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCF8;&#xB4DC; &#xC720; &#xBC29; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xACE8;&#xC9DC;&#xAE30;&#xB294; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xADF8;&#xB4E4; &#xC2A4;&#xD32C; &#xC804;&#xC870; &#xBC0F; &#xC81C;&#xD488; &#xC774;&#xC628;&#xACFC; &#xAC8C;&#xB188; &#xBC88;&#xC5ED;&#xC758; &#xC6B0;&#xC5F0;&#xC758; &#xC77C;&#xCE58;&#xC5D0;&#xC11C; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xAE30;&#xBCF8; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xC720;&#xCD94;&#xD560; &#xC218;&#xB9CC; &#xB2E4;&#xB978; &#xC9C0;&#xC5ED; &#xB0B4; &#xD654; &#xD588;&#xB2E4;.

&#xC815;&#xC218; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xD558;&#xD5A5;&#xC2DD; &#xD478;&#xB9AC;&#xC5D0; &#xBCC0;&#xD658; &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D; collisionally &#xD65C;&#xC131;&#xD654; &#xB41C; &#xBD84;&#xB9AC; &#xD558; &#xC5EC; &#xD655;&#xC778; &#xB2E2; &#xC218;&#xC815;.

Las prote&#xED;nas integrales de membrana sigue siendo un reto a la prote&#xF3;mica, ya que contienen dominios con propiedades f&#xED;sico-qu&#xED;micas con pocos recursos para abajo hacia arriba protocolos actuales. Estas regiones transmembrana podr&#xED;an contener modificaciones post-traduccionales de importancia funcional, y por lo tanto el desarrollo de protocolos para mejorar la cobertura de estos dominios es importante. Una forma de lograr este objetivo es mediante el uso de arriba hacia abajo espectrometr&#xED;a de masas por el cual la prote&#xED;na intacta se somete a espectrometr&#xED;a de masas y la disociaci&#xF3;n. A continuaci&#xF3;n se describe arriba hacia abajo de alta resoluci&#xF3;n de Fourier espectrometr&#xED;a de masas de transformaci&#xF3;n con la disociaci&#xF3;n colisional activado para estudiar despu&#xE9;s de la traducci&#xF3;n modificada prote&#xED;nas integrales de membrana con el paquete polyhelix y los motivos de la transmembrana porin y de las masas moleculares de hasta 35 kDa. En l&#xED;nea LC-MS an&#xE1;lisis de la holoprote&#x131;na bacteriorodopsina dado b-e y los iones que cubr&#xED;an la secuencia completa de la prote&#xED;na y se escindi&#xF3; 79 de 247 enlaces pept&#xED;dicos (32%). El experimento demostr&#xF3; que la secuencia madura consiste en residuos 14-261, confirmando N-terminal de la escisi&#xF3;n del prop&#xE9;ptido y la conversi&#xF3;n de la N-terminal Gln-14 a pirrolidona &#xE1;cido carbox&#xED;lico (-17,02 Da) y C-terminal de la eliminaci&#xF3;n de Asp-262. Colisional activado disociaci&#xF3;n fragmenta localiza la N (6) - (retinylidene) modificaci&#xF3;n (266,20 Da) entre los residuos 225-248 de Lys-229, la amina &#xFA;nico disponible en este tramo. Off-line nanospray de los ocho subunidades de la citocromo b (6) f complejo desde el PCC cianobacteria Nostoc 7120 define varias modificaciones post-traduccionales, incluyendo covalentemente c-Hemes (615,17 Da) en citocromos f y b. An&#xE1;lisis de murino canal mitocondrial de aniones dependiente de la tensi&#xF3;n establecida la disponibilidad de la transmembrana barril beta de arriba hacia abajo MS y localizado un sitio de modificaci&#xF3;n de la Ro 68-3400 en el inhibidor de la Cys-232. Cuando la p&#xE9;rdida de neutralidad de la modificaci&#xF3;n es un factor, s&#xF3;lo iones de productos que llevan la modificaci&#xF3;n deber&#xED;a ser usado para ceder su posici&#xF3;n. A pesar de la rotura del enlace en algunos transmembrana helicoidales alfa-dominios era eficiente, otras regiones fueron refractarios de tal manera que su estructura primaria s&#xF3;lo se pod&#xED;a deducir de la coincidencia de la traducci&#xF3;n con la gen&#xF3;mica de precursores y productos que los iones se extendieron.

Modificaciones post-traduccionales de prote&#xED;nas integrales de membrana resuelto por arriba a abajo de Espectrometr&#xED;a de Masas por Transformada de Fourier con la disociaci&#xF3;n colisional Activado

Cristalograf&#xED;a de prote&#xED;nas de membrana se aver&#xED;a en la fase de determinaci&#xF3;n de fase debido a la difracci&#xF3;n de cristales pobres y la incapacidad de identificar derivatizaci&#xF3;n &#xE1;tomo pesado antes de la recolecci&#xF3;n de datos. Por lo tanto, la mayor&#xED;a de tiempo, esfuerzo y recursos se invierten preparar posibles cristales derivatizados de sincrotr&#xF3;n recolecci&#xF3;n y an&#xE1;lisis de datos sin el conocimiento del etiquetado &#xE1;tomo pesado. Para eliminar esta incertidumbre, se introduce detecci&#xF3;n por fluorescencia de pesado etiquetado Atom (FD-HAL) con tetrametilrodamina-5-maleimida (un compuesto de maleimida fluorescente) para supervisar la accesibilidad en gel residuo de ciste&#xED;na y la modificaci&#xF3;n covalente determinar por el mercurio, el platino y los compuestos de oro. Hemos probado esta t&#xE9;cnica en tres prote&#xED;nas integrales de membrana (vSGLT Lacy, y mVDAC1) y puede evaluar r&#xE1;pidamente las concentraciones &#xF3;ptimas, el tiempo y el compuesto &#xE1;tomo pesado para derivatizar residuos de ciste&#xED;na libre a fin de facilitar la eliminaci&#xF3;n de cristal. Esto, junto con la ciste&#xED;na de exploraci&#xF3;n para la incorporaci&#xF3;n de &#xE1;tomos pesados &#x200B;&#x200B;en lugares estrat&#xE9;gicos, es una &#xFA;til herramienta que ser&#xE1; de gran ayuda en la eliminaci&#xF3;n de estructuras de prote&#xED;nas de membrana.

