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Production of <em>Xenopus tropicalis</em> Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Massachusetts General Hospital

Harvard Medical School

Budding yeast centromeres are comprised of approximately 125-bp DNA sequences that direct formation of the kinetochore, a specialized chromatin structure that mediates spindle attachment to chromosomes. We report here a novel role for the histone deposition complex chromatin assembly factor I (CAF-I) in building centromeric chromatin. The contribution of CAF-I to kinetochore function overlaps that of the Hir proteins, which have also been implicated in nucleosome formation and heterochromatic gene silencing. cacDelta hirDelta double mutant cells lacking both CAF-I and Hir proteins are delayed in anaphase entry in a spindle assembly checkpoint-dependent manner. Further, cacDelta and hirDelta deletions together cause increased rates of chromosome missegregation, genetic synergies with mutations in kinetochore protein genes, and alterations in centromeric chromatin structure. Finally, CAF-I subunits and Hir1 are enriched at centromeres, indicating that these proteins make a direct contribution to centromeric chromatin structures.

Chromatin assembly factor I and Hir proteins contribute to building functional kinetochores in S. cerevisiae.

Centrom&egrave;res des levures bourgeonnantes sont composent d&#39;environ 125-bp s&eacute;quences d&#39;ADN qui orientent la formation du kin&eacute;tochore, une structure de la chromatine sp&eacute;cialis&eacute;es qui intervient dans la broche de fixation aux chromosomes. Nous rapportons ici un nouveau r&ocirc;le pour le facteur d&#39;assemblage complexes de la chromatine histone d&eacute;p&ocirc;ts je (FAC-je) dans la construction de la chromatine centrom&eacute;rique. La contribution de FAC-I de la fonction du kin&eacute;tochore empil&eacute;e sur celle des prot&eacute;ines Hir, qui sont &eacute;galement impliqu&eacute;s dans la formation du nucl&eacute;osome et de silen&ccedil;age g&eacute;nique h&eacute;t&eacute;rochromatique. cacDelta hirDelta double cellules mutantes d&eacute;pourvues des deux FAC-j&#39;et prot&eacute;ines Hir sommes diff&eacute;r&eacute;es en entr&eacute;e de l&#39;anaphase en broche Assembl&eacute;e-fonction de point de contr&ocirc;le. En outre, destructions de cacDelta et hirDelta ensemble provoquent un taux accru de missegregation chromosomiques, g&eacute;n&eacute;tiques synergies avec des mutations dans les g&egrave;nes des prot&eacute;ines kin&eacute;tochore et alt&eacute;rations dans la structure de la chromatine centrom&eacute;rique. Enfin, la fac-je sous-unit&eacute;s et Hir1 sont enrichis &agrave; centrom&egrave;res, indiquant que ces prot&eacute;ines contribuent directe aux structures de la chromatine centrom&eacute;rique.

Facteur d&#39;assemblage de la chromatine j&#39;et Hir prot&eacute;ines contribuent &agrave; b&acirc;tir des kin&eacute;tochores fonctionnelles chez S. cerevisiae.

Centromeri lievito germogliante sono costituite da circa 125-bp sequenze di DNA che indirizzano la formazione del cinetocore, una struttura specializzata della cromatina che media mandrino attacco ai cromosomi. Riportiamo qui un nuovo ruolo per il fattore di assemblaggio della cromatina complesso deposizione istone sono (CAF-I) nella costruzione della cromatina centromerica. Il contributo di CAF-I della funzione cinetocore si sovrappone quello di proteine Hir, che inoltre sono state implicate nella formazione del nucleosoma e silenziamento genico eterocromatiche. cacDelta hirDelta doppio mutante cellule mancano entrambi CAF-Hir proteine e io sono ritardate nella voce anafase in modo di assemblaggio checkpoint-dipendente del mandrino. Ulteriormente, le eliminazioni di cacDelta e hirDelta insieme causano aumentati tassi di missegregation cromosoma, genetiche sinergie con mutazioni nei geni della proteina del cinetocore e alterazioni nella struttura della cromatina centromerica. Infine, CAF-sono subunit&agrave; e Hir1 sono arricchiti di centromeri, che indica che queste proteine dare un contributo diretto alle strutture della cromatina centromerica.

Fattore di assemblaggio della cromatina proteine Hir e I contribuiscono alla costruzione funzionale cinetocori in S. cerevisiae.

