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Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

The  generation and detection of mechanical forces is a ubiquitous aspect of cell physiology,  with direct relevance to cancer metastasis1, atherogenesis2 ...

Stanford University 

Degradaci&oacute;n proteol&iacute;tica de la fibrina, el principal componente estructural en co&aacute;gulos de sangre, es esencial durante la normal cicatrizaci&oacute;n de heridas y en el tratamiento de la apoplej&iacute;a isqu&eacute;mica e infarto de miocardio. Co&aacute;gulos de fibrina que contienen experimentan considerable tensi&oacute;n debido a la contracci&oacute;n de la plaqueta, corte de fluido y tensi&oacute;n mec&aacute;nica en el sitio de la herida. Sin embargo, poco se entiende sobre fuerzas mec&aacute;nicas c&oacute;mo influyen en disoluci&oacute;n de fibrina. Sol&iacute;amos que la microscopia video imagen co&aacute;gulos de fibrina filtrada como que fueron degradados por la plasmina, una enzima fibrinol&iacute;tica principal. Tensi&oacute;n aplicada hace hasta 10 veces la reducci&oacute;n en la tasa de degradaci&oacute;n de la fibrina. An&aacute;lisis de nuestros datos admite un modelo cuantitativo en el que la disminuci&oacute;n en las tasas de la prote&oacute;lisis de fibrina con cepa proviene de transporte m&aacute;s lento de la plasmina en el co&aacute;gulo. Realizamos recuperaci&oacute;n de fluorescencia despu&eacute;s de photobleaching (FRAP) medidas a&uacute;n m&aacute;s el efecto de tensi&oacute;n en el transporte difusivo la sonda. Encontramos que difusividad perpendicular al eje de la tensi&oacute;n disminuye con el aumento de tensi&oacute;n, mientras que la difusividad del eje de la tensi&oacute;n permanece inalterado. Nuestros resultados sugieren que las propiedades de la red de fibrina han evolucionado para proteger mec&aacute;nicamente cargado fibrina de degradaci&oacute;n, coherente con su funci&oacute;n en la cicatrizaci&oacute;n de heridas. El pronunciado efecto de cepa difusividad y susceptibilidad proteol&iacute;tica dentro de las redes de fibrina ofrece un medio potencialmente &uacute;til gu&iacute;a de crecimiento celular y la morfolog&iacute;a en biomateriales basados en fibrina.

Cepa tunes degradaci&oacute;n proteol&iacute;tica y transporte difusivo en redes de fibrina.