Detecci&#xF3;n por fluorescencia de pesado etiquetado Atom (FD-HAL): Un procedimiento r&#xE1;pido para identificar modificados covalentemente residuos de ciste&#xED;na por &#xE1;tomos de ajuste de fase

&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x6676;&#x4F53;&#x5B66;&#x7ECF;&#x5E38;&#x6863;&#x5DEE;&#x6676;&#x4F53;&#x884D;&#x5C04;&#x548C;&#x65E0;&#x6CD5;&#x786E;&#x5B9A;&#x6570;&#x636E;&#x6536;&#x96C6;&#x524D;&#x7684;&#x91CD;&#x539F;&#x5B50;&#x884D;&#x751F;&#x9636;&#x6BB5;&#x786E;&#x5B9A;&#x9636;&#x6BB5;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x5927;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x65F6;&#x95F4;&#x3001; &#x7CBE;&#x529B;&#x548C;&#x8D44;&#x6E90;&#x90FD;&#x6295;&#x5165;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x884D;&#x751F;&#x7269;&#x7684;&#x6676;&#x4F53;&#x51C6;&#x5907;&#x540C;&#x6B65;&#x8F90;&#x5C04;&#x6570;&#x636E;&#x6536;&#x96C6;&#x548C;&#x5206;&#x6790;&#x7684;&#x91CD;&#x539F;&#x5B50;&#x8D34;&#x6807;&#x4E0D;&#x77E5;&#x60C5;&#x7684;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#x3002;&#x82E5;&#x8981;&#x5220;&#x9664;&#x8FD9;&#x79CD;&#x4E0D;&#x786E;&#x5B9A;&#x6027;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5F15;&#x5165;&#x8367;&#x5149;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x91CD;&#x539F;&#x5B50;&#x6807;&#x8BB0; (FD-HAL) &#x4F7F;&#x7528; tetramethylrhodamine-5-&#x9A6C;&#x6765;&#x9170;&#x4E9A;&#x80FA; &#xFF08;&#x8367;&#x5149;&#x9A6C;&#x6765;&#x9170;&#x4E9A;&#x80FA;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#xFF09;&#xFF0C;&#x76D1;&#x6D4B;&#x5728;&#x51DD;&#x80F6;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x7559;&#x8F85;&#x52A9;&#x529F;&#x80FD;&#x548C;&#x786E;&#x5B9A;&#x7531;&#x6C5E;&#x3001; &#x767D;&#x91D1;&#x548C;&#x9EC4;&#x91D1;&#x5316;&#x5408;&#x7269;&#x5171;&#x4EF7;&#x4FEE;&#x9970;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x4E86;&#x8FD9;&#x79CD;&#x6280;&#x672F;&#x5BF9;&#x4E09;&#x79CD;&#x4E00;&#x4F53;&#x5F0F;&#x819C;&#x86CB;&#x767D; (&#x83B1;&#x897F;&#x3001; vSGLT &#x548C; mVDAC1)&#xFF0C;&#x5E76;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5FEB;&#x901F;&#x8BC4;&#x4F30;&#x7684;&#x6700;&#x4F73;&#x6D53;&#x5EA6;&#x3001; &#x65F6;&#x95F4;&#x548C;&#x91CD;&#x539F;&#x5B50;&#x590D;&#x5408;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x4FBF;&#x5229;&#x6676;&#x4F53;&#x9010;&#x6B65; derivatize &#x514D;&#x8D39;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x3002;&#x626B;&#x63CF;&#x5C06;&#x7EB3;&#x5165;&#x6218;&#x7565;&#x9635;&#x5730;&#xFF0C;&#x91CD;&#x539F;&#x5B50;&#x7684;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x7ED3;&#x5408;&#x8FD9;&#x662F;&#x4E00;&#x4E2A;&#x6709;&#x7528;&#x7684;&#x5DE5;&#x5177;&#xFF0C;&#x5C06;&#x5927;&#x5927;&#x6709;&#x52A9;&#x4E8E;&#x5BF9;&#x9010;&#x6B65;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x7ED3;&#x6784;&#x3002;

&#x8367;&#x5149;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x91CD;&#x539F;&#x5B50;&#x6807;&#x8BB0; (FD-HAL)&#xFF1A; &#x5171;&#x4EF7;&#x952E;&#x8BC6;&#x522B;&#x5FEB;&#x901F;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6539;&#x6027;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x7559;&#x9010;&#x6B65;&#x539F;&#x5B50;&#x3002;

Membrane protein crystallography frequently stalls at the phase determination stage due to poor crystal diffraction and the inability to identify heavy atom derivatization prior to data collection. Thus, a majority of time, effort and resources are invested preparing potential derivatized crystals for synchrotron data collection and analysis without knowledge of heavy atom labeling. To remove this uncertainty, we introduce Fluorescence Detection of Heavy Atom Labeling (FD-HAL) using tetramethylrhodamine-5-maleimide (a fluorescent maleimide compound) to monitor in-gel cysteine residue accessibility and ascertain covalent modification by mercury, platinum and gold compounds. We have tested this technique on three integral membrane proteins (LacY, vSGLT and mVDAC1) and can quickly assess the optimal concentrations, time and heavy atom compound to derivatize free cysteine residues in order to facilitate crystal phasing. This, in conjunction with cysteine scanning for incorporating heavy atoms at strategic positions, is a useful tool that will considerably assist in phasing membrane protein structures.

Fluorescence Detection of Heavy Atom Labeling (FD-HAL): A rapid method for identifying covalently modified cysteine residues by phasing atoms.

Cristallographie des prot&#xE9;ines membranaires cale fr&#xE9;quemment au stade de la d&#xE9;termination de la phase d&#xFB; &#xE0; la diffraction de cristal pauvres et l&#x26;#39;incapacit&#xE9; &#xE0; identifier d&#xE9;rivatisation atome lourd avant la collecte des donn&#xE9;es. Ainsi, la majorit&#xE9; du temps, d&#x26;#39;efforts et les ressources sont investies pr&#xE9;paration potentiels cristaux d&#xE9;riv&#xE9;s pour synchrotron de collecte de donn&#xE9;es et d&#x26;#39;analyse &#xE0; l&#x26;#39;insu de l&#x26;#39;&#xE9;tiquetage atome lourd. Pour lever cette incertitude, nous introduisons de d&#xE9;tection de fluorescence Atom &#xE9;tiquetage lourd (FD-HAL) en utilisant t&#xE9;tram&#xE9;thylrhodamine-5-mal&#xE9;imide (un compos&#xE9; mal&#xE9;imide fluorescente) pour surveiller en gel accessibilit&#xE9; r&#xE9;sidu cyst&#xE9;ine et de v&#xE9;rifier la modification covalente par le mercure, compos&#xE9;s du platine et d&#x26;#39;or. Nous avons test&#xE9; cette technique sur trois prot&#xE9;ines membranaires int&#xE9;grales (Lacy, vSGLT et mVDAC1) et peuvent rapidement &#xE9;valuer les concentrations optimales, le temps et compos&#xE9;s d&#x26;#39;atomes lourds pour d&#xE9;river des r&#xE9;sidus cyst&#xE9;ine libres afin de faciliter l&#x26;#39;&#xE9;limination progressive de cristal. Ceci, en conjonction avec la cyst&#xE9;ine &#xE0; balayage pour l&#x26;#39;incorporation des atomes lourds &#xE0; des endroits strat&#xE9;giques, est un outil utile qui va consid&#xE9;rablement aider &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;limination progressive des structures de prot&#xE9;ines membranaires.

