siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

요약

여기 이미지는 기본 프로토콜을 설명하고 siRNA의 transfection 후 라이브 포유 동물 조직 배양 세포의 mitotic 타이밍을 계량.

초록

세포 조직과 유사 분열하는 동안 발생하는 염색체 역학의 변화가 밀접하게 게놈 및 세포 내용의 정확한 상속을 보장하기 위해 조정됩니다. 이러한 염색체의 움직임과 같은 유사 분열의 전형적인 이벤트가, 쉽게 특정 GFP - 태그 단백질을 표현하는 포유 동물 세포 라인의 시간 경과 형광 현미경을 사용하여 개별 셀 단위로 추적할 수 있습니다. RNAi 기반의 고갈와 함께, 이것은 특정 단백질의 수준을 낮춘 후에 결함이 발생할 유사 분열의 무대 (들)을 pinpointing위한 강력한 방법으로하실 수 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 유사 분열의 타이밍에 대한 잠재적인 mitotic 규제 단백질을 파괴의 효과를 평가하기위한 기본적인 방법을 제시한다. 세포는 siRNA와 transfected 무대 위로 배양 챔버에 배치하고, 자동화된 형광 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 우리는 어떻게 아직도 이미지 montages이나 영화 중 하나를 만들기 위해 이미지 시퀀스를 처리하는 데 시간이 경과 실험을 설정하는 소프트웨어를 사용하는 방법에 대해 설명하고, 계량 및 표현 세포 라인을 사용하여 mitotic 단계의 타이밍 분석하는 방법을 mCh​​erry을 히스톤 H2B 태그. 마지막으로, 우리는 시간 경과 실험을 설계에 대한 중요한 고려 사항을 토론합니다. 이 전략은 다른 접근법을 보완하고 약물 치료를 사용하여 세포주기를 동기화 할 필요가없이 유사 분열의 인구 2) 분석과 같은 세포에서 볼 때 관찰되지 않는 운동의 변화에​​) 감도를 1의 장점을 제공합니다. 이러한 이미징 실험에서 시각 정보뿐만 아니라 유사 분열의 하위 단계가 평가 수 있습니다뿐만 아니라 외과의 세포주기 분석에서 나타나지 않을 예상치 못한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

프로토콜

siRNA의 transfection과 셀 준비

1. 사용 각 잘하는 fibronectin (10μg/mL)의 0.5mL를 추가하여 4 잘 LabTek II chambered의 coverglass를 준비합니다. 상온에서 10~15분에 대한 부화.
2. 제조 업체의 지시에 따라 반대로 transfection에 대한 siRNA / Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) 단지를 준비합니다. (100μL 총) 사용할 수 챔버 당 24 잘 요리를 잘 하나 권장 금액을 사용합니다. siRNA의 transfection에 대한 유사 제품 / 프로토콜은 대체 수 있습니다.
3. chambered의 coverglass의 우물에서 fibronectin을 제거합니다. 사용 각 잘하는 siRNA / Lipofectamine RNAiMAX 단지의 100μL를 추가합니다.
4. 나누어지는 20,000 히스톤 H2B - mCherry - 표현 잘 transfection 혼합물을 포함하는 당 세포를 (500μL)입니다.
5. 세포가 정상 세포 배양 매체 1mL와 함께 transfection 혼합물을 교체하기 전에 ~ 24 시간 동안 부화 수 있습니다.
6. 이미지 수집하기 전에 부화는 세포 추가 24 시간 (48시간 포스트 transfection).