In fission yeast and multicellular organisms, centromere-proximal regions of chromosomes are heterochromatic, containing proteins that silence gene expression. In contrast, the relationship between heterochromatin proteins and kinetochore function in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae remains largely unexplored. Here we report that the yeast heterochromatin protein Sir1 is a component of centromeric chromatin and contributes to mitotic chromosome stability. Sir1 recruitment to centromeres occurred through a novel mechanism independent of its interaction with the origin recognition complex (ORC). Sir1 function at centromeres was distinct from its role in forming heterochromatin, because the Sir2-4 proteins were not associated with centromeric regions. Sir1 bound to Cac1, a subunit of chromatin assembly factor I (CAF-I), and helped to retain Cac1 at centromeric loci. These studies reveal that although budding yeast and mammalian cells use fundamentally different mechanisms of forming heterochromatin, they both use silencing proteins to attract the histone deposition factor CAF-I to centromeric chromatin.

The budding yeast silencing protein Sir1 is a functional component of centromeric chromatin.

Dans la levure et les organismes multicellulaires, r&eacute;gions proximales-centrom&egrave;res des chromosomes sont h&eacute;t&eacute;rochromatiques, contenant des prot&eacute;ines que le silence de l&#39;expression des g&egrave;nes. En revanche, la relation entre les prot&eacute;ines de l&#39;h&eacute;t&eacute;rochromatine et la fonction kin&eacute;tochore chez la levure Saccharomyces cerevisiae demeure largement inexplor&eacute;e. Nous rapportons ici que la prot&eacute;ine de l&#39;h&eacute;t&eacute;rochromatine levure Sir1 est un composant de la chromatine centrom&eacute;rique et contribue &agrave; la stabilit&eacute; du chromosome mitotique. Sir1 recrutement aux centrom&egrave;res s&#39;est produite &agrave; travers un nouveau m&eacute;canisme ind&eacute;pendant de son interaction avec la reconnaissance origine complexe (ORC). Sir1 fonction aux centrom&egrave;res &eacute;tait distincte de son r&ocirc;le dans la formation de l&#39;h&eacute;t&eacute;rochromatine, parce que les prot&eacute;ines Sir2-4 n&#39;ont pas &eacute;taient associ&eacute;es &agrave; des r&eacute;gions centrom&eacute;riques. Sir1 li&eacute; &agrave; Cac1, une sous-unit&eacute; du facteur d&#39;assemblage de la chromatine, j&#39;ai (FAC-je) et a aid&eacute; &agrave; conserver Cac1 centrom&eacute;rique loci. Ces &eacute;tudes r&eacute;v&egrave;lent que bien que la levure de bi&egrave;re et des cellules de mammif&egrave;res utilisent fondamentalement diff&eacute;rents m&eacute;canismes de formation de l&#39;h&eacute;t&eacute;rochromatine, ils utilisent tous deux prot&eacute;ines silencieux pour attirer le facteur de d&eacute;p&ocirc;ts de l&#39;histone FAC-I de la chromatine centrom&eacute;rique.

La levure de bi&egrave;re silen&ccedil;age de prot&eacute;ine Sir1 est un &eacute;l&eacute;ment fonctionnel de la chromatine centrom&eacute;rique.

Nel lievito di fissione e gli organismi pluricellulari, centromero-prossimale regioni dei cromosomi sono eterocromatiche, contenente proteine che silenzio espressione genica. Al contrario, il rapporto tra proteine eterocromatina e la funzione del lievito gemmante Saccharomyces cerevisiae cinetocore rimane in gran parte inesplorato. Qui riportiamo che la proteina di eterocromatina del lievito Sir1 &egrave; una componente della cromatina centromerica e contribuisce alla stabilit&agrave; del cromosoma mitotico. Reclutamento Sir1 ai centromeri si &egrave; verificata attraverso un nuovo meccanismo indipendente della sua interazione con il riconoscimento di origine complesso (ORC). Funzione Sir1 a centromeri era distinta dal suo ruolo nella formazione di eterocromatina, perch&eacute; le proteine di Sir2-4 non sono state associate con regioni centromerica. Sir1 associato a Cac1, una subunit&agrave; del fattore di assemblaggio della cromatina (CAF-I) e ha contribuito a mantenere Cac1 a loci centromerica. Questi studi rivelano che sebbene lievito gemmante e cellule di mammifero utilizzano fondamentalmente differenti meccanismi di formazione di eterocromatina, entrambi utilizzano proteine silenziamento per attirare il fattore di deposizione dell&#39;istone CAF-I della cromatina centromerica.

