대한 인간 루시페라제 태그가 추가된 악성 주변 신경 쉬스 종양 세포 Orthotopic Xenografting 생체내에 테스트

요약

안정 immunodeficient 생쥐의 좌골 신경에 루시페라제 - 태그 인간의 악성 말초 신경 칼집 종양 세포를 접목하는 방법이 설명되어 있습니다. 스터디 그룹에 동물 임의의 분리를위한 종양 이식과 기준의 적절한 설립을 증명하기 위해 bioluminescence 이미징의 사용도 설명합니다.

초록

체외 화면에서 후보 치료 요원의 초기 식별, 종양 성장이 적합한 동물 모델에서 수행되어야합니다 억제하는 약물의 능력의 엄격한 심사를위한 필수 있지만. 이러한 목적에 가장 적합합니다 동물 모델의 유형은 강렬한 토론의 주제입니다. 어떤 증거는 유전자 변형 생쥐에서 발생하는 종양에 대한 약물 효과를 검토 잠복기 재판은 임상 결과 ^{1 개} 중 더 예측하고 있으므로 치료 후보 대리인이 자주 이러한 모델 테스트는 것을 나타냅니다. 불행히도, 유전자 변형 모델은 다양한 종양 유형에 사용할 수 없습니다. 또한, 유전자 변형 모델은 종종 등은 인간의 대응, 종양 표현형 및 무능력의 불완전 penetrance은 종양이 개발 시기를 예측하는 방법을 잘 마우스 종양 모델에 같은 문제와 같은 다른 제한이 있습니다.

적절한 형질 종양 모델을 사용할 수없는 경우에는 그 결과, 많은 조사는 잠복기 실험에 대한 이종 이식 모델을 (인간의 종양 세포가 immunodeficient 생쥐에 이식할)을 사용합니다. 유전자 변형 모델을 사용할 경우에도 후자는 치료 범위의 빠른 결정을 촉진로서, 그들은 종종 이종 이식 모델와 제휴하고 있습니다. 또한,이 제휴는 유전자 변형 종양과 진정한 인간의 종양 세포에있는 에이전트의 효율성을 비교하실 수 있습니다. 역사적으로, 자주 (이소성 xenografts) subcutaneously 종양 세포를 주사에 의해 수행되었습니다 xenografting. 이 기술은 신속하고 상대적으로 저렴한, 재현할 수 있으며, 치료 ^기간이 중 종양 성장을 지속 quantitation 수 있습니다. 그러나, 피하 공간 이소성 xenografting로 얻은 가장 neoplasms 그리고 결과에 대한 일반 microenvironment하지 않습니다 인해 같은 호스트 조직 및 종양 유전자의 기관이 특정 표현의 부재로 요인에 오해하실 수 있습니다. 그것은 따라서 강력하게 이소성 이식 연구가 인간의 종양 세포가 원래 조직 (orthotopic xenografting) ² 융합하는 연구로 대체하거나 보완하는 것이 좋습니다되었습니다. 불행히도,이 권고의 구현은 종종 orthotopic xenografting 방법론이 아직 많은 종양 유형에 대한 개발되지 않은 사실에 의해 저지됩니다.

악성 말초 신경 쉬스 종양 (MPNSTs)는 neurofibromatosis 타입 1 ^3과 가장 일반적으로 좌골 신경 ⁴ 발생과 산발적으로 또는 조합에서 발생하는 매우 공격적인 sarcomas 있습니다. 여기 반딧불 루시페라제 - 태그 MPNST 인간 세포가 orthopically immunodeficient 생쥐의 좌골 신경에 xenografted되는 기술 직접적인 방법을 설명합니다. 개별 동물과 스터디 그룹에 후속이 아닌 편견 임의화에 접목 절차의 성공을 평가하는 우리의 방식도 설명되어 있습니다.