&#x86CB;&#x767D;&#x9176;&#x5206;&#x89E3;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x8840;&#x5757;&#xFF0C;&#x7ED3;&#x6784;&#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x7EC4;&#x4EF6;&#x662F;&#x5173;&#x952E;&#x6B63;&#x5E38;&#x7684;&#x4F24;&#x53E3;&#x6108;&#x5408;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x548C;&#x6CBB;&#x7597;&#x7F3A;&#x8840;&#x6027;&#x8111;&#x5352;&#x4E2D;&#x548C;&#x5FC3;&#x808C;&#x6897;&#x6B7B;&#x3002;&#x542B;&#x6709;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x86CB;&#x767D;&#x51DD;&#x5757;&#x7ECF;&#x9A8C;&#x5927;&#x91CF;&#x8840;&#x5C0F;&#x677F;&#x6536;&#x7F29;&#x3001; &#x6D41;&#x4F53;&#x526A;&#xFF0C;&#x548C;&#x4F24;&#x53E3;&#x5DE5;&#x5730;&#x7684;&#x673A;&#x68B0;&#x5E94;&#x529B;&#x5E94;&#x53D8;&#x3002;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x5F88;&#x5C11;&#x4E86;&#x89E3;&#x5173;&#x4E8E;&#x5982;&#x4F55;&#x673A;&#x68B0;&#x90E8;&#x961F;&#x53EF;&#x80FD;&#x4F1A;&#x5F71;&#x54CD;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x86CB;&#x767D;&#x6EB6;&#x89E3;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x4E8E;&#x89C6;&#x9891;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x56FE;&#x50CF;&#x7D27;&#x5F20;&#x7684;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x86CB;&#x767D;&#x51DD;&#x5757;&#xFF0C;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x88AB;&#x964D;&#x7EA7;&#x7684;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x86CB;&#x767D;&#x6EB6;&#x9176;&#xFF0C;&#x4E3B;&#x8981;&#x7684;&#x6EB6;&#x6813;&#x9176;&#x3002;&#x5E94;&#x7528;&#x7684;&#x5E94;&#x53D8;&#x5BFC;&#x81F4;&#x7684;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x86CB;&#x767D;&#x964D;&#x89E3;&#x7387;&#x8FBE; 10 &#x500D;&#x7684;&#x51CF;&#x5C11;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x5206;&#x6790;&#x652F;&#x6301;&#x7684;&#x5E94;&#x53D8;&#x4E0E;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x86CB;&#x767D;&#x964D;&#x89E3;&#x7387;&#x4E0B;&#x964D;&#x6E90;&#x4E8E;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x86CB;&#x767D;&#x6EB6;&#x9176;&#x7684;&#x6162;&#x8FD0;&#x8F93;&#x5230;&#x8840;&#x6813;&#x7684;&#x5B9A;&#x91CF;&#x6A21;&#x578B;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x6267;&#x884C;&#x8367;&#x5149;&#x6062;&#x590D;&#x540E;&#x8FDB;&#x4E00;&#x6B65;&#x6F02;&#x767D; (&#x8131;&#x8272;) &#x6D4B;&#x91CF;&#x63A2;&#x6D4B;&#x5668;&#x7D27;&#x5F20;&#x5BF9;&#x6269;&#x6563;&#x8FD0;&#x8F93;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x53D1;&#x73B0;&#x4E0E;&#x5E94;&#x53D8;&#x8F74;&#x5782;&#x76F4;&#x6269;&#x6563;&#x7CFB;&#x6570;&#x964D;&#x4F4E;&#x4E0E;&#x65E5;&#x76CA;&#x4E25;&#x91CD;&#x7684;&#x538B;&#x529B;&#xFF0C;&#x800C;&#x6CBF;&#x5E94;&#x53D8;&#x8F74;&#x6269;&#x6563;&#x7CFB;&#x6570;&#x4FDD;&#x6301;&#x4E0D;&#x53D8;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x86CB;&#x767D;&#x7F51;&#x7EDC;&#x7684;&#x5C5E;&#x6027;&#x90FD;&#x8FDB;&#x5316;&#x5230;&#x673A;&#x68B0;&#x52A0;&#x8F7D;&#x7684;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x86CB;&#x767D;&#x514D;&#x53D7;&#x9000;&#x5316;&#xFF0C;&#x7B26;&#x5408;&#x53CA;&#x5176;&#x5728;&#x521B;&#x9762;&#x6108;&#x5408;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x5E94;&#x53D8;&#x660E;&#x663E;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x6269;&#x6563;&#x7CFB;&#x6570;&#x548C;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x86CB;&#x767D;&#x7F51;&#x7EDC;&#x5185;&#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x6C34;&#x89E3;&#x6613;&#x611F;&#x6027;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x6307;&#x5BFC;&#x7EC6;&#x80DE;&#x751F;&#x957F;&#x548C;&#x5F62;&#x6001;&#x7684;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x86CB;&#x767D;&#x57FA;&#x4E8E;&#x751F;&#x7269;&#x6750;&#x6599;&#x7684;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x6709;&#x7528;&#x624B;&#x6BB5;&#x3002;

&#x5E94;&#x53D8;&#x66F2;&#x8C03;&#x86CB;&#x767D;&#x6C34;&#x89E3;&#x9000;&#x5316;&#x548C;&#x7EA4;&#x7EF4;&#x86CB;&#x767D;&#x7F51;&#x7EDC;&#x4E2D;&#x6269;&#x6563;&#x7684;&#x8FD0;&#x8F93;&#x3002;