Il lievito gemmante silencing proteina Sir1 &egrave; un componente funzionale della cromatina centromerica.

CAF-1, Hir proteins, and Asf1 are histone H3/H4 binding proteins important for chromatin-mediated transcriptional silencing. We explored genetic and physical interactions between these proteins and S-phase/DNA damage checkpoint kinases in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Although cells lacking checkpoint kinase Mec1 do not display defects in telomeric gene silencing, silencing was dramatically reduced in cells lacking both Mec1 and the Cac1 subunit of CAF-1. Silencing was restored in cac1Delta and cac1Delta mec1Delta cells upon deletion of Rad53, the kinase downstream of Mec1. Restoration of silencing to cac1Delta cells required both Hir1 and Asf1, suggesting that Mec1 counteracts functional sequestration of the Asf1/Hir1 complex by Rad53. Consistent with this idea, the degree of suppression of silencing defects by rad53 alleles correlated with effects on Asf1 binding. Furthermore, deletion of the Dun1 kinase, a downstream target of Rad53, also suppressed the silencing defects of cac1Delta cells and reduced the levels of Asf1 associated with Rad53 in vivo. Loss of Mec1 and Rad53 did not alter telomere lengths or Asf1 protein levels, nuclear localization, or chromosome association. We conclude that the Mec1 and Dun1 checkpoint kinases regulate the Asf1-Rad53 interaction and therefore affect the activity of the Asf1/Hir complex in vivo.

Regulation of histone deposition proteins Asf1/Hir1 by multiple DNA damage checkpoint kinases in Saccharomyces cerevisiae.

CAF-1, prot&eacute;ines Hir et Asf1 sont des histones H3/H4 liaison importants pour la chromatine-mediated transcriptionnelle. Nous avons explor&eacute; les interactions g&eacute;n&eacute;tiques et physiques entre ces prot&eacute;ines et l&#39;ADN-phase/S dommages checkpoint kinases dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Bien que les cellules d&eacute;pourvues de kinase de checkpoint Mec1 n&#39;affichent pas de d&eacute;fauts t&eacute;lom&eacute;rique g&egrave;ne silencieux, silencieux a &eacute;t&eacute; consid&eacute;rablement r&eacute;duite dans les cellules sans Mec1 tant la sous-unit&eacute; Cac1 de CAF-1. Silencieux a &eacute;t&eacute; restaur&eacute; en cac1Delta et cac1Delta mec1Delta cellules apr&egrave;s suppression de Rad53, la kinase en aval de Mec1. Restauration de faire taire aux cellules cac1Delta requis Hir1 tant Asf1, sugg&eacute;rant que Mec1 neutralise s&eacute;questration fonctionnelle de la Asf1/Hir1 complexes par Rad53. Conform&eacute;ment &agrave; cette id&eacute;e, le niveau de suppression de faire taire les d&eacute;fauts par des all&egrave;les rad53 corr&eacute;l&eacute;e avec effets sur Asf1 fixation. En outre, la suppression de la kinase Dun1, une cible en aval de Rad53, &eacute;galement supprim&eacute; les d&eacute;fauts silencieux des cellules cac1Delta et r&eacute;duisait les concentrations de Asf1 associ&eacute; Rad53 in vivo. Perte de Mec1 et Rad53 n&#39;alt&egrave;re pas les longueurs des t&eacute;lom&egrave;res ou niveaux de prot&eacute;ine Asf1, localisation nucl&eacute;aire ou association des chromosomes. Nous concluons que les kinases de checkpoint Mec1 et Dun1 r&eacute;glementent l&#39;interaction Asf1-Rad53 et donc influer sur l&#39;activit&eacute; du complexe Asf1/Hir in vivo.

R&egrave;glement des histones d&eacute;p&ocirc;ts Asf1/Hir1 de plusieurs kinases de point de contr&ocirc;le des dommages ADN dans Saccharomyces cerevisiae.

