전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization

요약

재관류의 decellularization는 기관의 세포외 기질 구성과 마이크로 아키텍처를 유지 전체 간 공사장 공중 발판을 생산하는 새로운 기술입니다. 여기에, hepatocytes과 재관류의 decellularization 이후 repopulation를 사용하여 전체 오르간 공사장 공중 발판을 준비하는 방법이 설명되어 있습니다. 기능 및 transplantable 간 이식이 기술을 사용하여 생성할 수 있습니다.

초록

간은 ¹ 생존하기 위해서는 영양분과 산소와 폐기물의 제거 전달 지속적인 살포가 필요 복잡한 기관이다. 조직 공학 및 microfabrication 기술을 사용하여 접근까지 경내로 간 미세 구조를 재현하거나 모방하는 노력은 지금까지이 디자인 도전으로 인해 성공적으로되지 않았습니다. 또한, 간 조직 공학 응용 프로그램에 대한 공사장 공중 발판을 만드는 데 사용되는 합성 biomaterials 인해 적절한 세포 기능 ² 유도 것이 특정 세포 바인딩 작품의 부족으로 많은 부분에서 조직 재생 및 수리를 유도 제한되었습니다. 반면에 Decellularized 기본 tissues 같은 혈관 ³ 피부에 ⁴ 조직 공학에 많은 응용 프로그램을 발견하고 도전 중 일부에 대한 실용적인 솔루션을 제공하고 있습니다. decellularized 기본 행렬의 장점은 따라서 세포 부착 및 개편 ⁵ 강화, 정도, 원래 구성 및 미세로 유지한다는 것입니다.

이 작품에서 우리는 방법이 주요 혈관의 구조를 유지 손상 간 bioscaffold가 얻은 것입니다 그러한 간의 재관류 - decellularization을 수행하기 위해 설명합니다. 또한, 우리는 체외에서 기능을하는 간 이식을 만드는, 성인 주요 hepatocytes 이러한 bioscaffolds을 recellularize하는 방법을 설명하고, 생체내에서 이식에 필요한 선박 액세스할 수 있습니다.

프로토콜

1. 간 Decellularization

1. 포털 정맥 사용 cannulation 및 18 게이지 카테터와 쥐의 간을 수확. 열등하고 우수한 베나 카바를 열어 둡니다. 인산염의 기관은 수산화 유지 10 cm 배양 접시에있는 호수 (PBS)가 버퍼.
2. 8 리터 저수지, 연동 펌프와 버블 트랩으로 구성되어 있습니다 재관류 시스템을 설정합니다.
3. 인산염과 재관류 시스템을 작성하는 것은 생리 버퍼링하고 10 분 동안 계속 실행. 10 cm 배양 접시에 PBS를 입력하고 인산의 흐름 속도는 1 ML / 분에 생리 버퍼 줄일 수 있습니다.
4. 조심스럽게 인산염에 수확 간 전송하면 생리 채워진 10 cm 배양 접시를 버퍼.
5. 하룻밤 PBS의 재관류를 계속합니다.
6. 5 분 증류수에 0.01 % (W / V) 나트륨 dodecyl 황산 (SDS)와 재관류를 시작합니다.
7. 1 시간 PBS로 Perfuse.
8. 매번 10, 15 및 20 분 SDS 재관류 시간을 증가 단계 1.6 및 1.7 이상을 세 번 반복합니다.
9. 24 시간 동안 0.01 % (W / V) SDS와 재관류를 계속합니다.
10. 24 시간 동안 0.1 % (W / V) SDS와 재관류를 계속합니다.
11. 3 시간 동안 0.2 % (W / V) SDS와 Perfuse.
12. 3 시간 동안 0.5 % (W / V) SDS와 Perfuse.
13. 15 분 동안 증류수로 Perfuse.
14. 어떤 바운드 핵산을 제거하는 데 30 분의 1 % (W / V) 증류수의 트리톤 X - 100 Perfuse.
15. decellularized 간 매트릭스 (DLM), 2 시간 동안 PBS로 perfuse을 씻어.
16. 옵션 : 중간 엽을 제외한 모든 엽 (叶)을 잘라 내다.
17. (그림 1)를 사용하여 준비까지 4 ^O C에서 PBS에 담가 깨끗하고 봉인 페트리 접시에서 DLM을 저장합니다.
18. DLM를 검사하려면 : 1) 멸균 PBS 4 ^O C.에서 0.1 % (V / V) peracetic 산성과 4 % (V / V) 3 시간 동안 에탄올과 부화를 포함하는으로 DLM을 플러쉬 2) 멸균 PBS로 2 번 씻으십시오. 3) 멸균 PBS가 2% 페니실린 - 스트렙토 마이신, 10ug / ML gentamicin, 및 2.5 UG / ML amphotericin B. 스토어 recellularization 실험에 사용할 준비까지 4 ^O C에서 동일한 솔루션에 decellularized 간을 포함로 씻으십시오.