Proteolytic degradation of fibrin, the major structural component in blood clots, is critical both during normal wound healing and in the treatment of ischemic stroke and myocardial infarction. Fibrin-containing clots experience substantial strain due to platelet contraction, fluid shear, and mechanical stress at the wound site. However, little is understood about how mechanical forces may influence fibrin dissolution. We used video microscopy to image strained fibrin clots as they were degraded by plasmin, a major fibrinolytic enzyme. Applied strain causes up to 10-fold reduction in the rate of fibrin degradation. Analysis of our data supports a quantitative model in which the decrease in fibrin proteolysis rates with strain stems from slower transport of plasmin into the clot. We performed fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) measurements to further probe the effect of strain on diffusive transport. We find that diffusivity perpendicular to the strain axis decreases with increasing strain, while diffusivity along the strain axis remains unchanged. Our results suggest that the properties of the fibrin network have evolved to protect mechanically loaded fibrin from degradation, consistent with its function in wound healing. The pronounced effect of strain upon diffusivity and proteolytic susceptibility within fibrin networks offers a potentially useful means of guiding cell growth and morphology in fibrin-based biomaterials.

Strain tunes proteolytic degradation and diffusive transport in fibrin networks.

La d&eacute;gradation prot&eacute;olytique de la fibrine, la principale composante structurelle dans les caillots de sang, est critique au cours de la cicatrisation normale, tant dans le traitement de l&#39;accident isch&eacute;mique c&eacute;r&eacute;bral et d&#39;infarctus du myocarde. Les caillots de fibrine contenant l&#39;exp&eacute;rience importante d&eacute;formation due &agrave; la contraction de plaquettes, cisaillement de fluid et les contraintes m&eacute;caniques sur le site de la plaie. Cependant, peu de choses est entendu sur les forces m&eacute;caniques comment peuvent influencer de dissolution de la fibrine. Nous avons utilis&eacute; la microscopie vid&eacute;o &agrave; l&#39;image des caillots de fibrine tendues comme ils sont d&eacute;grad&eacute;s par la plasmine, une importante enzyme fibrinolytique. D&eacute;formation appliqu&eacute;e provoque une r&eacute;duction jusqu&#39;&agrave; 10 fois la vitesse de d&eacute;gradation de la fibrine. Analyse de nos donn&eacute;es prend en charge un mod&egrave;le quantitatif dans lequel la diminution des taux de prot&eacute;olyse de fibrine avec la souche provient de transport plus lent de la plasmine dans le caillot. Nous avons effectu&eacute; une r&eacute;cup&eacute;ration de fluorescence apr&egrave;s que photoblanchiment (FRAP) mesures d&#39;autre sonde l&#39;effet de d&eacute;formation sur transport diffusif. Nous trouvons que diffusivit&eacute; perpendiculaire &agrave; l&#39;axe de d&eacute;formation diminue avec l&#39;augmentation de souche, tandis que la diffusivit&eacute; le long de l&#39;axe de la souche reste inchang&eacute;e. Nos r&eacute;sultats sugg&egrave;rent que les propri&eacute;t&eacute;s du r&eacute;seau de fibrine ont &eacute;volu&eacute; pour prot&eacute;ger la fibrine charg&eacute; m&eacute;caniquement d&#39;une d&eacute;gradation, compatible avec sa fonction dans la cicatrisation des plaies. L&#39;effet prononc&eacute; de souche diffusivit&eacute; et prot&eacute;olytique susceptibilit&eacute; au sein des r&eacute;seaux de fibrine offre un moyen potentiellement utile des directeurs la croissance cellulaire et de morphologie en biomat&eacute;riaux ax&eacute;e sur la fibrine.

Souche tunes la d&eacute;gradation prot&eacute;olytique et diffusive transport dans les r&eacute;seaux de fibrine.