CAF-1, proteine Hir e Asf1 sono le istone H3/H4 associazione proteine importanti per la cromatina mediata silenziamento trascrizionale. Abbiamo esplorato le interazioni genetiche e fisiche tra queste proteine e la chinasi di checkpoint S-fase/DNA danni nel lievito gemmante Saccharomyces cerevisiae. Sebbene cellule manca chinasi checkpoint Mec1 non mostrino difetti nel gene telomerica tacere, tacere &egrave; stato drasticamente ridotto nelle cellule mancano sia Mec1 e la subunit&agrave; Cac1 di CAF-1. Tacere &egrave; stato restaurato in cellule mec1Delta cac1Delta all&#39;eliminazione di Rad53, la chinasi a valle di Mec1 e cac1Delta. Restauro del silenzio a cellule cac1Delta necessaria sia Hir1 e Asf1, suggerendo che Mec1 contrasta il sequestro funzionale di Asf1/Hir1 complesso di Rad53. Coerentemente con questa idea, il grado di soppressione del silenzio difetti di rad53 alleli correlati con effetti sull&#39;associazione Asf1. Inoltre, eliminazione della chinasi di Dun1, un bersaglio a valle di Rad53, anche soppresso i silenziamento difetti delle cellule cac1Delta e ridotto i livelli di Asf1 associati Rad53 in vivo. Perdita di Mec1 e Rad53 non alterava telomeri lunghezze o livelli di proteine Asf1, localizzazione nucleare o associazione cromosoma. Possiamo concludere che la chinasi Mec1 e Dun1 di checkpoint regolano l&#39;interazione Asf1-Rad53 e quindi possono influenzare l&#39;attivit&agrave; del complesso Asf1/Hir in vivo.

Regolamento di istoni deposizione Asf1/Hir1 da multiple chinasi di checkpoint danno di DNA in Saccharomyces cerevisiae.

Females with germline mutations in BRCA1 are predisposed to develop breast and ovarian cancers. A previous report indicated that BRCA1 colocalizes with and is necessary for the correct localization of XIST, a noncoding RNA that coats the inactive X chromosome (Xi) to mediate formation of facultative heterochromatin. A model emerged from this study suggesting that loss of BRCA1 in female cells could reactivate genes on the Xi through loss of the XIST RNA. However, our independent studies of BRCA1 and XIST RNA revealed little evidence to support this model. We report that BRCA1 is not enriched on XIST RNA-coated chromatin of the Xi. Neither mutation nor depletion of BRCA1 causes significant changes in XIST RNA localization or X-linked gene expression. Together, these results do not support a role for BRCA1 in promoting XIST RNA localization to the Xi or regulating XIST-dependent functions in maintaining the stability of facultative heterochromatin.

The XIST noncoding RNA functions independently of BRCA1 in X inactivation.

Les femmes pr&eacute;sentant des mutations de la lign&eacute;e germinale dans BRCA1 sont pr&eacute;dispos&eacute;es &agrave; d&eacute;velopper le cancer du sein et les cancers de l&#39;ovaire. Un pr&eacute;c&eacute;dent rapport a indiqu&eacute; que BRCA1 putative avec et qu&#39;il est n&eacute;cessaire pour la localisation correcte de XIST, un ARN non codant qui recouvre le chromosome de X inactif (Xi) pour n&eacute;gocier la formation de l&#39;h&eacute;t&eacute;rochromatine facultative. Un mod&egrave;le a &eacute;merg&eacute; de cette &eacute;tude, ce qui sugg&egrave;re que la perte du BRCA1 dans les cellules femelles pourrait r&eacute;activer g&egrave;nes sur le Xi par la destruction de l&#39;ARN XIST. Cependant, nos &eacute;tudes ind&eacute;pendantes de BRCA1 et de l&#39;ARN XIST a r&eacute;v&eacute;l&eacute; peu de preuves &agrave; l&#39;appui de ce mod&egrave;le. Les auteurs rapportent que BRCA1 n&#39;est pas enrichi sur l&#39;ARN XIST-enduit de la chromatine du Xi. Ni mutation, ni appauvrissement du BRCA1 provoque des changements importants dans la localisation de l&#39;ARN XIST ou l&#39;expression du g&egrave;ne li&eacute; &agrave; le X. Ensemble, ces r&eacute;sultats ne supportent pas un r&ocirc;le pour BRCA1 dans promouvoir la localisation de l&#39;ARN XIST au Xi ou de r&eacute;gulation des fonctions sp&eacute;cifiques &agrave; XIST dans le maintien de la stabilit&eacute; de l&#39;h&eacute;t&eacute;rochromatine facultative.