La d&#xE9;tection par fluorescence des atome lourd &#xE9;tiquetage (FD-HAL): une m&#xE9;thode rapide pour identifier les r&#xE9;sidus cyst&#xE9;ine modifi&#xE9;e de fa&#xE7;on covalente par Atomes Phasing

Membran-Protein-Kristallographie, St&auml;nden h&auml;ufig im Stadium der Phase Bestimmung aufgrund schlechter Kristall Beugung und die Unf&auml;higkeit, schwere Atom Derivatisierung vor der Datenerhebung zu identifizieren. Somit sind eine Mehrheit der Zeit, Aufwand und Ressourcen investiert Vorbereitung potenzielle derivatized Kristalle f&uuml;r Synchrotron-Datenerhebung und-Analyse ohne Kenntnis der schweren Atom zu beschriften. Um diese Unsicherheit zu entfernen, f&uuml;hren wir die Fluoreszenz Detektion von schweren Atom Labeling (FD-HAL) Verwendung von Tetramethylrhodamine-5-Maleimide (eine fluoreszierende Maleimide Verbindung) zur &Uuml;berwachung von in-Gel-Cystein R&uuml;ckstand Zug&auml;nglichkeit und kovalente Modifikation durch Quecksilber, Platin und Gold-Verbindungen zu ermitteln. Wir haben diese Technik auf drei integralen Membranproteine (LacY, vSGLT und mVDAC1) getestet und die optimalen Konzentrationen schnell beurteilen kann, Zeit und schwere Atom zusammengesetzte um kostenlose Cystein R&uuml;ckst&auml;nde derivatize um Kristall Ausstieg zu erleichtern. Dies ist in Verbindung mit Cystein Scannen zum Integrieren von schwerer Atoms an strategischen Positionen, ein n&uuml;tzliches Werkzeug, das deutlich bei der schrittweisen Membrane Protein-Strukturen zu unterst&uuml;tzen.

Fluoreszenz Detektion von schweren Atom Labeling (FD-HAL): eine schnelle Methode zur Identifizierung von kovalent Cystein R&uuml;ckst&auml;nde durch Atome schrittweise ge&auml;ndert.

Cristallografia di proteine di membrana bancarelle frequentemente nella fase di determinazione fase a causa della diffrazione povero crystal e l&#39;incapacit&agrave; di identificare derivatizzazione atomo pesante prima della raccolta dei dati. Cos&igrave;, una maggioranza di tempo, energie e risorse sono investiti preparando potenziali cristalli derivatizzate per raccolta dati di sincrotrone e analisi senza la conoscenza dell&#39;atomo pesante etichettatura. Per rimuovere questa incertezza, introduciamo fluorescenza rilevamento di pesante atomo Labeling (FD-HAL) utilizzando tetrametilrodamina-5-con (un composto fluorescente con) per monitorare in gel cisteina residuo accessibilit&agrave; e accertare modifica covalente da composti del mercurio, platino e oro. Abbiamo testato questa tecnica su tre proteine integrali di membrana (LacY, vSGLT e mVDAC1) e pu&ograve; valutare rapidamente le concentrazioni ottimale, tempo e pesante atomo composto per derivatize residui di cisteina libera al fine di facilitare la graduale di cristallo. Questo, in combinazione con cisteina scansione per incorporando atomi pesanti in posizioni strategiche, &egrave; un utile strumento che aiuter&agrave; notevolmente nella graduale di strutture di proteine di membrana.

Fluorescenza rilevamento di pesante atomo Labeling (FD-HAL): un metodo rapido per l&#39;identificazione di covalentemente modificato residui di cisteina fasatura atomi.

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&#xD615;&#xAD11; &#xAC80;&#xCD9C;&#xC758; &#xBB34;&#xAC70;&#xC6B4; &#xC6D0;&#xC790; &#xB77C;&#xBCA8; (FD HAL): &#x70AD;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xBE60;&#xB978; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xC6D0;&#xC790;&#xB97C; &#xB2E8;&#xACC4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC870;&#xC815; &#xD558; &#xC5EC; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD14C;&#xC778; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xC218;&#xC815;&#xD560;.

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&#x4F7F;&#x7528;&#x6CB9;&#x8102; bicelles &#x7684;&#x7ED3;&#x6676;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;

Crystallization of membrane proteins remains a significant challenge. For proteins resistant to the traditional approach of directly crystallizing from detergents, lipidic phase crystallization can be a powerful tool. Bicelles are an excellent medium for crystallizing membrane proteins in a lipidic environment. They can be described as bilayer discs formed by the mixture of a long-chain phospholipid and an amphiphile in an aqueous medium. Membrane proteins can be readily reconstituted into bicelles, where they are maintained in a native-like bilayer environment. Importantly, membrane proteins have been shown to be fully functional in bicelles under physiological conditions. Protein-bicelle mixtures can be manipulated with almost the same ease as detergent-solubilized membrane proteins, making bicelles compatible with standard equipment including high-throughput crystallization robots. A number of membrane proteins have now been successfully crystallized using the bicelle method, including bacteriorhodopsin, Î²2 adrenergic receptor, voltage-dependent anion channel, xanthorhodopsin and rhomboid protease. Because of the success with a variety of membrane proteins and the ease of implementation, bicelles should be a part of every membrane protein crystallographer's arsenal.

Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles.