프로토콜

1. 비 누드 Immunodeficient 마우스 (누드 레인스 필요하지)의 초기 준비 :

1. 모든 절차는 검토와 승인을 사전에 UAB 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 정상적으로 훈련 요원에 의해 실시되었다. 우리는이 실험 immunodeficient 생쥐의 세 변종을 성공적으로 사용했습니다 :) 폭스 체이스는 SCID 마우스를 outbred (CB17/lcr- Prkdc ^scid / lcrCrl 마우스); B) NIH III 생쥐 (NIHS - Lyst ^BG Foxn1 ^뉴 Brk ^{xid 마우스)} 및 C ) NOD - SCIDγ 생쥐 (NOD.Cg - Prkdc ^scid Il2rg ^tm1Wjl / SzJ 마우스). 우리 손에, orthotopic xenografts의 성장은 T 세포, B 세포와 NK 세포의 기능에 영향을 미치는 변이를 가지고 모두있는 NIH III와 NOD - SCIDγ 마우스에서 거의 동일합니다,이 프로토콜에 대한, 일수는 이식에 필요한 성장, 치료가 시작 및 이미징이 수행될 때 시간이 사후 접목하는 시점에 우리가 경험적으로 NOD - SCIDγ 마우스를 사용하여 결정이있는 수 있습니다. 폭스 체이스의 이식 성장이 T - 및 B - 세포 기능에 결함을 가지고 SCID 마우스를 outbred, 일반적으로 오래 걸립니다.
2. 비 - 누드 immunodeficient 생쥐 다수의 접목 촉진하기 위해, 우리는 이전에 접목하기 위해 오후에 수술 사이트에서 머리카락을 제거합니다. 생쥐는 폐기물 가스에 대한 청소와 기화기에 부착된 isoflurane 유도 챔버를 사용하여 anesthetized 있습니다. 체온을 유지하기 위해서, 동물이 과정을 통해 난방 패드에 처리됩니다. 클리퍼스는 중반에 다시 다운 이식할 수있는 측면에 뒷다리 다리의 무릎부터 머리를 제거하는 데 사용됩니다. 남은 머리를 신중하게 화학 depilatory 에이전트 (예 : 나이르, 민감한 피부에 알로에 베라와 함께 특정 제품)를 사용 ~ 5 분 안에 사이트에서 제거됩니다. 그것은 피부, 눈, 그리고 확산 수도 다른 신체 표면의 염증을 일으킬 수로 depilatory 제품의 제거를 권장합니다. 우리는 스터디 그룹에서 마우스의 손실 발생이 이러한 실험 모두에서 좌골 신경이 양자 hindleg 기능을 손상 수도 이식하지 않습니다.
3. 마우스 완전히 침구 않고 고립 새장 속의 손난로에서 복구하는 허용하는, 이것이 생쥐가 다른, 더욱 완벽하게 경고 동물에 의해 부상을하지 않는 확인하고 실수로 침구를 흡입에서 그들을 방지합니다 모두. 마우스가 완전히 이동하고 비틀 거림에 대한 증거를 보여주지 때, 그들은 다른 생쥐와 케이지로 reintroduced 수 있습니다.