Le XIST non-codantes RNA fonctionne ind&eacute;pendamment de BRCA1 dans X inactivation.

Le femmine con mutazioni germinali nel BRCA1 sono predisposti a sviluppare il seno e tumori ovarici. Una precedente relazione indicava che BRCA1 colocalizza con ed &egrave; necessario per la corretta localizzazione della esistono, un RNA non codificante che ricopre il cromosoma di X inattivo (Xi) per mediare la formazione dell&#39;eterocromatina facoltativa. Un modello &egrave; emerso da questo studio suggerisce che perdita di BRCA1 in cellule femminili potrebbe riattivare geni su Xi attraverso la perdita del RNA esistono. Tuttavia, i nostri studi indipendenti di BRCA1 e RNA esistono rivelato poche prove a sostegno di questo modello. Segnaliamo che BRCA1 non &egrave; arricchito su esistono RNA rivestito della cromatina del Xi. Mutazione n&eacute; deplezione di BRCA1 provoca cambiamenti significativi nella localizzazione esistono RNA o espressione del gene X-linked. Insieme, questi risultati non supportano un ruolo per BRCA1 nel promuovere la localizzazione esistono RNA per il Xi o che regolano le funzioni dipendenti esistono nel mantenere la stabilit&agrave; dell&#39;eterocromatina facoltativa.

Esistono non codificante RNA funzioni indipendentemente da BRCA1 in X inattivazione.

Histone variants replace the core histones in a substantial fraction of nucleosomes, affecting chromatin structure and impacting chromatin-templated processes. In many instances incorporation of histone variants results in formation of specialized regions of chromatin. Proper localization of histone variants to distinct regions of the genome is critical for their function, yet how this specific localization is achieved remains unclear. macroH2A1 is enriched on the inactive X chromosome in female mammalian cells, where it functions to maintain gene silencing. macroH2A1 consists of a histone H2A-like histone domain and a large, globular C-terminal macro domain that is not present in other histone proteins. The histone domain of macroH2A1 is alone sufficient to direct enrichment on the inactive X chromosome when expressed in female cells, indicating that sequences important for correct localization lie in this domain. Here we investigate whether divergent sequences of the H2A variant macroH2A1 contribute to its correct localization. We mapped the regions of the macroH2A1 histone domain that are sufficient for localization to the inactive X chromosome using chimeras between H2A and the histone domain of macroH2A1. Multiple short sequences dispersed along the macroH2A1 histone domain individually supported enrichment on the inactive X chromosome when introduced into H2A. These sequences map to the surface of the macroH2A1/H2B dimer, but are buried in the crystal structure of the macroH2A1 containing nucleosome, suggesting that they may contribute to recognition by macroH2A1/H2B deposition factors.

The histone domain of macroH2A1 contains several dispersed elements that are each sufficient to direct enrichment on the inactive X chromosome.

Variants d&#39;histones remplacent les histones de noyau en une fraction substantielle des nucl&eacute;osomes, affectant la structure de la chromatine et un impact sur les processus bas&eacute;s sur les mod&egrave;les de la chromatine. Incorporation d&#39;instances beaucoup des r&eacute;sultats de variantes histone dans la formation d&#39;une r&eacute;gion particuli&egrave;re de la chromatine. Bonne localisation de variants d&#39;histones &agrave; des r&eacute;gions distinctes du g&eacute;nome est critique pour leur fonction, mais comment cette localisation sp&eacute;cifique est r&eacute;alis&eacute;e reste incertaine. macroH2A1 est enrichi sur le chromosome X inactif dans les cellules mammif&egrave;res femelles, o&ugrave; il fonctionne pour maintenir le silen&ccedil;age g&eacute;nique. macroH2A1 se compose d&#39;une histone histone H2A-like et un domaine de macro C-terminal gros, globulaire, qui n&#39;est pas pr&eacute;sent dans d&#39;autres prot&eacute;ines histones. Le domaine histone de macroH2A1 est seul suffisant pour diriger l&#39;enrichissement sur le chromosome X inactif lorsqu&#39;elle est exprim&eacute;e dans les cellules femelles, ce qui indique que les s&eacute;quences importantes pour la localisation correcte se trouvent dans ce domaine. Ici, nous examinons si les s&eacute;quences divergentes de la macroH2A1 variante de H2A contribuent &agrave; sa localisation correcte. Nous avons cartographi&eacute; les r&eacute;gions du domaine histone macroH2A1 qui suffisent pour la localisation sur le chromosome X inactif, &agrave; l&#39;aide de chim&egrave;res entre H2A et le domaine histone de macroH2A1. Plusieurs courtes s&eacute;quences dispers&eacute;s le long de l&#39;enrichissement de domaine individuellement prises en charge histone macroH2A1 sur le chromosome X inactif lorsque introduit dans H2A. Ces s&eacute;quences correspondent &agrave; la surface du dim&egrave;re macroH2A1/H2B, mais sont enterr&eacute;s dans la structure cristalline de la macroH2A1 contenant du nucl&eacute;osome, sugg&eacute;rant qu&#39;ils peuvent contribuer &agrave; la reconnaissance par des facteurs macroH2A1/H2B d&eacute;p&ocirc;ts.