현미경 설정 및 이미지 수집

7. 이미지 수집 설정을 세 가지 주요 부분이 있습니다 : 1) 현미경의 무대에서 맞는 37의 지속적인 습기가 환경을 유지하고 세포 배양기 ° C, 5 %의 CO _2, 2) 자동 스테이지를 갖춘 바뀌 현미경, 자동 형광 및 브라이트 셔터 및 자동 필터 바퀴, 그리고 3) 소프트웨어 무대를 통합하고 제어 패키지, 셔터, 및 필터 바퀴. 우리 이미지 설정에서, 우리는 LabTek II chambered coverglass와 함께 사용할 수 있습니다 오코 연구소에서 사용자 정의 셀 인큐베이터를 사용합니다. 무대, 셔터, 및 필터 바퀴는 Metamorph 소프트웨어에 의해 제어되는 힌트는 :. 오코 랩 무대 위로 보육 시스템은 다른 접시, 접시, 또는 coverslip 크기의 다양한 어댑터를 포함하고 있습니다.
8. , 미리 예열 및 equilibrated 인큐베이터의 뚜껑을 열고 어댑터에 chambered의 coverglass을 배치하고, 모델링 점토와 장소에서 개최하여 인큐베이터에서 LabTek II chambered의 coverglass 위치. 세포 배양 매체가 건조하지 않도록 chambered의 coverglass에 덮개를 둡니다. 뚜껑을 닫고 인큐베이터가 자리에 단단히 개최 있도록, 현미경 단계에있는 전체 배양기를 위치.
9. Metamorph를 사용하여 소프트웨어의 메뉴 막대에서 "애플 리케이션 / 다차원 취득"을 선택하여 실험을 설정합니다. 이것은 timelapse의 빈도와 길이를 선택할 수있는 창이 나타납니다, 각 색상에 대한 노출 시간 (경우 여러 설정하고), 번호와 무대 위치의 위치, 그리고 Z - 섹션의 수를 (경우 원하는). . 데이터 파일을 저장할 위치를 선택 힌트 : Metamorph 이외의 소프트웨어를 사용하는 경우, 기능이 약간 다를 수 있습니다하지만 전반적인 개념은 동일합니다. 마이크로, 대부분의 하드웨어 설정과 호환되는 오픈 소스 기반의 ImageJ 수집 소프트웨어는 훌륭한 대안입니다.
10. .이 프로토콜의 목적을 위해, 우리는 두 가지 파장 (브라이트 및 mCherry) 15 단계 위치 힌트 8 시간 동안 매 15 분 영상을 얻은 것입니다 더 나은 시간 해상도가 원하는 경우, 다음이 인수 사이의 시간 간격을 단축할 수 있으나 , 적은 무대 위치를 사용할 수 있으며, 따라서 적은 mitotic 세포는 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 시간 간격이 계정에 필터 설정 사이를 전환할 수있는 필터 휠을에 필요한 시간을 위해 고려할 때 그것은 중요하다.
11. 첫째 브라이트 조명을 사용하여 전지의 분야에 초점을하여 각 파장에 대한 최적의 노출 시간을 확인합니다. . 소프트웨어에만 브라이트 채널 (이것은 각각의 인수하기 전에 각 단계의 위치에 오토포커스 소프트웨어를 수)두기에 대한 자동 초점 기능을 조정 : 우리는 석유없이도 뛰어난 해상도를 제공하는 40x 드라이 위상 대비 목표를 사용하여 . 다른 목표는 원하는 광학 해상도에 따라 사용할 수 있습니다.
12. mCherry 파장로 전환하여 50 밀리초 노출을 사용하여 이미지를 스냅. 좋은 이미지를 볼하는 데 필요한 최소 노출 시간을 조정합니다. 그것은 지속적인 세포 생존을 보장하기 위해 빛의 노출의 양을 제한하는 것이 필수적입니다. 일반적으로, 이것은 가장 조명 강도를 높임으로써보다 중립적인 밀도 필터 (여기 빛의 유량을 줄이기 위해)와 더 이상 카메라 노출 시간을 사용하여 얻을 수 있습니다. 사용할 수있는 추가적인 파장에 대해이 절차를 반복 힌트 :. 실험을 위해 주어진 노출에 장기 세포 생존을 확인하려면, 당신은 일시적으로 timepoint 간격을 조정하여 원하는 timelapse 이상의 세포가 살아남을 수 이미지의 총 수를 미리 볼 수 있습니다 초 분 (즉, 10 분. 10초됩니다.) 당신의 세포가 100-200 노출 (또는 살아남을 수있다면적절한 숫자) 후 노출이 괜찮습니다. 그렇지 않다면, 당신 여기 조명, 노출 시간, 또는 전체 실험을 시뮬레이션하는 이미지의 총 수를 줄일 수 있습니다.
13. 다음을 선택하고 셀 인구의 충분한 샘플링을 달성할 수 있도록 무대 위치의 적절한 숫자를 표시합니다. Metamorph의 위치를 기록하고 각 인수에 대해이 반환됩니다 힌트를 :. 나는 일반적으로 그들이 너무 밀도 수 있도록 많은 많은 세포의 이미지에가있는 위치를 찾으려고하지만,하지 않습니다. 또한 유사 분열을 통해 진행 세포의 대량 관찰의 좋은 기회를 얻게 될 수 있도록 충분한 위치를 선택하는 것이 중요합니다.
14. 모든 timelapse, 파장 노출 시간, 무대의 위치 정보가 기록된 후에는 소프트웨어가 적절하게 장비를 제어인지 확인 화면에 "미리보기"버튼을 선택합니다.
15. 당신이 만족되면, 수집을 시작하려면 화면에서 "가져오기"버튼을 선택합니다. 그런 다음 다시 앉아 컴퓨터와 작업을 수행하는 현미경을 허용 힌트 :. 모든 것이 제대로 작동하기 위해 인수 중 적어도 하나 둥근 통해 자동화를 관찰.