2. 이식 당일 주사 MPNST 세포의 준비

1. 우리가 경험적으로 ST88 - 14 세포, NF1 - 관련 종양 ⁵ 파생된 일반적으로 사용되는 MPNST 라인 결정이있는 아르 포스트 접목이 프로토콜에는 세포의 특정 숫자 이식할과 시간이 종양 성장을 위해 필요합니다. 우리가 접목에 사용하는 세포들이 안정 bioluminescence 이미징 ⁶ 확인된 반딧불 루시페라제을 표현 CMV - 루시페라제 - IRES - puromycin 카세트와 클론을 포함하는 lentiviral 벡터와 transduced되었습니다. 우리는 또한 안정적으로 CMV 즉각적인 초기 발기인의 통제하에 반딧불 루시페라제을 표현 plasmids와 transfected MPNST 세포와 실험을 접목 수행했습니다. 우리가이 플라스미드 벡터 표현의 다음은 접목의 멸종를 받아야하는 경향이있다는 사실을 발견 것처럼 우리는 이것을하지 않는 것이 좋습니다.
2. ST88 - 14 전지 10% 소태아 혈청, 10 μg / ML 스트렙토 마이신 및 10 IU / ML 페니실린 (DMEM10)와 보충 Dulbecco의 최소한의 필수적인 매체 재배, 5 μg / ML puromycin도 lentiviral 벡터에 대한 선택을 유지하기 위해 포함됩니다. 우리는 50 구절 우리의 실험실에서이 세포를 유지하고이 구절의에서 세포 성장에 변화를 관찰하지 않았습니다. 9 X 10 ⁵ ST88 - 14 세포는 술병이 약 80 % 합류하는 지점에서, T175 플라스크에 도금 3 일간 재배하고 있습니다. 이식 35 마우스를 하나 80% 합류 T175 술병이 필요합니다,이 밀도에서, ST88 - 14 세포에 대한 우리의 평균 수확량은 T175 플라스크 당 7.3 X 10 ⁶ 세포이다. 이것은 세포 이식을위한 수확하기 전에 합류하기 위해 성장하는 것을 허용하지 않을 것이 매우 중요합니다. 우리는 이식 세포 이식 실패의 높은 수준에 합류 flasks 결과에서 수확 종종 이식 성장의 생체내 과정을 연장 것으로 나타났습니다.
3. ST88 - 14 세포는 방 온도 행크스 '균형 소금 솔루션으로 한번 씻어서 있습니다. 전지는 상온에서 30 초 1 분 셀 스트리퍼 세포 분리 솔루션을 사용하여 플라스크에서 제거됩니다. DMEM10 다섯 밀리리터 (참고 : puromycin이 매체에 포함되지 않습니다) 다음 셀을 추가하는 데 사용 전지 스트리퍼의 각 밀리리터 당.
4. 세포는 hemocytometer를 사용하여 계산됩니다. 3 μL의 정지 5 X 10 ³ ST88 - 14 세포는 마우스를 따라 주입됩니다. pipetting에 대한 수당과 그라 프트 전체 코호트를 충분한 세포의 양오류 (예 : 35, 생쥐에 대한, 우리는 일반적으로 이식 40 마우스에 충분한 세포의 숫자를 전송), 멸균 1.5 ML 튜브로 전송됩니다. 세포는 5 분 동안 3,000 rpm으로 centrifuged 있습니다. 뜨는 신중하게 제거하고 세포 펠렛은 DMEM10에 resuspended (참고 : puromycin이 매체에 포함되지 않습니다)입니다 3 μL 당 5 X 10 ³ 세포의 최종 농도. 얼음 세포 보관하십시오.

