Zebrafish의 Pronephros의 레이저 절제는 신장 상피 조직이 재생된를 공부

요약

인간의 급성 신장 상해 (아키)는 신장 nephrons을 구성하는 상피 세포 손상으로 인한 일반적인 임상 문제, 그리고 아키는 50~70% 1 높은 사망률 속도와 연결되어 있습니다. 이 현상을 안내하는 메커니즘과 한계가 제대로 이해 남아 있지만 상피 세포의 파괴에 따라 nephrons은 재생에 제한 기능이 있습니다. 이 비디오를 문서에서, 우리는 타겟 레이저 zebrafish 배아 신장의 신장 nephron 세포의 박리 또는 pronephros위한 기술을 설명합니다. 새로운 방법은 아키의 nephrotoxicity 유도된 모델을 보완하고 신장 nephron의 상피 조직이 재생된과 관련된 세포 및 분자 변경의 고해상도 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

급성 신장 상해 (아키)는 신장 장애 ¹ culminates 시간 또는 일 기간 동안 신장 기능의 저하에서 높은 사망률 가격이 특징입니다. 아키는 국소 빈혈, 마약 기반의 독성, 또는 폐쇄 상해 ^1을 포함한 여러 요인에 의해 발생할 수 있습니다. 유체 및 전해질 항상성을 유지하는 무능력이 발생합니다. 아키가 수십 년간 관찰되어 있지만, 효과적인 임상 치료법이 개발되지 못하고있다. Intriguingly, 아키와 함께 환자는 시간에만 rudimentally ^1,2의 특징이되어 버린 불가 사 의한 현상을 통해 신장 기능을 복구합니다. 아키의 포유 동물 모델을 사용하는 연구는 허혈성 또는 콩팥 세포 독소 - 부상 신장이 nephron tubules ^1,2, 상피 세포 유형 ³ 전문 영역의 시리즈 (세그먼트)로 구성되어있는 신장의 기능 단위로 상피 세포의 죽음을 경험하는 것으로 나타났습니다 . nephrons 내에 상피 세포의 죽음은 근위 가느다란 관 세포에서 최고입니다. 세포 파괴가 dedifferentiation, 증식, 그리고 완전히 ^1,2 nephron를 생성 할 수 상피 세포, 주변의 마이 그 레이션을 따라 제시 증거가있다. 그러나, 부상 신장을 재생하기 위해 인간 사이에 능력의 다양한 변화에 대한 이유로 이러한 이벤트를 변조 신호에 이르기까지 신장 상피 중생의 메커니즘에 대해 많은 의문이 있습니다.

애벌레의 zebrafish는 pronephric 신장이 ^4,5 포유류를 포함한 높은 척추 동물과 보존 아르 nephrons 구성되어 있습니다 같은 신장 상피 재생을 연구하는 좋은 모델을 제공합니다. zebrafish 애벌레의 nephrons 때문에 젊은 zebrafish ⁶ 상대적인 투명성의 형광 기법과 시각 수 있습니다. 신장이 동물 이내 internalized 구조적으로 복잡한 시스템이기 때문에 이것은 nephrons가 액세스할 포유 동물 모델에 대조적으로 이미지 세포와 실시간으로 분자 변화하는 독특한 기회를 제공합니다. 최근 연구 아키와 후속 신장 실패의 연구에 대한 독성 원인이되는 에이전트로 aminoglycoside의 gentamicin을 사용한 : gentamicin 및 기타 항생제는 인간 아키를 일으키는 것으로 표시되고 있고, 연구자들은 zebrafish ⁷ 신장 손상을 유도하는이 에이전트를 사용하는 방법을 공식화했습니다 ^8. 그러나, zebrafish 애벌레의 aminoglycoside의 독성의 영향이 재앙과 치명적인 있으며, 시간이 지남에 따라 상피 재생과 기능을 공부하면 어려움을 선물하는. 우리의 방법은 zebrafish에있는 상피 부상 연구를위한 새로운 도구로 타겟 세포 절제의 사용을 보여줍니다. 레이저 박리는 연구자들에게 세포의 제한된 인구의 세포 죽음을 유도하는 기능을 제공합니다. 세포의 다양한 영역은 형태학의 위치, 기능, 또는 특정 세포 표현형 표현에 따라 타겟팅할 수 있습니다. 따라서, 레이저 절제는 연구자가 연구 수의 특이성을 증가되며, 신장 상피 중생의 메커니즘에 대해 설명해 주실 수있는 강력하고 새로운 접근하실 수 있습니다. 이 프로토콜은 광범위하게 관심의 상황의 수가 부상과 재생을 연구하기 위해 zebrafish 배아에있는 다른 장기의 세포 인구를 대상으로 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. zebrafish 레이블을 Microinjection 절차는 근위 가느다란 관의 상피를 pronephros