Proteolytischen Abbau von Fibrin, die wichtige strukturelle Komponente in Blutgerinnsel, ist entscheidend, sowohl w&auml;hrend der normalen Wundheilung als auch bei der Behandlung von isch&auml;mischen Schlaganfall und Myokardinfarkt. Fibrin-haltigen Blutgerinnsel erleben erhebliche Belastung aufgrund der Thrombozyten Kontraktion, fl&uuml;ssig Scherung und mechanische Beanspruchung am Standort Wunde. Jedoch ist wenig verstanden, &uuml;ber wie mechanische Kr&auml;fte Fibrin Aufl&ouml;sung beeinflussen k&ouml;nnen. Wir verwendeten Videomikroskopie zur angespannten Spalten und abbauen kann Bild, wie sie von Plasmin, einem gro&szlig;en fibrinolytischen Enzym abgebaut wurden. Angewandte Belastung verursacht bis zu 10fach verbesserter Reduktion in die Geschwindigkeit des Abbaus von Fibrin. Analyse der Daten unterst&uuml;tzt ein quantitatives Modell, in dem der R&uuml;ckgang der Fibrin Proteolyse Preise mit DMS in das Gerinnsel aus langsamer Transport von Plasmin herr&uuml;hrt. Wir spielten Fluoreszenz-Wiederherstellung nach Photobleaching (FRAP) Messungen weiter die Wirkung der Dehnung auf diffusiven Transport Pr&uuml;fpunkt. Wir finden, dass Diffusionsverm&ouml;gen senkrecht zur Achse Belastung verringert sich mit zunehmender Belastung, w&auml;hrend Diffusionsverm&ouml;gen entlang der Achse der Stamm unver&auml;ndert bleibt. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Eigenschaften der Fibrin-Netz entwickelt haben, um mechanisch geladenen Fibrin vor Erniedrigung, mit seiner Rolle in der Wundheilung zu sch&uuml;tzen. Die ausgepr&auml;gte Wirkung der Dehnung auf Diffusionsverm&ouml;gen und proteolytische Anf&auml;lligkeit in Fibrin-Netzwerken bietet potenziell n&uuml;tzliche Mittel der leitenden Zellwachstum und Morphologie in Fibrin-basierten Biomaterialien.

Belastung optimiert proteolytischen Abbau und diffusiven Transport in Fibrin-Netzwerken.

Proteolitico degradazione della fibrina, il componente strutturale principale nella formazione di coaguli di sangue, &egrave; fondamentale durante la guarigione della ferita normale e nel trattamento dell&#39;ictus ischemico e infarto del miocardio. Coaguli di fibrina contenenti esperienza notevole sforzo a causa della contrazione delle piastrine, taglio fluido e stress meccanico al sito della ferita. Tuttavia, poco &egrave; intesa sulle forze meccaniche come possono influenzare la dissoluzione della fibrina. Abbiamo usato video microscopia per coaguli di fibrina sforzato di immagine come essi erano degradate dalla plasmina, un enzima importante fibrinolitica. Tensione applicata causa riduzione fino a 10 volte il tasso di degradazione della fibrina. Analisi dei nostri dati supporta un modello quantitativo in cui il calo nei tassi di proteolisi di fibrina con ceppo deriva da trasporto pi&ugrave; lenta della plasmina nel coagulo. Abbiamo eseguito il recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) le misure per ulteriore sonda l&#39;effetto del ceppo sul trasporto diffusivo. Troviamo che la diffusivit&agrave; perpendicolare all&#39;asse del ceppo diminuisce con l&#39;aumentare ceppo, mentre diffusivit&agrave; lungo l&#39;asse di ceppo rimane invariata. I nostri risultati suggeriscono che le propriet&agrave; della rete di fibrina hanno evoluto per proteggere meccanicamente caricato fibrina dalla degradazione, coerenza con la sua funzione nella guarigione delle ferite. L&#39;effetto pronounced del ceppo diffusivit&agrave; e proteolitici suscettibilit&agrave; all&#39;interno di reti di fibrina offre un mezzo potenzialmente utile guida crescita cellulare e morfologia in biomateriali a base di fibrina.

Ceppo tunes degradazione proteolitica e trasporto diffusivo in reti di fibrina.

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Arjun S. Adhikari

Department of Chemical Engineering

Stanford University

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Arjun S. Adhikari

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Department of Chemical Engineering

Stanford University

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Department of Chemical Engineering