La cristallisation des prot&eacute;ines membranaires demeure un d&eacute;fi important. Pour les prot&eacute;ines r&eacute;sistantes &agrave; l&#39;approche traditionnelle de cristallisation directement des d&eacute;tergents, la cristallisation de la phase lipidique peut &ecirc;tre un outil puissant. Bicelles sont un excellent moyen pour la cristallisation de prot&eacute;ines en milieu lipidique de la membrane. Ils peuvent &ecirc;tre d&eacute;crits comme des disques bicouche form&eacute;s par le m&eacute;lange d&#39;une longue cha&icirc;ne de phospholipides et un amphiphile en milieu aqueux. Prot&eacute;ines de la membrane peuvent &ecirc;tre facilement reconstitu&eacute;es dans bicelles, o&ugrave; ils sont maintenus dans un environnement natif bicouche. Prot&eacute;ines membranaires montrent ce qui est important, pour &ecirc;tre pleinement fonctionnel dans les bicelles dans des conditions physiologiques. M&eacute;langes de prot&eacute;ines-bicelle peuvent &ecirc;tre manipul&eacute;s avec presque la m&ecirc;me facilit&eacute; que les prot&eacute;ines de la membrane solubilis&eacute;e d&eacute;tergent, rendant bicelles compatible avec l&#39;&eacute;quipement standard, y compris les robots de la cristallisation de haut d&eacute;bit. Un certain nombre de prot&eacute;ines membranaires ont maintenant &eacute;t&eacute; correctement cristallis&eacute; en utilisant la m&eacute;thode de bicelle, y compris la prot&eacute;ase xanthorhodopsin et rhombo&iuml;de, canal anionique voltage-d&eacute;pendants, les r&eacute;cepteurs adr&eacute;nergiques &beta;2, bact&eacute;riorhodopsine. En raison du succ&egrave;s avec une vari&eacute;t&eacute; de prot&eacute;ines membranaires et la facilit&eacute; de mise en &oelig;uvre, bicelles devrait faire partie de l&#39;arsenal de chaque cristallographe prot&eacute;ine membranaire.

Cristallisation des prot&eacute;ines de la membrane &agrave; l&#39;aide de bicelles lipidiques.

Kristallisation von Membranproteinen bleibt eine gro&szlig;e Herausforderung. F&uuml;r Proteine, die resistent gegen den traditionellen Ansatz direkt aus Waschmitteln kristallisieren k&ouml;nnen lipidischen Phase Kristallisation ein m&auml;chtiges Werkzeug. Bicelles sind ein ausgezeichnetes Medium f&uuml;r Membranproteine in einer Umgebung mit lipidischen kristallisieren. Sie k&ouml;nnen als Bilayer-Scheiben, die durch die Mischung von einem langkettigen Phospholipid und ein Amphiphilie in einem w&auml;ssrigen Medium gebildet bezeichnen. Membranproteine k&ouml;nnen leicht in Bicelles, wiederhergestellt werden, wo sie in einer Umgebung mit Native-wie Bilayer gepflegt werden. Wichtig ist, wurden die Membranproteine gezeigt, in Bicelles unter physiologischen Bedingungen voll funktionsf&auml;hig sein. Protein-Bicelle Gemische k&ouml;nnen mit fast der gleichen Leichtigkeit als Waschmittel-solubilized Membranproteine, die Bicelles kompatibel mit standard-Ausr&uuml;stung einschlie&szlig;lich Hochdurchsatz-Kristallisation Roboter manipuliert werden. Eine Reihe von Membranproteinen haben nun erfolgreich mit der Bicelle-Methode, einschlie&szlig;lich Bakteriorhodopsin, adrenergen &beta;2-Rezeptor, Spannung-abh&auml;ngigen Anionenkanal, Xanthorhodopsin und Rhomboid Protease kristallisiert worden. Aufgrund des Erfolgs mit einer Vielzahl von Membranproteinen und die einfache Implementierung sollte Bicelles ein Teil jeder Membrane Protein Mineralogen Arsenal.

Membranproteine mit lipidischen Bicelles kristallisieren.

Cristallizzazione di proteine di membrana resta una sfida significativa. Per le proteine resistenti all&#39;approccio tradizionale della cristallizzazione direttamente da detergenti, cristallizzazione di fase lipidica pu&ograve; essere un potente strumento. Bicelles sono un mezzo eccellente per cristallizzare le proteine di membrana in un ambiente lipidico. Essi possono essere descritte come dischi doppio strato costituiti da miscela di un fosfolipide catena lunga e un amphiphile in mezzo acquoso. Le proteine di membrana possono essere prontamente ricostituite in bicelles, dove essi sono mantenuti in un ambiente nativo-come doppio strato. Soprattutto, le proteine di membrana hanno dimostrate di essere pienamente funzionale in bicelles in condizioni fisiologiche. Miscele di proteine-bicelle possono essere manipolati con quasi la stessa facilit&agrave; come le proteine di membrana detergente-solubilizzato, rendendo bicelles compatibile con equipaggiamento standard, compreso i robot high-throughput di cristallizzazione. Un certo numero di proteine di membrana &egrave; ora state correttamente cristallizzato utilizzando il metodo bicelle, tra cui la batteriorodopsina, recettori adrenergici &beta;2, canale voltaggio-dipendente anione, proteasi xanthorhodopsin e romboidale. A causa del successo con una variet&agrave; di proteine di membrana e la facilit&agrave; di implementazione, bicelles dovrebbe essere una parte dell&#39;arsenale di cristallografo proteina ogni membrana.

Cristallizzazione di proteine di membrana utilizzando bicelles lipidico.