3. 프로토콜을 접목

1. 그들은 더 이상 발가락 핀치 자극하기 위해 hindlimb을 철회하지 않을 때까지 마우스는 isoflurane 기화기의 유도 챔버에 anesthetized 있습니다. 생쥐들은 측면에 위치하고 0.05 MG / buprenorphine의 하이드로의 kg과 subcutaneously 주입하고 있습니다. 마취는 다음 코 콘을 통해 전달 isoflurane의 지속적인 관리를 통해 유지됩니다. euthanized 생쥐가 동영상에 대해이 절차를 증명하는 데 사용된 점에 유의하십시오, 따라서 isoflurane 전달하기 위해 사용되는 isoflurane 튜브는 비디오에 표시되지 않습니다.
2. 체온을 유지하기 위해 동물 접목 과정 전반에 걸쳐 가열 패드에 처리됩니다. 각막 건조, 안과 연고의 작은 방울을 방지하기 위해 (Puralube 수의학 연고) 각 눈에 관리합니다. 그것이 유일하게 재판을 통해 식별 각 마우스가 필요하므로, 고유 식별자 번호를 귀에 태그는 각 마우스의 오른쪽 귀에 잘립니다.
3. 뒷다리를 확산 위에 플레이스 동물. 발생을 접목 수술 창 (측면)를 노출, 살균 드레이프와 마우스를 커버. 무균 드레이프는 머리의 시각화를 허용해야 모두 코가 원추 아직 안에 있는지 확인하고 호흡과 동물의 색상의 모니터링을 허용합니다. 목화는 측면의 중앙에 시작 점차 수술 창의 가장자리에 바깥쪽으로 나선형, 작은 주걱을 밀고있는 외과 사이트에 betadine을 적용합니다. 70 % 에탄올을 같은 방식으로 수술 사이트에 적용됩니다. 에탄올 다음 betadine의 연속 응용 프로그램을 두 번 더 반복하고 있습니다.
4. 얼음도 부드럽게 소용돌이에서 세포를 제거하거나 정착 세포를 resuspend하기 위해 튜브를 버려. 피펫을 사용하여 세포 현탁액의 3.2 μL를 제거하고 Parafilm 한 조각에 그것을 꺼내. 더 필요 이상을 제거하고 Parafilm에 정지를 배치함으로써, 우리는 현탁액에 거품이 없다는 것을 확인하고 우리가 주사를위한 전체 3 μL를 가지고 있습니다. 33 게이지 바늘이 장착된 10 μL 해밀턴 주사기로 많은 세포 현탁액의 가능성을 당기세요. 플릭 주사기의 거품과 정확히 3 μL에 과잉 세포 현탁액을 추방. 바늘은 멸균 상태를 유지하기 위해 얼음 양동이와 접촉을 허용하지 않는, 사용할 때까지 얼음 세포와 세포 함유 주사기 들고. 사란 랩의 조각이 직접 얼음에 연락에서 주사기로 얼음 위에 설치할 수 있습니다.
5. 번호 22 메스 블레이드을 갖춘 제 4 메스 핸들을 사용하여, 아래와 병렬 대퇴골에 측면의 피부를 통해 절개를, 절개는 수술 청소 분야의 한계 넘어 연장 있지 않은지 확인하십시오. 기본 근육을 폭로하기 위해 수동으로 수술 클램프 또는 피부 절개를 엽니다. fascial 비행기는 다리의 길이를 따라 실행 볼 수 있으며, 좌골 신경이 아래와 근막에 의해 연결된 두 개의 근육 사이에 자리잡고 있습니다. 날카로운 날붙이 가위를 사용 무딘은 두꺼운 스레드의 두께에 대한 흰색 선형 구조로 뚜렷한되어야 좌골 신경을 노출이 근막을 통해 해부하다.
6. 날카로운 날붙이 곡선 포셉 한 켤레를 사용하여 조심스럽게 기본 근육에서 느슨해진, 신경에 따라 절개하다, 이것은 이르게하고 신경을 분리 모두. 이 순위를 유지하는 데 신경 아래 포셉를 남겨주세요. 조심스럽게 바늘이 신경의 아래쪽으로 주사하지 않도록 최대한 신경와 병렬로 주입의 각도를 유지하기 위해 노력하고, 신경에 해밀턴 주사기의 바늘을 삽입합니다. 주사 바늘로 말초 신경의 끝 부분으로 삽입되어야 척추 - 우리가 척수쪽으로 신경에 종양 세포의 주입은 척수에 가까이 가까이에 이식할 종양 세포를 수립 것으로 나타났습니다. 이러한 경우가 발생하면 종양 세포는 종종 척수 기능의 손상으로 인해 연구 그룹에서 동물의 조기 손실 발생, 척수를 침략.
7. 바늘이 제대로 신경 위치되면, 포셉에 의해 신경에서 생산되는 긴장을 완화하고 천천히 45~60초 통해 신경에 주사기에서 세포를 주입. 그것은 빠르게 주사기 내용의 퇴학은 사출 사이트와 그 손실 주변 종양 세포의 "백업 씻어"에 결과하므로 이것이 천천히 수행하는 것이 중요합니다. 모든 세포가 성공적으로 주입되고 나면, 천천히 주입 재료의 손실을 최소화하기 위해 바늘을 철회.
8. 에 대한 제거를CEPS 조심스럽게 근육 아래에 원래 위치로 다시 신경을 놓으십시오. Vetbond 수술 접착제로 수술 절개를 닫습니다. 접착제가 건조 수 있도록 약 20 초 동안 포셉 함께 절개를 잡아.
9. 마우스는 코 콘 isoflurane에서 제거 및 복구 침대 무료 케이지에 혼자 배치됩니다. 동물이 완전히 회복되기 전까지이 새장은 가열 패드의 상단에 보관해야합니다. 복구 케이지의 일부가 가열 패드를해서는 안됩니다, 이것은 그들이 너무 따뜻하게면 동물이 열을 멀리 이동할 수 있습니다. 접목 후, 동물은 사이트 lameness이나 거식증에 씹는에 대해 정기적으로 평가해야한다 이러한 징후 동물이 고통을 아직하고 적절한 진통제를 부여해야합니다 나타낼 수 있습니다. 이 절차와 경험을 확보 후, 우리는 30-40 쥐가 쉽게 하루에 이식할 수있는 것으로 나타났습니다.