2. Decellularized 간 매트릭스 Recellularization

1. 재관류 챔버, 무균 조건 하에서 연동 펌프와 버블 트랩으로 구성되어 있습니다 재관류 시스템을 설정합니다. 문화 매체, 예를 들어, 높은 혈당 DMEM (시그마) 10 % 태아 소 혈청 (Hyclone), 100 U ML ^-1 페니실린, 100 μg ML ^-1 스트렙토 마이신 (Invitrogen) 200 ML과 재관류 시스템을 채우십시오.
2. 재관류 챔버에서 decellularized 간 매트릭스를 놓고 펌프 어떤 공기 거품의 형성을 피하기 5 ML / 분 실행되는 동안 포털 정맥 정맥을 통해 관류 시스템에 DLM를 연결합니다.
3. 30 분 DLM을 통해 매체의 재관류를 허용합니다.
4. 적어도 90 % 생존과 성인 쥐의 기본 hepatocytes을 분리.
5. 재관류 시스템의 흐름을 중지하고 천천히 거품 트랩을 통해 관류 시스템에 50,000,000 hepatocytes를 (문화 매체 1-3 ML)을 주입.
6. 10 ML / 분 흐름을 시작하고 10 분 동안 매체를 recirculate.
7. 200000000 세포의 총이 DLM (그림 2) ^6에 도입되기 전까지 단계 2.5 2.6 반복합니다.
8. 일단 모든 세포가 DLM에 perfused 있으며, 10 분 동안 600 RPM에서 4 50 ML 원심 분리기 튜브와 원심 분리기에 perfusate를 수집합니다. supernatants를 버리고 하나의 튜브로 알약을 수집합니다. 시딩 효율을 결정하는 trypan 파랑 배제를 통해 세포 생존의 수를 결정합니다.

3. Recellularized 간 이식의 체외 문화

1. 재관류 챔버, 멸균 조건 (그림 3)에 따라 연동 펌프, oxygenator 및 버블 트랩으로 구성되어 있습니다 재관류 시스템을 설정합니다. 문화 매체 50 ML과 재관류 시스템을 채우기 예, 윌리엄스 'E (시그마) 5 % 태아 소 혈청 (Hyclone가), 0.5 U ML ^-1 인슐린 (엘리 릴리), 20 NG ML ^-1 EGF (Invitrogen) 14 NG ML ^-1 글루카곤 (베드퍼드 연구소), 7.5 μg ML ^-1 하이드로코티손 (Pharmacia), 100 U ML ^-1 페니실린, 100 μg ML ^-1 스트렙토 마이신 (Invitrogen).
2. 재관류 챔버에서 recellularized 간 이식을 놓고 펌프 어떤 공기 거품의 형성을 피하기 5 ML / 분 실행되는 동안 포털 정맥 정맥을 통해 관류 시스템에 DLM를 연결합니다.
3. 무균 재관류 챔버를 닫고 문화 동안 누출을 방지하기 위해 단단히 밀봉합니다.
4. 37 ^O C이며 10 %의 CO가 인큐베이터에 재관류 시스템을 전송 ₂ 15 ML / 분에 재관류 흐름 속도를 향상시킬 수 있습니다.
5. 95 % O ₂ 5% CO ₂ 가스 혼합물 탱크에 oxygenator를 연결하고 가스 유량 0.5 리터 / 분으로 설정합니다. 이것은 approxima의 산소 분압을 달성한다tely 400 mmHg.
6. 문화 문화 매체의 매일 변화에 최대 10 일 계속 사용할 수 있습니다. 문화 매체는 알부민, 요소 및 총 담즙산의 분비 등 그래프트의 간 기능의 모니터링을 위해 매일 맛볼 수 있습니다. 문화 기간의 끝에, recellularized 간 이식은 분자와 histological 분석을 위해 샘플 수 있습니다.