&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x306F;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x8AB2;&#x984C;&#x306E;&#x307E;&#x307E;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x76F4;&#x63A5;&#x6D17;&#x5264;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x3001;&#x4F1D;&#x7D71;&#x7684;&#x306A;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306B;&#x8010;&#x6027;&#x306E;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x8102;&#x8CEA;&#x76F8;&#x7D50;&#x6676;&#x306E;&#x5F37;&#x529B;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3092;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;Bicelles &#x8102;&#x8CEA;&#x74B0;&#x5883;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x512A;&#x79C0;&#x306A;&#x5A92;&#x4F53;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;&#x9577;&#x9396;&#x30EA;&#x30F3;&#x8102;&#x8CEA;&#x3068;&#x306F;&#x6C34;&#x6EB6;&#x6DB2;&#x3067;&#x4E21;&#x89AA;&#x5A92;&#x6027;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x6DF7;&#x5728;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x5F62;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x4E8C;&#x5C64;&#x30C7;&#x30A3;&#x30B9;&#x30AF;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x8A18;&#x8FF0;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F;&#x30CD;&#x30A4;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D6;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A; 2 &#x5C64;&#x74B0;&#x5883;&#x3067;&#x304C;&#x7DAD;&#x6301;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059; bicelles &#x306B;&#x5BB9;&#x6613;&#x306B;&#x518D;&#x69CB;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x306F;&#x3001;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; bicelles &#x751F;&#x7406;&#x7684;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x5B8C;&#x5168;&#x306B;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3059;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x793A;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA; bicelle &#x306E;&#x6DF7;&#x5408;&#x7269;&#x306F;&#x3001;&#x307B;&#x307C;&#x540C;&#x3058;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x7C21;&#x5358; bicelles &#x306E;&#x30CF;&#x30A4;&#x30B9;&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C3;&#x30C8;&#x7D50;&#x6676;&#x5316;&#x30ED;&#x30DC;&#x30C3;&#x30C8;&#x306A;&#x3069;&#x3092;&#x6A19;&#x6E96;&#x88C5;&#x5099;&#x3057;&#x3066;&#x4E92;&#x63DB;&#x6027;&#x3092;&#x6D17;&#x5264;&#x53EF;&#x6EB6;&#x5316;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x64CD;&#x4F5C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x6570;&#x306F;&#x4ECA;&#x30D0;&#x30AF;&#x30C6;&#x30EA;&#x30AA;&#x30ED;&#x30C9;&#x30D7;&#x30B7;&#x30F3;&#x3001;&beta; 2 &#x30A2;&#x30C9;&#x30EC;&#x30CA;&#x30EA;&#x30F3;&#x53D7;&#x5BB9;&#x4F53;&#x3001;&#x96FB;&#x4F4D;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3; &#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB; xanthorhodopsin &#x3068;&#x83F1;&#x5F62;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C6;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3001;bicelle &#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6B63;&#x5E38;&#x306B;&#x7D50;&#x6676;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x591A;&#x69D8;&#x6027;&#x3068;&#x5B9F;&#x88C5;&#x306E;&#x5BB9;&#x6613;&#x3055;&#x3068;&#x6210;&#x529F;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;bicelles &#x306F;&#x3042;&#x3089;&#x3086;&#x308B;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x30DC;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x30D5;&#x30A1;&#x30A4;&#x30EB; &#x30A2;&#x30FC;&#x30BB;&#x30CA;&#x30EB;&#x306E;&#x4E00;&#x90E8;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

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Crystallizing &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; lipidic bicelles&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;.

Cristalizaci&oacute;n de prote&iacute;nas de membrana sigue siendo un desaf&iacute;o significativo. Prote&iacute;nas resistentes al enfoque tradicional de cristalizaci&oacute;n directamente de detergentes, cristalizaci&oacute;n de la fase lip&iacute;dica puede ser una herramienta poderosa. Bicelles son un medio excelente para la cristalizaci&oacute;n de prote&iacute;nas de la membrana en un ambiente lip&iacute;dico. Ellos pueden ser descritos como discos bicapa formados por la mezcla de un fosfol&iacute;pido de cadena larga y un amphiphile en un medio acuoso. Prote&iacute;nas de la membrana pueden ser f&aacute;cilmente reconstituidas en bicelles, donde se mantuvieron en un entorno nativo bicapa. Lo importante, prote&iacute;nas de membrana han demostrado ser totalmente funcional en bicelles bajo condiciones fisiol&oacute;gicas. Mezclas de prote&iacute;na-bicelle pueden manipularse con casi la misma facilidad como prote&iacute;nas de membrana de detergente-solubilizado, haciendo bicelles compatible con equipos est&aacute;ndar como robots de cristalizaci&oacute;n de alto rendimiento. Un n&uacute;mero de prote&iacute;nas de membrana ha ahora sido exitosamente cristalizado utilizando el m&eacute;todo de bicelle, incluyendo la bacteriorodopsina, receptor adren&eacute;rgico &beta;2, canal voltaje-dependiente del ani&oacute;n, proteasa xanthorhodopsin y romboide. Debido al &eacute;xito con una variedad de prote&iacute;nas de membrana y la facilidad de implementaci&oacute;n, bicelles debe ser una parte del arsenal de cada crystallographer prote&iacute;nas de membrana.

Cristalizaci&oacute;n de prote&iacute;nas de la membrana usando bicelles lip&iacute;dica.

&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x9634;&#x79BB;&#x5B50;&#x901A;&#x9053; (VDAC) &#x7BA1;&#x8F96;&#x79BB;&#x5B50;&#x548C;&#x4EE3;&#x8C22;&#x4EA7;&#x7269;&#x7EBF;&#x7C92;&#x4F53;&#x4E0E;&#x5355;&#x5143;&#x683C;&#x7684;&#x5176;&#x4F59;&#x90E8;&#x5206;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x81EA;&#x7531;&#x7684;&#x4EA4;&#x6D41;&#x3002;&#x7531; 19 &beta; &#x94FE;&#x5F62;&#x6210;&#x901A;&#x9053;&#x548C;&#x9644;&#x8FD1;&#x7684;&#x6BDB;&#x5B54;&#x4E2D;&#x70B9;&#x4F4D;&#x4E8E; N &#x7EC8;&#x7AEF; &alpha;-&#x87BA;&#x65CB;&#xFF0C;&#x63ED;&#x793A;&#x4E86; VDAC1 &#x7684; 3D &#x7ED3;&#x6784;&#x3002;&#x6B64; &alpha;-&#x87BA;&#x65CB;&#x7684;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x4F1A;&#x5BFC;&#x81F4;&#x8154;&#x4F46;&#x4EE3;&#x8C22;&#x901A;&#x9053;&#x4ECD;&#x7136;&#x6709;&#x8DB3;&#x591F;&#x7A7A;&#x95F4;&#x7684;&#x7F29;&#x5C0F;&#x3002;&#x5DF2;&#x5EFA;&#x7ACB;&#x4E86; VDAC1 N-&#x5DF4;&#x58EB;&#x603B;&#x7AD9;&#x7684;&#x7535;&#x538B;&#x6D47;&#x6CE8;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x7684;&#x53C2;&#x4E0E;&#xFF0C;&#x4F46;&#x5206;&#x5B50;&#x673A;&#x5236;&#x4ECD;&#x7136;&#x662F;&#x8FA9;&#x8BBA; &#xFF1B;&#x7136;&#x800C;&#xFF0C;&#x5927;&#x591A;&#x6570;&#x6A21;&#x578B;&#x9700;&#x8981;&#x6B64; N-&#x672B;&#x7AEF;&#x5927;&#x6784;&#x8C61;&#x53D8;&#x5316;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x671F;&#x95F4;&#x901A;&#x9053;&#x95E8;&#x63A7;&#x5B54;&#x886C; N &#x7EC8;&#x7AEF; &alpha;-&#x87BA;&#x65CB;&#x4E0D;&#x63A5;&#x53D7;&#x72EC;&#x7ACB;&#x7ED3;&#x6784;&#x91CD;&#x6392;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5236;&#x9020;&#x51FA;&#x53CC; Cys &#x7A81;&#x53D8;&#x7684;&#x5C0F;&#x9F20; VDAC1 (mVDAC1) &#x4EA4;&#x53C9;&#x94FE;&#x63A5; &alpha;-&#x87BA;&#x65CB; &beta;-&#x6BCF;&#x6876;&#x58C1;&#x5B54;&#x548C;&#x91CD;&#x7EC4;&#x5230;&#x5E73;&#x9762;&#x8102;&#x53CC;&#x5C42;&#x7684;&#x6539;&#x6027;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x3002;&#x4FEE;&#x6539;&#x540E;&#x7684; mVDAC1 &#x5C55;&#x793A;&#x5178;&#x578B;&#x7535;&#x538B;&#x95E8;&#x63A7;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E; N &#x7EC8;&#x7AEF; &alpha;-&#x87BA;&#x65CB;&#x4F4D;&#x4E8E;&#x5185;&#x90E8; VDAC &#x5728;&#x6253;&#x5F00;&#x72B6;&#x6001;&#x548C;&#x7535;&#x538B;&#x95E8;&#x63A7;&#x671F;&#x95F4;&#x4E0E; &beta;-&#x94A2;&#x7EDE;&#x7EBF; 11 &#x5B54;&#x58C1;&#x7684;&#x5173;&#x8054;&#x7684;&#x9057;&#x9AB8;&#x7684;&#x6BDB;&#x5B54;&#x3002;

