세포 성숙없이 돌기 세포의 효율적인 Transfection을 위해 최적화된 프로토콜

요약

우리는 세포 성숙을 유발하지 않고 플라스미드 DNA 나 siRNA 중과 기본 인간 단핵구 파생 돌기 세포를 transfecting의 효율적인 방법으로서 최적화된 높은 처리량 nucleofection 프로토콜을 제시한다. 우리는 더 타겟 유전자 mRNA와 단백질 수준 모두에서 릭 - 전의 성공적인 siRNA의 입을 대한 증거를 제공합니다.

초록

돌기 세포 (DCS)은 자사의 개시 및 감염 ¹ 반응에서 중요한 역할을 면역 시스템의 센티넬 간주될 수 있습니다. 나이브 DC가에 의해 병원성 항원의 검색은 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPS)로 불리는 특정 보존 구조를 인식할 수있는 패턴 인식 수용체 (PRRs)를 통해이다. DC가로 PAMPs가 탐지 성숙 DC가 자신의 활성화 및 변화의 결과로 세포내 신호 폭포를 트리거합니다. 이 과정은 일반적으로 다른 전염증성 크린 시토킨와 함께 제 1 형 인터페론의 생산이 특징입니다, 이러한 T 세포와 상호 작용이 적응 면역 반응 ^2을 시작 배수 림프절에 성숙한 DC의 MHCII와 CD86 및 마이 그 레이션과 같은 세포 표면 마커의 ^{upregulation, 3.} 따라서 DC가 그 본래 및 적응 면역 시스템을 연결합니다.

각종 병원균에 DC 응답을 기본 분자 네트워크를 해부하다하는 능력은 이러한 신호 경로의 규제 및 유도 유전자를보다 잘 이해하는 데있어 매우 중요합니다. 또한 전염병 및 종양에 대한 DC - 기반 백신의 개발을 용이하게 도움이 될 것입니다. 그러나, 연구의이 라인은 심각하게 기본 DC가 ⁴ transfecting의 어려움으로 장애가되었습니다.

같은 lentiviral 시스템으로 바이러스 전달 방식은, 일반적으로 사용하지만, 이러한 복잡 성과 바이오 유해 위험 (관련 비용) ^5,6,7,8 많은 한계를 가지고있다. 또한, 바이러스성 유전자 제품의 배달 DC가 ^{9,10,11,12을} transduced 사람의 immunogenicity을 증가시킵니다. Electroporation은 혼합 결과 ^13,14,15와 함께 사용하지만, 우리는 높은 처리량 transfection 프로토콜의 사용을보고하고 결론의 유틸리티를 입증하는 최초되었습니다.

이 보고서에서 우리는 제한된 세포 독성 및 DC 성숙 ¹⁶ 부재와 함께, 인간의 기본 DC가의 높은 처리량 transfection을 위해 최적화된 상용 프로토콜을 요약합니다. Transfection 효율 (GFP 플라스미드의)와 세포 생존 능력은 각각 50 % 이상 70 % 였어요. qRT - PCR은 IFNβ 전혀 upregulation을 증명하지 동안 외과 분석, transfected 세포의 성숙 마커 CD86와 MHCII 표현 증가의 부재를 설립하였습니다. 이 electroporation 프로토콜을 사용하여, 우리는 siRNA와 효과적인 타겟 유전자의 허물고와 DC가 성공적으로 transfection에 대한 증거를 제공하는 장비 - I, mRNA와 단백질 수준 모두에서 핵심적인 바이러스성 인식 수용체 ^16,17.

프로토콜

1. 프로그램 Amaxa 96 잘 셔틀 Nucleofector

1. 새 매개 변수 파일을 엽니다.
2. 당신이 96 잘 플레이트 그림 위에 커서를 드래그하여 표준 transfection에 사용됩니다 웰스의 번호를 선택합니다. 각 실험 샘플에 대해 수영장 3 웰스의 최소 사용합니다.
3. 입력 프로그램 코드 : part1 선택 'FF'와 파트에서 선택한 '168 '메뉴를 풀다운에서
4. 솔루션 박스 선택 '단핵구, 인간'에서
5. 제어 옵션에서 '표준'을 선택합니다.
6. 적용을 클릭합니다.
7. 노 transfection 컨트롤을 포함하려면 필요하고 제어 옵션에서 '없음 프로그램 제어'를 선택하지하고 적용을 클릭하면 다이어그램에서 더 이상 우물을 선택합니다.
8. 플레이트 다이어그램에 남아있는 사용하지 않는 우물을 선택하고 Undefine을 클릭합니다.