4. 대표 결과 :

쥐 간 전체 decellularization는 설명 프로토콜을 사용하는 방법에 대한 72 시간 정도 소요됩니다. 결과 매트릭스는 원섬유의의 콜라겐의 100 %, glycosaminoglycans의 50 %와 원시 간 DNA (표 1) ⁶ 단 5 %를 유지합니다. 모체의 혈관 구조로 부식은 주조 및 전자 현미경 분석 (그림 4) ^6을 검색하여 입증 보존되어 있습니다. DLM 내에서 혈관 마이크로 아키텍처의 존재는 96 % 효율성과 체외 문화에 대한 이후의 재관류와 세포와의 repopulation을 용이하게합니다. recellularized 간 이식은 체외에서 10 일까지 교양과 같은 알부민, 요소 및 총 담즙산의 분비 (그림 5) ^6를 통해 확인 적절한 간 기능을 표시 수 있습니다.

그림 1. decellularization 과정의 끝에 간 매트릭스를 Decellularized. 절제술 후 (A) 전체 간은 (B) 평균 엽.

그림 2. DLM의 recellularization의 도식 표현.

그림 3. recellularized 간 이식의 체외 문화에 대한 재관류 시스템 설정.

그림 4. microvascular 구조는 decellularized 간 매트릭스에 유지됩니다. A) 정상 간 B) decellularized 간, 포털 (적색)과 정맥 (파란색) vasculature의 부식 캐스트 이미지. DLM C의 전자 현미경 이미지) 선박, D) 담즙 덕트와 같은 소형 선박 (화살표), 스케일 바 (A, B) 5mm (C, D) 20 μm의를 특징으로 섹션을 검사합니다.

그림 5. 체외 재관류 문화에있는 동안 recellularized 간 이식의 간 특정 기능을 수행합니다. A) 알부민 분비 (P = 0.5249가), B) 우레아 생산 (P = 0.5271가)와 C) 총 담즙산의 분비 (P = 0.0114가). 실험과 통제 사이의 차이의 통계 분석은 = 0.01에서 프리드먼의 시험에 의해 10 D 문화에 걸쳐 이루어졌다. 오차 막대는 SEM (N = 3)을 나타냅니다.

	신선한 livera	Decellularized 간 매트릭스	P - 값	신선한 간 비율 (%)
	N = 4	N = 8
콜라겐	0.07 ± 0.01	0.08 ± 0.03	0.56	1백14퍼센트
(g 간 당 MG)
Glycosaminoglycans	73.1 ± 6.7	34.2 ± 2.9	0.004	47%
(g 간 당 MG)
DNA	14.9 ± 5.6	0.44 ± 0.08	3.3 10 -5	2.9 %
(g 간 당 MG)

표 1. decellularized 간 매트릭스의 생화 학적 조성은 원래 간 비교.
값은 ± SEM 의미로 표시됩니다

토론

여기에 설명된 재관류의 decellularization 방법은 동일한 총 구조와 기본 간 혈관 마이크로 아키텍처를 가지고 전체 간을 발판을 생산하고 있습니다. 발판은 원래 간장과 비슷한 세포외 기질 구성을하고 있습니다. recellularization 방법은 높은 효율성과 세포에서 세포 검사 체외 문화 시대의 동안 가능한 및 기능 유지와 비계의 repopulation을 구현합니다. recellularized 간 이식에 nonparenchymal 세포의 추?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L4390
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	EW-07523-80
Masterflex L/S Standard pump head	Cole-Parmer	EW- 07013-81
Bubble trap	Radnoti Glass Technology Inc.	130149