&#x5F20;&#x8D34; N &#x7EC8;&#x7AEF;&#x963F;&#x5C14;&#x6CD5;&#x87BA;&#x65CB;&#x901A;&#x9053;&#x7684;&#x5899;&#x4E0A;&#x7684;&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x9634;&#x79BB;&#x5B50;&#x901A;&#x9053;&#x5E76;&#x4E0D;&#x59A8;&#x788D;&#x5176;&#x7535;&#x538B;&#x95E8;&#x63A7;&#x3002;

The Voltage Dependent Anion Channel (VDAC) governs the free exchange of ions and metabolites between the mitochondria and the rest of the cell. The 3D structure of VDAC1 reveals a channel formed by 19 Î²-strands and an N-terminal Î±-helix located near the midpoint of the pore. The position of this Î±-helix causes a narrowing of the cavity but ample space for metabolite passage remains. The participation of the N-terminus of VDAC1 in the voltage-gating process has been well established but the molecular mechanism remains debated; yet, the majority of models entail large conformational changes of this N-terminal segment. Here we report that the pore-lining N-terminal Î±-helix does not undergo independent structural rearrangements during channel gating. We engineered a double Cys mutant in murine VDAC1 (mVDAC1) that cross links the Î±-helix to the wall of the Î²-barrel pore and reconstituted the modified protein into planar lipid bilayers. The modified mVDAC1 exhibited typical voltage gating. These results suggest that the N-terminal Î±-helix is located inside the pore of VDAC in the open state and remains associated with Î²-strand 11 of the pore wall during voltage gating.

Affixing the N-terminal alpha helix of the voltage dependent anion channel to the channel's wall does not prevent its voltage gating.

Le canal d&#x26;#39;anions d&#xE9;pendant de la tension (VDAC) r&#xE9;git le libre &#xE9;change des ions et des m&#xE9;tabolites entre les mitochondries et le reste de la cellule. La structure 3D de VDAC1 r&#xE9;v&#xE8;le un canal form&#xE9; par 19 brins &#xDF; et une N-terminale &#x3B1;-h&#xE9;lice situ&#xE9;es pr&#xE8;s du milieu du pore. La position de cette h&#xE9;lice &#x3B1;-provoque un r&#xE9;tr&#xE9;cissement de la cavit&#xE9;, mais amplement d&#x26;#39;espace pour les restes de passage des m&#xE9;tabolites. La participation de l&#x26;#39;extr&#xE9;mit&#xE9; N-terminale de la VDAC1 dans le processus de tension de d&#xE9;clenchement a &#xE9;t&#xE9; bien &#xE9;tablie, mais le m&#xE9;canisme mol&#xE9;culaire reste d&#xE9;battue, et pourtant, la majorit&#xE9; des mod&#xE8;les impliquent de grandes modifications conformationnelles de ce segment N-terminal. Nous rapportons ici que le pore-doublure N-terminal &#x3B1;-h&#xE9;lice ne subit pas de r&#xE9;arrangements structuraux ind&#xE9;pendants au cours de d&#xE9;clenchement de canal. On con&#xE7;u une double mutant Cys dans murin VDAC1 (mVDAC1) qui relie l&#x26;#39;transversales &#x3B1;-h&#xE9;lice sur la paroi du pore &#x3B2;-baril et reconstitu&#xE9; la prot&#xE9;ine modifi&#xE9;e dans des bicouches lipidiques planes. La modification de mVDAC1 expos&#xE9; de d&#xE9;clenchement de tension typique. Ces r&#xE9;sultats sugg&#xE8;rent que la N-terminal &#x3B1;-h&#xE9;lice est situ&#xE9;e &#xE0; l&#x26;#39;int&#xE9;rieur du pore de VDAC dans l&#x26;#39;&#xE9;tat ouvert et reste associ&#xE9;e &#xE0; &#x3B2;-brin 11 de la paroi des pores au cours de d&#xE9;clenchement de tension.

Apposition l&#x26;#39;h&#xE9;lice alpha N-terminale de la Manche d&#x26;#39;anions d&#xE9;pendant de la tension &#xE0; Wall de la Cha&#xEE;ne n&#x26;#39;emp&#xEA;che pas ses Gating tension

Voltage Dependent Anion Channel (VDAC) regelt den freien Austausch von Ionen und Metaboliten zwischen den Mitochondrien und dem Rest der Zelle. Die 3D-Struktur des VDAC1 zeigt einen Kanal von 19 &beta;-Str&auml;nge gebildet und eine N-terminalen &alpha;-Helix nahe dem Mittelpunkt der Pore. Die Position dieser &alpha;-Helix f&uuml;hrt zu einer Verengung der Hohlraum aber reichlich Platz f&uuml;r Metabolit Durchgang bleibt. Die Beteiligung von der N-Terminus des VDAC1 der Spannung-gating-Prozess etabliert wurde, aber die molekulare Mechanismen weiterhin diskutiert; Doch die meisten Modelle mit sich bringen gro&szlig;e Konformationsver&auml;nderungen dieses N-Terminal-Segments. Hier berichten wir, dass die Pore-Futter-N-terminalen &alpha;-Helix nicht unabh&auml;ngige strukturelle Umlagerungen w&auml;hrend Kanal Anspritzung unterzogen wird. Wir entwickelt eine doppelte Cys mutant in murinen VDAC1 (mVDAC1), dass Kreuz die &alpha;-Helix an der Wand des &beta;-Laufes links pore und das ver&auml;nderte Protein in planaren Lipid-Doppelschichten rekonstituiert. Die modifizierte mVDAC1 ausgestellt, typische Spannung Anspritzung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die N-terminalen &alpha;-Helix sich innerhalb der Pore des VDAC im ge&ouml;ffneten Zustand und bleibt befindet w&auml;hrend Spannung Anspritzung mit &beta;-Strang 11 der Pore-Mauer verbunden.