이 절차를 위해, 우리는되는 공기 압축기 (준형 에어, 모델 6-4) 및 micromanipulator 장치 (Narishege 부품 MN151, IP3 및 GJI)가 제공하는 가압 공기와 microinjection 시스템 (하버드 Appartus, PLI90)를 사용 마다 제조 업체의 지시로 stereomicroscope 스테이션 (니콘, SMZ - 645 줌)에 조립. Dextran의 conjugates는 즉시이 상피 세포 인구 ⁹ 특혜 라벨을 지원, nephron 근위 가느다란 관에 의해 endocytosed 있습니다.

1. 메틸렌 블루에 노출 난황의 autofluorescence을 강조하고 nephron의 시각화가 더 어려워 tubules하게하실 수 있습니다.
2. 28.5에서 수정된 배아를 인상 ° C를 48~55시간 포스트 수정 (HPF) 사이에 발달 timepoint 수 있습니다. 이 때문에 근육 microinjection을 수행할 수있는의 용이성 애벌레의 microinjections을 수행하는 가장 이상적인 단계이며, 신장 기능이 시간에 개시 때문입니다.
3. 좋은 포셉 한 켤레를 사용하는 안깐 zebrafish에서 chorion를 제거합니다. 페트리 접시와 리필 수정 E3 솔루션의 30 MLS와 접시에서 chorion의 파편을 씻어.
4. 배아에 대한 주사 트레이를 준비합니다. 우리 선호 사출 금형은 삼각 우울증은 배아가 주사 안에 위치 수 등의 형성하는, 1.5 % agarose/E3 만들어진 것입니다. 사출 금형을 위해, 우리는 1.5 % 아가로 오스의 거점 가득 배양 접시에있는 쐐기 모양의 라고나할까요 (이전 ¹¹ 자세히 설명)과 플라스틱 금형을 떠.
5. Zebrafish 도서 ¹⁰ 설명한 바와 같이, 바늘 풀러와 모세관 튜브를 당겨 유리 microinjection의 바늘을 준비합니다. 간단히, 유리 모세관 튜브는 다음 stereomicroscope 아래 바늘 팁을 보면서 샵 포인트와 팁을 만들어 microinjection 바늘의 팁을 잘라 미세 금속 집게를 사용하여 가져옵니다. 배양 접시에 덮여 있고 컷 가장자리를 보호하고 먼지 축적을 방지하기 위해 모델링 점토에 위치 컷 바늘을 저장합니다.
6. 근위 가느다란 관 레이블을 위해 사출 솔루션을 준비합니다. 증류수 1 MG / ML의 농도 40 KD dextran - 플루오레신 공액 (Invitrogen, D1845)을 디졸브.
7. 물고기를 마취시키기 위해서, E3 30 MLS에 zebrafish 애벌레가 들어있는 배양 접시에 0.2 % Tricaine 산도 7.0의 5 MLS를 추가합니다. 그들이 더 이상 터치 응답을 전시 않을 때 물고기 anesthetized 있습니다. 이것은 물고기가 완전히 anesthetized거나 그들에게 주입하려고 시도시 트위치 것이 중요합니다.
8. 플라스틱 전송 pipet을 사용하여 사출 성형 트레이에 anesthetized 생선을 전송합니다. 음, 그리고 트렁크가 잘 직각의 측면을 따라 쉬고있는 그러한의 측면에있는 삼각형 우울증의 가장 깊은 부분의 머리와 동물을 놓습니다.
9. 근육내 microinjection을 수행합니다. dextran 플루오레신로부터 2-3 μL와 컷 바늘을로드하고, 솔루션의 약 1 NL과 트렁크의 체절에있는 동물을 주입. 체절의 위쪽 부분 목표, 그리고 난황 확장하지 마십시오. 이것은 nephron의 tubules가 기계 microinjection 과정에서 방해하지 않도록 보장합니다.
10. 깨끗한 페트리 접시에 주입 zebrafish를 전송하고, 수정된 E3 솔루션을 추가합니다. Tricaine의 모든 흔적을 제거하는 새로운 E3와 함께 동물에게 3 번 린스. dextran을위한 광 보호 기능을 제공하고, 야간 28 ° C 배양기에 동물을 반환 알루미늄 호일로 페트리 접시의 뚜껑을 커버.