Le domaine histone de macroH2A1 contienne plusieurs &eacute;l&eacute;ments dispers&eacute;s qui sont chacune suffisante pour diriger l&#39;enrichissement sur le chromosome X inactif.

Varianti dell&#39;istone sostituiscono istoni nucleo in una frazione sostanziale di nucleosomi, che incidono sulla struttura della cromatina e impatto dei processi basati su modelli della cromatina. Incorporazione di istanze molti dei risultati di varianti dell&#39;istone nella formazione delle regioni specializzate della cromatina. Corretta localizzazione delle varianti dell&#39;istone di distinte regioni del genoma &egrave; fondamentale per la loro funzione, ma come avviene questa localizzazione specifica rimane poco chiaro. macroH2A1 &egrave; arricchita sul cromosoma X inattivo nelle cellule dei mammiferi femminili, dove esso funziona per mantenere il silenziamento genico. macroH2A1 &egrave; costituito da un dominio dell&#39;istone H2A-come istone e un grande, globulare dominio C-terminale macro che non &egrave; presente in altre proteine dell&#39;istone. Il dominio dell&#39;istone di macroH2A1 da solo &egrave; sufficiente a dirigere arricchimento sul cromosoma X inattivo quando espresso in cellule femminili, che indica che le sequenze importanti per la corretta localizzazione si trovano in questo dominio. Qui Indaghiamo se divergenti sequenze del macroH2A1 variante H2A contribuiscono alla sua corretta localizzazione. Abbiamo mappato le regioni del dominio histone macroH2A1 che sono sufficienti per la localizzazione sul cromosoma di X inattivo utilizzando chimere tra H2A e il dominio dell&#39;istone di macroH2A1. Pi&ugrave; brevi sequenze dispersero lungo l&#39;arricchimento macroH2A1 istone dominio supportato individualmente sul cromosoma X inattivo quando introdotti H2A. Queste sequenze mappa sulla superficie del dimero macroH2A1/H2B, ma sono sepolti nella struttura cristallina del macroH2A1 contenente nucleosoma, suggerendo che possa contribuire al riconoscimento di fattori macroH2A1/H2B deposizione.

Il dominio dell&#39;istone di macroH2A1 contiene diversi elementi dispersi che sono sufficienti per indirizzare l&#39;arricchimento del cromosoma X inattivo.

RNA localization is an important mechanism for achieving precise control of posttranscriptional gene expression. Previously, we demonstrated that a subset of cellular mRNAs copurify with mitotic microtubules in egg extracts of Xenopus laevis. Due to limited genomic sequence information available for X. laevis, we used RNA-seq to comprehensively identify the microtubule-interacting transcriptome of the related frog Xenopus tropicalis. We identified ~450 mRNAs that showed significant enrichment on microtubules (MT-RNAs). In addition, we demonstrated that the MT-RNAs incenp, xrhamm, and tpx2 associate with spindle microtubules in vivo. MT-RNAs are enriched with transcripts associated with cell division, spindle formation, and chromosome function, demonstrating an overrepresentation of genes involved in mitotic regulation. To test whether uncharacterized MT-RNAs have a functional role in mitosis, we performed RNA interference and discovered that several MT-RNAs are required for normal spindle pole organization and Î³-tubulin distribution. Together, these data demonstrate that microtubule association is one mechanism for compartmentalizing functionally related mRNAs within the nucleocytoplasmic space of mitotic cells and suggest that MT-RNAs are likely to contribute to spindle-localized mitotic translation.