2. transfection에 대한 DC가 준비

1. 모든 작업은 가능한 세포 배양 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야합니다. 추가하여 nucleofection 솔루션을 준비 96 - 잘 450-2025의 비율에 인간 단핵구 96 잘 Nucleofector 솔루션을 보완. 믹스 룸 온도 따뜻한 수 있습니다. 당신은 당 잘 nucleofection 솔루션의 20μl가 필요합니다. 오류를 pipetting 수 있도록 10 %의 초과하십시오.
2. 당신은 행 1과 2에 첫 번째를 삽입 올바른 방향 IE에서는 nucleocuvette 판에 필요한 nucleocuvette 모듈의 개수를 놓습니다.
3. 실험을 위해 10 분 400g에 centrifuging에 의해 잘하고 펠렛 당 500,000 세포에 대한 계산에 필요한 DC가의 수를 결정합니다. 조심스럽게 뜨는을 제거합니다.
4. 부드럽게 몇 번 아래 pipetting과로 nucleofection 솔루션에있는 세포를 Resuspend.
5. 특정 치료 예 글로 하는걸 - I에 대한 분류 eppendorfs로 resuspended 세포의 올바른 볼륨을 나누십시오.
6. pipetting하여 세포와 혼합 500,000 당 0.25μg siRNA를 추가합니다. 당신의 노 transfection 컨트롤 샘플이 아닌 타겟 siRNA를 사용합니다.
7. 귀하의 실험 레이아웃에 따라 nucleocuvette 모듈로 위의 혼합물의 피펫 20μl는, 액체를 보장하는 것은 우물의 바닥에 배달됩니다.
8. 뚜껑과 nucleocuvette 판을 차지하고 있으며 공기 거품의 제거를 보장하기 어려운 표면 몇번에 번호판을 누릅니다.

3. Transfect DC가

1. Nucleofector 96 - 웰 셔틀 트레이에 접시를 넣고 업로드를 클릭한 다음 시작합니다.
2. 무릎 톱 디스플레이에 transfection 과정의 진행률을 따라, 빨간색 배경에 검은 막대가 실패했습니다 의미 반면 녹색 배경에 검은 십자가, 그 우물에 성공적으로 transfection을 의미합니다.
3. transfection 과정의 완료에 접시를 제거하고 잘 멀티채널 피펫을 사용하여 각 DC 성장 매체의 80μl를 추가합니다.
4. 37 10 분 번호판을 품어 ° C와 5% CO _2.
5. 올바른 방향을 유지, 미리 예열 DC 성장 매체의 100μl를 포함하는 행렬 튜브로 nucleocuvettes에서 100μl 볼륨을 전송합니다.
6. transfection이 발생하지 않았 이러한 튜브를 제거하고 폐기.
7. 37 품어 ° C와 5% 24 시간 또는 기타 원하는 시간 간격에 대한 CO _2.

4. NDV와 세포를 감염

1. eppendorfs에 각 실험 샘플에 대한 인큐베이터에서 세포 배양 후드와 수영장 튜브에 매트릭스 튜브를 제거
2. 펠렛 세포가 부드럽게 5 분 데스크 톱 원심 분리기의 회전에 의해하고하면 뜨는 제거합니다.
3. 뫄 1에 NDV를 포함하는 혈청없는 성장 매체에있는 세포를 Resuspend 37에서 품어 ° C와 느슨하게 살균 방식으로 덮여 eppendorfs와 5% 45 분에 대한 CO _2.
4. 80-10 H.위한 DC 성장 매체 900μl, 다시 품어 추가

5. 수확 세포

1. 데스크 톱 원심 분리기에 eppendorfs 잔을 돌리면서 뜨는 제거하여 세포 펠렛.
2. 귀하의 프로토콜에 따라 RNA 또는 단백질 추출을위한 수확 세포.

6. 대표 결과 :

우리 최적화된 프로토콜을 사용하는 우리와 DC가를 transfected RIGI 타겟팅 인터페론 반응 경로를 자극하는 NDV (릭 - I에 의해 감지 paramyxovirus)으로 세포를 감염 후 24 H에 대한 siRNA를합니다. qRT - PCR 분석에 의해 우리는 전사 수준에서 75 % 유전자의 다운 노크 보여주었다. 우리는 또한 IFN 신호 계단식 찾으 - I의 스트림 이펙터입니다 IFNβ의 표현에서 유사한 감소를 관찰했다. 또한, 우리는 MxA, IFNβ 하류 응답 유전자의 그 (그림 1A)을 최소화하는 동안 비 감염 제어 transfected 세포에서 IFNβ의 표현이 감지되지 않았음을 관찰했다.

