Denaturing 요소의 Polyacrylamide 젤 전기 영동 (우레아 페이지)

요약

Denaturing 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동은 단일 좌초 DNA를 분리 또는 500 세포핵의 한계까지 RNA하는 데 사용됩니다. 열 denatures 샘플 및 구조화되지 않은 단일 가닥와 함께 요소는 분자량에 따라 겔 매트릭스 내에서 마이 그 레이션.

초록

요소 페이지 또는 요소의 polyacrylamide 젤 전기 영동을 denaturing는 보조 DNA 또는 RNA의 구조를 denatures 및 분자량에 따라 polyacrylamide 젤 매트릭스에서 분리에 사용되는 6-8 M의 요소를 고용합니다. 2-500 기지 사이의 조각은 단일 염기만큼 작은 길이의 차이로이 방법 ^1을 사용하여 분리 수 있습니다. 샘플의 마이 그 레이션 선택한 아크릴 아미드의 농도에 따라 좌우됩니다. polyacrylamide의 높은 비율의 낮은 분자량 조각을 해결합니다. 요소와 45-55의 온도의 조합 ° C 젤 실행하는 동안 비정형 DNA 또는 RNA 분자의 분리 수 있습니다.

일반적으로이 방법은 단일 좌초된 DNA 또는 효소 절단 반응에서 합성 또는 분류 oligonucleotides 또는 제품으로 RNA 조각을 분석하거나 정화가 필요합니다.

이 비디오를 문서에서 우리는 denaturing 요소의 polyacrylamide의 젤류을 준비하고 실행하는 방법을 보여줍니다. 기술 팁은 원래 프로토콜 ^1,2 이외에 포함되어 있습니다.

프로토콜

이 실험 절차에 대한 완전하고 상세한 텍스트 프로토콜은 분자 생물학의 현재 프로토콜에서 사용할 수 있습니다. 겔 샌드위치의 조립 및 겔 장치에 대한 자세한 단계별 지침은 BioRad 웹사이트 ³ 확인할 수 있습니다.

필수 장비 :
유리 접시 (내부 및 외부)
10cm 셀 : 10.1 X 7.3 cm (내부 판), 10.1 X 8.2 cm (외부 판), BioRad
20cm 셀 : 20 X 20cm (내부 판), 20 X 22.3 cm (외부 판), BioRad
0.5-1.5 mm 겔 빗과 스페이서
겔 주조 스탠드
덮개와 케이블로 젤 장치
고전압 전원 공급 장치
난방 장치 블록이나 물 목욕
Serological pipettes 및 피펫 에이드
피펫 및 피펫 팁
겔 건조기 스캐너

시약 및 솔루션 :
요소 (ultrapure)
40 % polyacrylamide 솔루션 (29:1)
10 × TBE 솔루션 (트리스 - Borate, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼)
Deionized, 증류수
TEMED
30 % (W / V) 암모늄 persulfate 솔루션
0.5 X TBE 솔루션
포름 아미드
EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)
크실렌 cyanol
Bromphenol 블루
메탄올
에탄올

음량	50 ML			60 ML			10 ML
아크릴 아미드 농도	10%	12.5 %	15%	10%	12.5 %	15%	10%	12.5 %	15%
g 요소	24	24	24	28.8	28.8	28.8	4.8	4.8	4.8
ML 40% 아크릴 (29:1)	12.5	15.625	18.75	15	18.75	22.5	2.5	3.125	3.75
UL 30 % APS	166	166	166	199.2	199.2	199.2	33	33	33
UL TEMED	20	20	20	24	24	24	4	4	4
10 × TBE	5	5	5	6	6	6	1	1	1
deionized, 증류수로 볼륨을 채워

표 1 : 단일 좌초 oligonucleotides를 해결하기위한 다양한 아크릴 아미드의 농도와 볼륨에 필요한 시약 및 솔루션

겔 샌드위치 어셈블리 및 젤 준비

1. 제조 업체의 설명에 따라 겔 조립 및 겔 - 캐스팅 챔버 ³ 겔을 수정. 0.5-1.5 mm 두께 스페이서를 사용합니다.
2. 분자 생물학의 현재 프로토콜에 따라 적절한 polyacrylamide 솔루션을 준비하거나 표 1에 나열. 20cm의 denaturing 아크릴 아미드 젤에 대한 X 22cm X 1.5 mm, 젤 솔루션 60 ML과 10.1 X 8.2 cm에 대한 X 1mm 겔 5 ML 젤 솔루션은 충분합니다. 예상 제품 / 밴드 몇 기지의 범위 내에있는 경우 큰 젤을 사용하는 다음, 더 이상 젤는 단일 염기의 차이로 밴드를 해결할 수 있습니다. 예상 밴드는 10 개 이상의 세포핵에 차이가있다면, 작은 젤은 조각을 해결하기 위해 적합한 것입니다. 귀하의 분리 요구 사항을 맞는 polyacrylamide의 비율을 선택, 높은 polyacrylamide의 농도는 낮은 분자량의 조각을 해결할 수 있습니다. 아크릴 아미드의 원하는 양의 ultrapure의 요소와 믹스를 사용합니다. 0.5-1 X TBE의 최종 농도를하고 deionized, 증류수로 볼륨을 채울 수있는 겔 믹스에 TBE 버퍼를 추가합니다. 전자렌지에 20 초 동안 솔루션을 가열하고 그것을 부드럽게 섞는다. 솔루션 손이 따뜻한 때까지 큰 겔 볼륨이 단계를 반복하십시오.
3. 즉시 serological 피펫과 두 개의 유리 판 사이에 자동 피펫 에이드를 사용하여 겔 하거라. 공기 방울을 도입하지 마십시오. 빗를 삽입하고 젤 30-60분을위한 중합 보자.