Functional analysis of the microtubule-interacting transcriptome.

Localisation de l&#39;ARN est un m&eacute;canisme important pour obtenir un contr&ocirc;le pr&eacute;cis de l&#39;expression g&eacute;nique post-transcriptionnel. Auparavant, nous avons d&eacute;montr&eacute; qu&#39;un sous-ensemble des ARNm cellulaire mycelia avec les microtubules mitotiques dans l&#39;oeuf des extraits de Xenopus laevis. En raison de l&#39;information sur la s&eacute;quence g&eacute;nomique limit&eacute;e disponible pour X. laevis, nous avons utilis&eacute; la RNA-seq d&#39;identifier globalement le transcriptome interagissant avec les microtubules de la grenouille connexe Xenopus tropicalis. Nous avons identifi&eacute; des ARNm de ~ 450 qui a montr&eacute; l&#39;enrichissement significatif sur les microtubules (MT-RNAs). En outre, nous avons d&eacute;montr&eacute; que le MT-ARN incenp, xrhamm et tpx2 associent avec les microtubules du fuseau in vivo. MT-RNAs sont enrichis de transcriptions associ&eacute;es &agrave; la division cellulaire, la formation du fuseau et fonction de chromosome, d&eacute;montrant une surrepr&eacute;sentation des g&egrave;nes impliqu&eacute;s dans la r&eacute;gulation mitotique. Pour v&eacute;rifier si le MT-RNAs ind&eacute;termin&eacute;s ont un r&ocirc;le fonctionnel dans la mitose, nous avons effectu&eacute; l&#39;interf&eacute;rence d&#39;ARN et d&eacute;couvert que plusieurs MT-RNAs sont requis pour l&#39;axe normal p&ocirc;le organisation et la &gamma;-tubuline distribution. Ensemble, ces r&eacute;sultats d&eacute;montrent que les association de microtubules est un m&eacute;canisme pour compartimenter les ARNm fonctionnellement li&eacute;es au sein de l&#39;espace nucl&eacute;ocytoplasmique des cellules mitotiques et sugg&egrave;rent que le MT-RNAs sont susceptibles de contribuer &agrave; localis&eacute; du fuseau mitotique traduction.

Analyse fonctionnelle de la transcriptome interagissant avec les microtubules.

Localizzazione di RNA &egrave; un meccanismo importante per conseguire un controllo preciso dell&#39;espressione del gene posttranscriptional. In precedenza, abbiamo dimostrato che un sottoinsieme dei mRNAs cellulare copurify con microtubuli mitotici in uovo estratti di Xenopus laevis. A causa di informazioni limitato sequenza genomica disponibile per X. laevis, abbiamo usato il RNA-seq per identificare esaurientemente transcriptome microtubule-interazione della rana Xenopus tropicalis correlato. Abbiamo identificato mRNAs ~ 450 che ha mostrato notevole arricchimento su microtubuli (MT-RNAs). Inoltre, abbiamo dimostrato che la MT-RNAs incenp, xrhamm e tpx2 associare a microtubuli del fuso in vivo. MT-RNAs sono arricchiti con le trascrizioni associate alla divisione cellulare, mandrino formazione e funzione del cromosoma, dimostrando una sovrarappresentazione di geni coinvolti nella regolazione mitotica. Per verificare se atipici MT-RNAs hanno un ruolo funzionale nella mitosi, abbiamo eseguito l&#39;interferenza del RNA e scoperto che parecchi MT-RNAs sono richiesti per mandrino normale Polo organizzazione e &gamma;-tubulina distribuzione. Insieme, questi dati dimostrano che la associazione dei microtubuli &egrave; un meccanismo per la divisione in compartimenti mRNAs funzionalmente correlate all&#39;interno dello spazio di nucleo-citoplasmatici delle cellule mitotic e suggeriscono che MT-RNAs sono suscettibili di contribuire alla traduzione mitotico localizzato mandrino.

Judith A. Sharp

Department of Molecular Biology

Massachusetts General Hospital

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Judith A. Sharp

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Massachusetts General Hospital

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Department of Molecular Biology