와 DC가의 두 번째 transfection RIGI 타겟 siRNA 것은 서양 얼룩 분석을 포함하는 충분한 세포를 사용하여 수행되었습니다. 어디RT - PCR 결과와 유사했다 우리가 (62 % 및 66% 장비 - I와 IFNβ 표현은 각각의 허물고) 이전에 본 것은 (그림 1B), 서양 얼룩이 유전자의 표현이되어 있다고 발표 전 - 릭에 대한 탐지 완전히 (그림 1C) 차단.

그림 1. (A) MoDCs이 중 siRNA 타겟팅 transfected되었습니다 장비를 - I 또는 qRT - PCR에 의해 결정 릭 - I, IFNβ과 MxA의 표현에 특이 현상이 글로의 siRNA 및 효과. (-) transfection 프로토콜은 단핵구 특정 버퍼와 nucleoporation 프로그램 FF168 (Lonza 워커스빌 주) 24 H에 대해 다음과 부화를 사용, transfected 세포는 어느 NDV (+) 또는 왼쪽으로 감염되지 않은 감염되었습니다. 10 H에 대한 자세한 부화 후, 세포는 수확 및 RNA 추출 성적 수준은 두 복제 실험의 결과를 대표했다. 보울스 외 ^{16 일부터} 촬영. (B) 그림 1A에 사용되는 같은 다른 버피의 코트에서 얻은 MoDCs 다시와 transfected되었습니다 중 릭 - I - 타겟 siRNA 또는 위와 같은 transfection 프로토콜을 사용하여 특이 현상이 글로의 siRNA합니다. untransfected MoDCs를 사용하여 추가적인 제어 실험에 통합되었습니다. 모든 세포가 NDV 감염과 RNA 및 단백질 추출 모두 수확되기 전에 추가로 10 H에 대한 incubated 있었다 24 H 보육에 따라. 장비 - I, IFNβ 및 qRT - PCR에 의해 결정으로 MxA의 성적 수준은 두 복제 실험의 결과를 나타냅니다. 보울스 외 ^{16 일부터} 촬영. (C) 위의 그림 1B에 설명되어있는 세포에서 Lysates는 서양 얼룩에 의해 분석되었다. 레인스 1과 2는 untransfected 세포에서 lysates, 차선 3과 4는 글로의 siRNA transfected 세포에서 lysates, 차선 5 6 장비 - I - 타겟 siRNA와 transfected 세포에서 lysates. 샘플은 장비 - I에 대한 탐지 또한 GAPDH (로딩 제어 등)과 중복에서 실행 하였다. 보울스 외 ^{16 일부터} 촬영.

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토론

나이브 기본 돌기 세포의 transfection 효율이 높은 처리량 분석 및 본래 - 적응 면역 전환을 중재이 핵심 세포 세포 염증 경로의 리버스 엔지니어링을 위해 중요합니다. 그러나, 대부분의 조사는 이러한 세포가 표준 transfection 기술을 사용하는 경우 모두 효율적으로 transfection 절차 유도 세포 성숙하지 않고 transfect하기 어려운다는 것을 찾을 수 있습니다. 우리는 이러한 제한이 동시에 독립 96 - 웰 상?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
장비 / 시약	회사	카탈로그 #	댓글
Amaxa Nucleofector 96 - 웰 셔틀	Lonza	108S0109	일련 번호
Amaxa 인간 단핵구 96 - 웰 Nucleofector 키트	Lonza	VHPA - 2007	인간 단핵구 96 - 웰 Nucleofector 솔루션, 96 잘 보충하고 Nucleocuvettes과 접시를 포함
장비 - I siRNA	Dharmacon	L - 012511-00
글로의 siRNA	Dharmacon	D - 001600 - 01-20
RPMI 1640	Invitrogen	11,875	10% FCS와 보충이 MM L - 글루타민, 100 U / ML 페니실린 및 DC 성장 매체를 100 μg / ML 스트렙토 마이신
DMEM	Invitrogen	11,965
L - 글루타민	Invitrogen	25030081
페니실린 / 스트렙토 마이신	Invitrogen	15070063
소태아 혈청	HyClone	3070.03
돌기 세포	뉴욕 블러드 센터		DC가이 표준 절차를 사용하여 버피의 외투에서 정화 아르