전기 영동 장치를 설정하고 젤 prerun

1. 지침 ³ 제조에 따라 주조 챔버와 겔 장치에 어셈블리를에서 젤 분리합니다.
2. 유리 플레이트가 서브됩니다 낮은 버퍼 챔버 재치 실행 버퍼 (0.5-1 X TBE) 작성버퍼 2~3cm을 통합. 버퍼를 실행하는 젤의 맨 위쪽 버퍼 챔버를 입력합니다.
3. 조심스럽게 빗를 제거하고 도움말을 읽어 피펫 및 젤을 사용하여 실행 버퍼로 우물을 씻어.
4. 고전압 전원 공급 장치에 케이블에서 겔 시스템 및 플러그의 뚜껑을 연결합니다. 당신이 샘플을 로드할 수 있습니다 전에 젤을 가열하고 젤 남아 요소를 제거하려면 최소 30 분 동안 젤 prerun해야합니다. 최적 온도는 45-55 사이 여야합니다 ° C. 60보다 높은 온도 ° C 밴드는 얼룩이나 유리 조각이 균열있을 수 있으므로.을 피하십시오 prerun (겔 당 15-25 W)에 대한 지속적인 와트를 선택합니다.

샘플 준비

1. 그 동안에 샘플을 준비합니다. 따라서, 샘플 2 X 젤 로딩 믹스의 해당 금액을 추가합니다. 로딩 혼합은 일반적으로 90 % 포름 아미드, 0.5 % EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 % 크실렌 cyanol와 0.1 % bromphenol 파란색이 포함되어 있습니다.
2. 샘플이 젤에로드하기 전에 샘플을 몇 분 동안 70-90 ° C 사이의 샘플을 가열하여 열기가 변성해야합니다.

젤로드 및 실행

1. prerun가 완료되면 뚜껑을 제거하고 완전히 같은 요소가 우물에 leached 것처럼 언급한 주머니를 씻어.
2. 주머니 바닥에서 신중하게 샘플을 적용합니다. 공기 방울을 도입하지 마십시오. 버퍼를 로딩하면 실행되는 동안 같은 상태를 유지하기 위해 빈 주머니에 적용되어야합니다.
3. 뚜껑을 조립하고 55 젤 온도를 유지하기 위해 지속적인 와트에서 젤을 실행 ° C prerun과 유사합니다. 염료 앞에는 젤의 하단에 도달 때까지 마커 염료의 마이 그 레이션을 관찰합니다. 운영 기간은 사용되는 아크릴 아미드의 비율, 버퍼와 겔 두께의 이온 강도에 따라 좌우됩니다. 실행 2-4시간 사이에 마지막으로하실 수 있습니다.
   젤의 온도를 확인합니다. 겔 온도계가 실행되는 동안 적당한 온도를 모니터링하는 데 도움이 될 수 있습니다.

젤 공정

1. 염료 앞에는 젤의 끝에 도달하면 낮은 버퍼 챔버의 겔을 넣어. 챔버에서 젤을 제거하고 클램프를 느슨하게. 스페이서 멀리 당겨 조심스럽게 유리 접시를 감추고 있기도 하죠. 필요한 잘 겔 부분을 포함하고있는 상위 버려야하는 경우.
2. 조심스럽게 겔 고정 솔루션 (TBE 플러스 5-10%의 메탄올과 에탄올의 농도가 동일)와 함께 접시에 젤을 전송하기만하면됩니다. 50~10분위한 솔루션으로 젤두고 버퍼를 두 번 변경할 수 있습니다.
3. 젤은 진공 겔 건조기 또는 젤 직접 스캔을 사용하여 추가 처리를위한 준비가되었습니다.

토론

1. 밴드 날카로움은 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 선명한 밴드를위한로드 샘플의 볼륨 즉, 이상적으로 1-5 μl 사이에 가능한 작게해야합니다. 그러나, 최대 15 μl 여전히 허용 해상도를 보장하는 로드할 수 있습니다. 선명 밴드의 적은 샘플 량 결과.
2. 밴드 품질 또한 겔의 두께에 따라 좌우됩니다. 같은 0.75 mm로 얇은 젤은, 1.5 mm 두께 젤보다 더 나은 결과를 보여줍니다.
3. 샘플은 겔 주머니에 동일...