Anbringung der N-terminalen &alpha;-Helix von der Spannung abh&Atilde; &curren; ngiges Kanal des Senders Wand verhindert nicht die Spannung Anspritzung.

La tensione dipendente anione canale (VDAC) governa il libero scambio di ioni e metaboliti tra i mitocondri e il resto della cellula. La struttura 3D di VDAC1 rivela un canale formato da 19 &beta;-strands e un N-terminale &alpha;-elica che si trova vicino al punto medio del poro. La posizione di questa &alpha;-elica provoca un restringimento della cavit&agrave; ma un ampio spazio per metabolita passaggio resti. La partecipazione del N-terminale di VDAC1 nel processo di tensione-gating &egrave; stato ben definita, ma il meccanismo molecolare rimane dibattuto; Eppure, la maggior parte dei modelli comporta grandi cambiamenti conformazionali di questo segmento N-terminale. Qui riportiamo che il poro-fodera N-terminale &alpha;-elica non subiscono riarrangiamenti strutturali indipendenti durante il canale gating. Abbiamo progettato un doppio Cys mutanti in VDAC1 murino (mVDAC1) che traversa il &alpha;-elica collegamenti alla parete del &beta;-barilotto poro e ricostituito la proteina modificata in planar lipidici. Il mVDAC1 modificato esposto tensione tipica gating. Questi risultati suggeriscono che il N-terminale &alpha;-elica si trova all&#39;interno del poro di VDAC nello stato aperto e rimane connessi con 11 &beta;-strand della parete poro durante la tensione gating.

Apposizione del N-terminale alfa elica del canale voltaggio dipendente anione alla parete del canale non impedisce la sua tensione di gating.

&#x96FB;&#x4F4D;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x9670;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#xFF08;VDAC&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x30DF;&#x30C8;&#x30B3;&#x30F3;&#x30C9;&#x30EA;&#x30A2;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x6B8B;&#x308A;&#x306E;&#x90E8;&#x5206;&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x3068;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x7269;&#x306E;&#x81EA;&#x7531;&#x306A;&#x4EA4;&#x63DB;&#x3092;&#x7BA1;&#x7406;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002; VDAC1&#x306E;3&#x6B21;&#x5143;&#x69CB;&#x9020;&#x306F;&#x3001;19&#x3B2;-&#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C9;&#x3068;&#x7D30;&#x5B54;&#x306E;&#x4E2D;&#x70B9;&#x306E;&#x8FD1;&#x304F;&#x306B;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x3057;&#x3001;N&#x672B;&#x7AEF;&#x306E;&#x3B1;-&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5F62;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x3B1;-&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x306E;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x306F;&#x3001;&#x7A7A;&#x6D1E;&#x306E;&#x72ED;&#x5C0F;&#x5316;&#x3092;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x4EE3;&#x8B1D;&#x7269;&#x306E;&#x901A;&#x904E;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5341;&#x5206;&#x306A;&#x30B9;&#x30DA;&#x30FC;&#x30B9;&#x304C;&#x6B8B;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x96FB;&#x5727;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306E;VDAC1&#x306E;N&#x672B;&#x7AEF;&#x306E;&#x53C2;&#x52A0;&#x306F;&#x5341;&#x5206;&#x306B;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x304C;&#x3001;&#x5206;&#x5B50;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x306F;&#x8B70;&#x8AD6;&#x306E;&#x307E;&#x307E;&#x3001;&#x307E;&#x3060;&#x3001;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x306E;&#x5927;&#x534A;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;N&#x672B;&#x7AEF;&#x30BB;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x5927;&#x898F;&#x6A21;&#x306A;&#x69CB;&#x9020;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x4F34;&#x3046;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x5B54;&#x30E9;&#x30A4;&#x30CB;&#x30F3;&#x30B0;N&#x672B;&#x7AEF;&#x3B1;-&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x304C;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3057;&#x305F;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x518D;&#x7DE8;&#x6210;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x30DE;&#x30A6;&#x30B9;VDAC1&#x306E;&#x4E8C;&#x91CD;&#x306E;Cys&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#xFF08;mVDAC1&#xFF09;&#x3B2;-&#x30D0;&#x30EC;&#x30EB;&#x7D30;&#x5B54;&#x306E;&#x58C1;&#x3078;&#x306E;&#x30AF;&#x30ED;&#x30B9;&#x30EA;&#x30F3;&#x30AF;&#x306F;&#x3B1;-&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x305D;&#x308C;&#x3092;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3057;&#x3001;&#x5E73;&#x9762;&#x8102;&#x8CEA;&#x4E8C;&#x91CD;&#x819C;&#x306B;&#x5909;&#x66F4;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x518D;&#x69CB;&#x6210;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5909;&#x66F4;&#x3055;&#x308C;&#x305F;mVDAC1&#x306F;&#x3001;&#x5178;&#x578B;&#x7684;&#x306A;&#x96FB;&#x5727;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x5C55;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;N&#x672B;&#x7AEF;&#x306E;&#x3B1;-&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x304C;&#x958B;&#x3044;&#x305F;&#x72B6;&#x614B;&#x3067;VDAC&#x306E;&#x5B54;&#x306E;&#x5185;&#x5074;&#x306B;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x3057;&#x3066;&#x304A;&#x308A;&#x3001;&#x96FB;&#x5727;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x6642;&#x306E;&#x5B54;&#x58C1;&#x306E;&#x3B2;-&#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C9;11&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x307E;&#x307E;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

&#x30C1;&#x30E3;&#x30F3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x58C1;&#x306B;&#x96FB;&#x5727;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30A2;&#x30CB;&#x30AA;&#x30F3;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;N&#x672B;&#x7AEF;&#x3B1;&#x30D8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3092;&#x8CBC;&#x308A;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x96FB;&#x5727;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x9632;&#x6B62;&#x3057;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;