4. 스터디 그룹으로 이식 성공과 임의화 평가

1. Bioluminescence 이미징은 접목 절차의 성공을 평가하는 데 사용됩니다. 우리는 기판, D - Luciferin과 루시페라제의 화학 반응의 결과로 생산 종양 - 표현 반딧불 루시페라제에서 발광을 감지하는 IVIS - 100 시스템 (원래는 지금 캘리퍼스 주식 회사로 알려져 있습니다 Xenogen에서)를 사용 . 이러한 이미지의 분석은 특정 이식할 생쥐는 치료 재판 동료로 입국에 적합한지 여부를 결정합니다. 예비 실험에서, 우리는 제조 업체의 생활 이미지 소프트웨어를 사용하여 이익 분석의 지역에서 bioluminescence 신호 그들의 종양과 상관 종양 중량을 수확 bioluminescence의 감지 신호 희생 이식할 마우스를 계량있다. 이러한 연구는 종양 그래프트 무게와 bioluminescence 라이트 방출 사이에 선형 상관 관계 그 bioluminescence 이미징은 잠복기 시련의 과정을 통해 이종 이식 성장을 평가의 적절한 대리 의미합니다 나타내는있다는 것을 보여주었다. 동시에 일반적으로 우리는 이미지를 쥐를 5. bioluminescence 이미징에 대한 자세한 내용은 이전에 ^7을 발표했다.
2. 그래프트의 성공을 평가하기 위해, bioluminescence 이미징은 1을 수행하고 3 일 이후의 접목. 이미지 2.5 MG D - Luciferin의 intraperitoneal 주사 후 같은 위치에서 10 분 지향 생쥐에서 수집됩니다. 이미징 동안 생쥐는 Xenogen의 영상기에있는 가열 패드에 의해 37 ° C에서 보관 isoflurane 마취와 체온에 따라 유지 관리됩니다. 이미지 수집 시간은 2 초가 10 분 범위에, 데이터 수집 소프트웨어는 픽셀이 이미지를 수집하는 동안 포화하지 처리됩니다. 종양 영역 (상대 광자 카운트 / 초)에서 발광이 Xenogen에서 독점 소프트웨어를 사용하여 측정됩니다. 발광 강도가 동시에 수집하는 생쥐의 흑백 사진에 overlayed있는 bioluminescence의 pseudocolor 스케일링으로 표시됩니다.
3. 잠복기 시범 코호트에 포함 자격, 마우스 모두 1 세 이후의 접목 일 bioluminescence 신호의 강도가 일 1 시부터 3시 사이에 증가해야 감지 bioluminescence 신호를해야합니다. 감소 또는 정적 신호가 동물은 제외됩니다. 또한, 당일에 이식할 마우스의 감지 신호는 서로의 진도 1 순서 이내에해야합니다, 낮은 또는 당일에 이식할 동물 발견 그 이상 크기의 하나 주문 아르 bioluminescence 신호와 마우스도 제외됩니다.
4. 일단 생쥐가 이러한 기준을 충족, 그들은 치료 그룹으로 무작위되어야 확인되었습니다. 이것을 달성하기 위해, 이식할 생쥐에서 검색된 루시페라제 신호는 이후 접목 삼일 먼저 최고부터 최저 농도로 정렬됩니다. 마우스 그럼, 치료 그룹에 강도의 순서를 지정이 순서를 반대하고 모든 마우스가 그룹에 할당된 때까지 과정을 반복하여 그룹으로 무작위입니다. 예를 들어, 4 치료 그룹 (예 : 위약 및 테스트 약물의 세 농도) 마우스가있는 경우는 순서대로 1, 2, 3, 4, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3 그룹에 할당됩니다 , 4, 4, 3, 2, 1 .. 등 치료를 시작하기 전에 할당된 그룹의 각 구성원에서 검색된 bioluminescence 신호는 모든 그룹 내의 평균 시작 신호가 최대한 가까이 있는지 확인하기 위해 평균입니다. 후보 치료 에이전트 관리는 3 일에 시작됩니다.
5. 치료 요원이 치료의 과정 중에 이식 성장에있는 효과를 평가하기 위해, bioluminescence 이미징은 처음 치료 후 주 (일 10, 17, 24, 30 이후 접목) 한 번 수행됩니다. 비 - 누드 immunodeficient 마우스 위해서, 동물이 다시 각 영상 세션을 수행하기 전에 나이르로 제거 새로운 모피 성장을 가지고 매우 중요합니다. 이 때문에 손실 얼마나 많은 신호의 결정 외투 색깔과 머리카락이 블록 발광 생물 신호를. 예를 들어, 같은 흰색 털은 스위스 W에서 찾을 수 있습니다검은 모피만큼 10 배 ^9과 같은 신호를 줄일 수있는 반면 ebster 마우스는 발광 생물 신호 강도 ⁸ 18 %의 감소를 생산하고 있습니다. 우리는 또한 그것이 균일한 모피 regrowth 모든 치료 그룹과 치료 그룹 사이에 '정상화'신호 감소가 발생할 것으로 추정 수 없습니다 것입니다. 치료 요원 자체는 머리카락의 성장에 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 예를 들어, 우리는 tamoxifen의 치료가 위약 - 대우 마우스에 비해함으로써 종양의 성장이 요원의 인식 효과를 최소화, 헤어 regrowth을 억제 있다고 언급했습니다.
6. ST88 - 14 MPNST 세포와 생쥐 30 일 이후의 접목을 위해 진행하실 수 있습니다. 이 시점에서, 종양은 일반적으로 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 허용된 최대한의 크기로 성장과 번영해야합니다. 최종 이미지 세션 다음, 마우스는 치료 결과에 대한 분석 (예를 들어, 치료 대리인, 체중 결정에 대한 종양 조직, 조직학의 검사, Ki67의 결정 및 TUNEL 라벨 지수의 순환 수준 결정을위한 혈액 및 살해하고 표본이 필요합니다 생화 학적 매개 변수의 평가)이 수집. 정확히 표본을 수집하는 것은 실험 설계의 요구에 따라 달라집니다.
7. 그들은 (부족 정상적인 정리 및 회피 행동) 질병이 될 경우에는 악성 종양으로 마우스가 매일 모니터링하고 종료해야합니다, 먹지도 마시지도없는, 또는 종양이 지나치게 큰되는 것처럼 일반적인 신체의 움직임을 방해합니다. 종양 부담은 동물의 정상적인 몸무게의 10 %를 초과하는 것을 허용하지 않을 것입니다. 체중의 비율로 종양 무게는 연령 / 성별 일치하는 제어 동물의 무게에 종양 베어링 동물의 무게를 비교하여 계산됩니다. Cachexia는 임상 크게 될 것을 허용하지 않을 것입니다. 종양 베어링 동물의 체중 감소는 정상 몸무게의 20 %를 초과해서는 안됩니다.