이미지 프로세싱 및 분석

16. 인수가 완료되면 다음 단계는 처리하기가 쉽습니다 형식으로 이미지 데이터를 전송하는 것입니다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 나는 ImageJ 프로그램을 사용하여 이미지 montages를 생성하는 방법을 다음 Metamorph를 사용하여 동영상을 생성하는 방법을 보여 첫번째 것입니다. 어느 형식 부량 목적에 유용합니다.
17. 첫 번째 단계는 데이터를 검토하는 것입니다. 이렇게하려면, 메뉴 표시줄에서 "애플 리케이션 / 검토 다차원 데이터"를 선택하십시오. 파일의 위치를​​ 선택한 다음, "보기"를 선택하십시오. 이것은 개별적으로 각 단계의 위치에서 이미지의 스택을 검토하실 수 있습니다. 원하는 무대 위치를 선택한 다음 "이미지로드". 당신은 데이터 프레임별로 프레임을 통해 사전하실 수 있습니다.
18. 세포가 유사 분열 (같은 DNA와 세포의 형태 모두에 의해 결정)을 통과하는 그 무대 위치 들어, Metamorph를 사용하여 영화와 montages를, 또는 ImageJ (NIH를 통해 무료로 가능)와 같은 다른 프로그램과 수 있습니다.
19. Metamorph에서 영화를 만들려고, "프로세스 / 동영상 저장"을 선택합니다 메뉴 표시줄 인치 당신은 어떤 사용하는 프레임의 속도와 동영상의 파일 유형을 선택하실 수 있습니다. 그런 다음 "저장 무비"를 선택하십시오.
20. 몽타주를 만들기 위해선, 그런 ImageJ 같은 다른 프로그램에서 사용할 수있는,. stk 파일로 이미지 스택을 저장합니다.
21. ImageJ에서 파일을 열고 당신은 유사 분열을 통해가는 세포를 찾을 때까지 프레임을 사전. . 세포 주변의 영역을 자르기와 "이미지 / 복사"를 선택 힌트 : 모든 프레임을 복제해야합니다.
22. 몽타주를하려면, "이미지 / 스택 / 몬티지 만들기"를 선택합니다 메뉴 표시줄 인치 여기 당신이 몽타주의 크기와 모양을 포함하고자하는 프레임 지정할 수 있으며 프레임 사이의 경계선을할지 여부. 다음을 선택하고 "좋아"누르십시오. .. TIF 파일로 몽타주를 저장하고 ImageJ 또는 Adobe 포토샵 하나에서 더 이상 처리를 할 힌트 : 쉽게 이미지 프로세싱을위한 8 비트 형식으로 Metamorph 사용하는 16 비트 형식의 몽타주 파일을 변경합니다.
23. 유사 분열의 다른 단계에서 시간을 계산하려면, 염색체가 적도 (prophase / prometaphase 시간), 프레임에 정렬되기 전까지는 염색체가 분리 시작할 때까지 t = 0 (DNA의 응축 또는 셀 라운딩의 첫 징후), 프레임의 수를 계산 결정 (metaphase 시간), 그리고 프레임 전지 (anaphase / telophase / cytokinesis) 평평하게 시작할 때까지. 각 mitotic 단계의 계산 시간은 각 프레임 사이의 시간 간격에 따라 달라집니다.

대표 결과

그림 1은 히스톤 H2B - mCherry을 표현 헬라 세포 라인을 사용하여 일반적인 컨트롤 siRNA의 transfection 실험에서 결과를 보여줍니다. 이러한 방법은 후반 유사 분열 ^1의 타이밍에 nucleoporin Nup153에 대한 예기치 않은 역할을 노출, mitotic 타이밍을 수치 효과적으로 사용되고 있습니다. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

토론

이미징 및 형광 단백질 기술의 최근 발전과 함께, 라이브 영상은 세포 분석 ² 일상적인 부분이되었다. GFP의 다양한 (그리고 다른 색상 변종 ³⁾ - 태그 단백질은 광범위하게 사용할 수 없거나 구성 상대적으로 쉽고 DNA / 염색체 역학 ^{4, 5,} centrosome 중복 ^6, cyclin B 역학을 포함하여 세포 분열의 특징의 수를 추적하는 데 사용할 수 있습니다 ^7, 핵 봉투 분해와 reassembly ^{8, 9,} mitotic 스핀들 형성 ^10, cytokinesis ¹¹ 여러 단계. 형광 태그의 여기 / 발광 스펙트럼 호환 때 태그 단백질은 특정 사건 사이의 협력이 평가 수 있도록, 혼자 또는 조합에서 사용할 수 있습니다. 큰 공간 및 / 또는 시간적 해상도가 / 원하는 경우, 공촛점 레이저 스캐닝, 스피닝 디스크 또는 공명 검사를 사용할 수 있는지 여부를 현미경, 그리고 계속 증가 해상도 정교한 현미경 옵션의 목록은 성장을 계속하고 있습니다. 포유 동물 세포의 유사 분열의 라이브 영상도 높은 처리량 RNAi과 작은 분자 화면 ^12-14에 사용하기 위해 적응되었습니다. 따라서이 기술을 사용하여 하나의 초기 실험 비교적 간단 수 있지만,이 전략을 구축하기위한 가능성은 방대합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-075
Lab Tek II Chambered Coverglass (4-well)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	12-565-337	Additional chamber sizes are available
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
Stage-top cell incubator	OKO Lab		Can use any appropriate chamber
Automated inverted fluorescence microscope	Olympus Corporation		Can use any appropriate microscope
Software package	Metamorph		Can use any appropriate software