&#xC804;&#xC555; &#xC758;&#xC874; &#xC74C;&#xC774;&#xC628; &#xCC44;&#xB110; (VDAC) &#xC774;&#xC628;&#xACFC;&#xB294; &#xBBF8;&#xD1A0; &#xCF58; &#xB4DC;&#xB9AC; &#xC544;&#xC640; &#xC140;&#xC758; &#xB098;&#xBA38;&#xC9C0; &#xBD80;&#xBD84; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xB300;&#xC0AC; &#xC0B0;&#xBB3C;&#xC758; &#xC790;&#xC720;&#xB85C;&#xC6B4; &#xAD50;&#xD658;&#xC744; &#xAD00;&#xB9AC;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Vdac1&#xC758; 3 &#xCC28;&#xC6D0; &#xAD6C;&#xC870; &#xBC1D;&#xD600; 19 &beta; &#xAC00;&#xB2E5;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD615;&#xC131; &#xB41C; &#xCC44;&#xB110;&#xACFC; N &#xB2E8;&#xC790; &alpha;-&#xB098;&#xC120; &#xAE30; &#xACF5;&#xC758; &#xC911;&#xAC04;&#xC810; &#xADFC;&#xCC98;&#xC5D0; &#xC704;&#xCE58;. &#xC774; &alpha;-&#xB098;&#xC120;&#xC758; &#xC704;&#xCE58; &#xCE90;&#xBE44;&#xD2F0; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xB300;&#xC0AC; &#xC0B0;&#xBB3C; &#xD1B5;&#xB85C; &#xC720;&#xC9C0; &#xC704;&#xD55C; &#xCDA9;&#xBD84; &#xD55C; &#xACF5;&#xAC04;&#xC774; &#xC881;&#xC544;&#xC9C0;&#xB294; &#xC6D0;&#xC778;&#xC774;. Vdac1&#xC758; N &#xB9D0;&#xB2E8; &#xC804;&#xC555; &#xAC8C;&#xC774;&#xD305; &#xACFC;&#xC815; &#xCC38;&#xAC00; &#xC798; &#xC124;&#xB9BD; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xBD84;&#xC790; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998; &#xB0A8;&#xC544; &#xB17C;&#xC7C1;; &#xC544;&#xC9C1;, &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC758; &#xBAA8;&#xB378;&#xC774; N &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xC138;&#xADF8;&#xBA3C;&#xD2B8;&#xC758; &#xD070; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBCC0;&#xD654;&#xB97C; &#xC218;&#xBC18; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xAE30; &#xACF5; &#xC548; &#xAC10; N &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &alpha;-&#xB098;&#xC120; &#xCC44;&#xB110; &#xAC8C;&#xC774;&#xD305; &#xB3D9;&#xC548; &#xB3C5;&#xB9BD;&#xC801;&#xC778; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC7AC;&#xBC30;&#xC5F4;&#xC744; &#xBC1B;&#xC544;&#xC57C; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xB294; &#xBCF4;&#xACE0; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB354;&#xBE14; Cys &#xC124;&#xACC4; murine vdac1&#xC5D0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; (mVDAC1)&#xB294; &#xD06C;&#xB85C;&#xC2A4; &#xB9C1;&#xD06C; &alpha;-&#xB098;&#xC120; &beta; &#xC2E0;&#xC758; &#xBCBD;&#xC5D0; &#xAE30; &#xACF5; &#xBC0F; &#xD3C9;&#xBA74; &#xC9C0;&#xC9C8; bilayers&#xB85C; &#xC218;&#xC815;&#xB41C; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xC7AC;&#xAD6C;&#xC131; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC218;&#xC815;&#xB41C; &#xB41C; Mvdac1&#xC740; &#xC77C;&#xBC18; &#xC804;&#xC555; &#xAC8C;&#xC774;&#xD305; &#xC804;&#xC2DC;. &#xC774; &#xACB0;&#xACFC; N &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &alpha;-&#xB098;&#xC120; VDAC &#xC624;&#xD508; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC640; &#xC804;&#xC555; &#xAC8C;&#xC774;&#xD305; &#xB3D9;&#xC548; 11 &#xAE30; &#xACF5; &#xBCBD;&#xC758; &beta;-&#xBB3C;&#xAC00;&#xC640; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xB0A8;&#xC544;&#xC758; &#xAE30; &#xACF5; &#xC548;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xBCBD;&#xC5D0; &#xC804;&#xC555; &#xC885;&#xC18D; &#xC74C;&#xC774;&#xC628; &#xCC44;&#xB110;&#xC758; N &#xB2E8;&#xC790; &#xC54C;&#xD30C; &#xB098;&#xC120; affixing&#xC758; &#xC804;&#xC555; &#xAC8C;&#xC774;&#xD305; &#xBC29;&#xC9C0; &#xD558;&#xC9C0;&#xB294; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

El canal de aniones dependiente de voltaje (VDAC) rige el libre intercambio de iones y metabolitos entre la mitocondria y el resto de la c&#xE9;lula. La estructura 3D de VDAC1 revela un canal formado por 19 beta-cap&#xED;tulos y un N-terminal de &#x3B1;-h&#xE9;lice, situados cerca del punto medio del poro. La posici&#xF3;n de esta h&#xE9;lice &#x3B1;-provoca un estrechamiento de la cavidad, sino un amplio espacio para los restos de paso de metabolitos. La participaci&#xF3;n de la N-terminal de VDAC1 en el proceso de voltaje de puerta ha sido bien establecido, pero el mecanismo molecular sigue siendo debatido, sin embargo, la mayor&#xED;a de los modelos implican grandes cambios conformacionales de este segmento N-terminal. Aqu&#xED; mostramos que el poro-guarnici&#xF3;n N-terminal de &#x3B1;-h&#xE9;lice no sufre alteraciones estructurales independientes durante canal gating. Hemos dise&#xF1;ado un doble mutante Cys en murino VDAC1 (mVDAC1) que enlaces cruzados de la &#x3B1;-h&#xE9;lice a la pared del poro &#x3B2;-barril y se reconstituy&#xF3; la prote&#xED;na modificada en bicapas lip&#xED;dicas planas. El mVDAC1 modificada exhibi&#xF3; compuerta tensi&#xF3;n t&#xED;pica. Estos resultados sugieren que la N-terminal de &#x3B1;-h&#xE9;lice est&#xE1; situado en el interior del poro de VDAC en el estado abierto y permanece asociado con &#x3B2;-hebra 11 de la pared de los poros durante compuerta de voltaje.

Colocaci&#xF3;n de la h&#xE9;lice alfa N-terminal del canal de aniones dependiente de la tensi&#xF3;n de la pared del canal, no impide su apertura de puerta de tensi&#xF3;n

Rachna Ujwal

UCLA-DOE Institute for Genomics and Proteomics

University of California Los Angeles

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Rachna Ujwal

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University of California Los Angeles

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

UCLA-DOE Institute for Genomics and Proteomics