5. 대표 결과 :

그림 1은 bioluminescence의 전형적인 진보 증가 관찰 보여줍니다 1-18일 포스트 접목 누드 (NIH III) 마우스 (AC)에 제대로 설립 orthotopic 이종 이식 인치 bioluminescence 신호의 양을 정함은 1-24일 이러한 신호가 점차 증가하지만, 종양이 성장이 현저하게 연구 기간 (그림 1D)의 나중 단계에서 가속, 쇼, 접목 후 관찰했다. 엄격하게 그 종양 성장 이식할 생쥐에서 오류가 발생하였습니다 입증하기 위해, 우리는 정기적으로 그것이 종양이 epineurium을 터뜨렸다는 부드러운 조직과 골격근을 둘러싼, 인접 조직을 침범이 나타나는 경우, 좌골 신경을 수집합니다. MPNSTs의 적극적인 성장을 감안할 때, 우리가 종종 이식할 종양 세포는 신경의 정상적인 장벽을 돌파하고 (그림 1E) 인접 조직을 침범이 발견 것은 놀라운 일이 아니다. 우리는 또한 종종 이식할 MPNST 세포가 근위 및 그래프트 사이트에 말초 신경에 적극적으로 마이 그 레이션 찾습니다.

그림 1. NIH III 마우스 Bioluminescence 이미징은 orthotopically 일일 후 접목 루시페라제 - 태그 MPNST 전지 이식할 (A). 다른 마우스에 대한 관심의 영역 (ROI) 이내에 감지 신호가 서로 크기​​ 중 하나를 순서 내의 모든됩니다. Reimaging 십일 (B) 18 일 (C) 발광 생물 신호가 점차 개별 생쥐에 이식 현장에서 증가 쇼 포스트 접목. (D) 그래프 1~24일 게시 - 접목 그래프트 사이트를 통해 감지 상대 카운트 광자 / 초의 진보 증가를 설명. (E)이 마우스에서 그래프트 사이트의 현미경 사진은 인접 골격근으로 종양의 성장과 초점 침략을 보여주는.

토론

여기에 제시 자세한 orthotopic xenografting 방법은 우리가 널리 이러한 NF1 - 관련 주변 신경 칼집의 종양 연구에 사용되는 라인을 ST88 - 14 MPNST 전지를 사용하여 개발된 것이 하나이다. 그러나,이 방법은 다른 MPNST 셀 라인 잠복기 연구 쉽게 적응할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 우리가 ST88과 관찰과 비슷한 성공, STS - 26T ¹⁰ 세포, NF1 - 관련 MPNST에서 파생됩니다 산발적으로 발생 MPNST 및 T265 - 2C ¹¹ 세포에서 파생된 라인 xenografting orthotopic 수행한 -14 세포.

, 우리가 ST88 - 14 세포 xenografting orthotopic 여기 설명하는 정확한 조건이 직접 다른 MPNST 라인의 접목을 위해 채택 수 없습니다 갖는 것이라고 말했다. 대신, 방법론의 핵심 매개 변수는 경험적으로 각 세포주에 대한 결정되어야합니다. 이러한 매개 변수가 처음 이식할 MPNST 세포의 수, 낮은 정도 이식 개발과, 허용 시간을 포함, 볼륨이있는 종양 세포가 주입됩니다. 새로운 라인에 대한 이러한 매개 변수를 설정하기 위해, 우리 ^10월 3일부터 5일까지 X 10 ⁶ 종양 세포와 생쥐 (그룹 당 5 생쥐)의 그라 프트 그룹, 진도의 각 순서 (즉, 10 ³ 셀, 5 x는 세포의 두 농도를 확인 10 ³ 셀, 10 ⁴ 셀, 5 X 10 ⁴ 세포 등). 종양 세포 (> 10 ^6)의 큰 숫자는 더 큰 볼륨에서 주입되어야하며 우리는 최대 5 ML에이 이식할 신경 세포의 손실없이 주입 수있는 것으로 나타났습니다. 우리는 또한 고밀도 suspensions이 종양 세포를 죽이는 전단하는 경향이 점점 증가함에 따라 5 ML 볼륨 당 더 이상 5 개의 X 10 ⁶ 종양 세포 주입 수있는 것으로 나타났습니다. 각 그룹 내에서 적어도 세 동물은 우리가 그 그룹을 종료하고 그래프트 성장을 확인하는 histologically 신경을 검토하는 시점에서 만져서 알 수있는 종양을 때까지 우리는이 생쥐를 따르십시오. 일반적으로, 우리는 30~60일 이내에 최대한 허용 종양의 성장에 도달할 것입니다 세포의 농도를 찾고 있습니다, 물론, 시간이이 시점은 주입된 세포의 수에 따라 달라집니다 도달할 필요합니다. 더 빠른 성장은 어려운 실험 및 / 종료하기 전에 효과적인 치료 농도를 달성하거나 실험 과정을 통해 충분한 bioluminescence 이미징 datapoints의 수집을 방지하기 위해 만들 수 있습니다. 시간 코스 이상 육십일보다 실험적인 매개 변수는 다루기 힘든 조정하게 그리고 불필요하게 계획된 실험 기간을 연장.

마지막으로, 우리는 우리가 tamoxifen ⁶ 치료 효과를 입증하기 위해 NIH III 마우스로 이식할 ST88 - 14 세포이 orthotopic xenografting 방법론을 사용한 점에 유의합니다. 우리가 일상적으로 orthotopic xenografts에 후보 치료 대리인의 효과를 평가하는 데 사용하는 방법에 대한 자세한 설명은 그 논문에서 찾을 수 있습니다. 또한 neurofibroma 세포가 성공적으로 수정,이 프로토콜에 제시된 절차 neurofibromas에 대한 감독 후보 치료 요원들과 잠복기 실험을 수행하는 데 사용할 수있는, 그 제안, 말초 신경 ^12에 이식할 수있다는 증명되었습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Foxchase outbred SCID mice	Charles River Laboratories	#236
NIH III mice	Taconic	#NIHBNX
NOD-SCIDγ mice	Jackson Laboratory	#005557
Cell Stripper	Fisher Scientific	25-056-cl
Vetbond surgical glue	3M	1469SB
Hamilton syringe	Hamilton Co	#80030	10 μL volume
Hamilton syringe needles	Hamilton Co	#7803-05	33 Ga., 0.5 inch, PT4 (custom made)
Ear tags	National Band and Ear Tag Co.	1005-1
Ophthalmic ointment	Dechra	NDC 17033-211-38