2. 근위 가느다란 관 세포의 타겟 레이저 절제

이 절차를 위해, 우리는 dextran 플루오레신 밝고 표시된 근위 tubules과 동물을 점수와 레이저 절제를 위해 이들을 선택 epifluorescence있는 stereomicroscope를 사용합니다. 그렇다면, 우리는 복합 현미경 (epifluorescent 첨부 파일이있는 니콘 이클립스 80i)에 첨부하고, 당 제조 업체의 지침으로 사용하기위한 보정, nephron 전지 절제를 수행할 수있다 펄스 micropoint 레이저 시스템 (광자 인 스트 루먼트, 부동산)을 사용합니다. 우리는 브라이트 조명 아래 형광 가느다란 관 영역을 볼 수있는 연구자 수 FITC 필터를 사용하여 셀 절제에서 가장 성공을 있었다.

이 절차의 사전에서 0.02 % tricaine/E3의 1.5 % 메틸 셀룰로오스를 분해하여 절제에 대한 고정 미디어를 준비합니다. 상온에서 즉시 사용할 수 메틸 셀룰로오스의 저장 aliquots, 또는 4 ° C 장기 저장을 위해.

1. E3 30 MLS에 zebrafish 애벌레가 들어있는 배양 접시에 0.2 % Tricaine의 산도 7.0의 5 MLS를 추가하여 72 HPF의 zebrafish를 마취. 그들이 더 이상 터치 응답을 전시 않을 때 물고기 anesthetized 있습니다. 이것은 물고기가 완전히 anesthetized거나 그들이 레이저 절제를 수행하려고 시도시 트위치 것이 중요합니다.
2. 적절한 형광 설정에서 주입 동물을 검사하고 쉽게 근위 tubules을 시각화 수있는 동물을 선택합니다.
3. tricaine을 포함하는 별도의 접시에 선택된 배아를 전송합니다. 최대 30 분 동안 세포 절제를 수행하기 전에 동물 anesthetized 수 있습니다. 당신은> 15 동물을 점수를하면, 각 세포 절제 몇 분 정도 걸립로 절제를 기다리는 동안 신선한 수정 E3를 포함하는 별도의 접시 다음을 반환합니다.
4. 절제를 수행하려면, 고정 미디어에서 배아를 씻어 2 분 동안 1.5 % methylcellulose/0.02 % tricaine를 포함하는 작은 페트리 접시 한 ​​anesthetized zebrafish를 전송합니다.
5. 다음 1.5 % methylcellulose/0.02 % tricaine 한 방울이 들어있는 유리 우울증 슬라이드로 배아를 전송합니다. 부드럽게은 복부 측면의 슬라이드와 지느러미 측면가 직면입니다 직면 그러한 훌륭한 프로브와 함께 동물을 위치.
6. compund 현미경 단계에 슬라이드를 삽입하고, 동물의 등의 측면에 중점을두고 있습니다. 발 페달을 누르하여 초점을 맞추고 아래에있는 nephron 세포의 박리를 수행합니다. 신장 상피 세포 (그림 1A) ablated 있으므로 당신은 형광의 분산을 볼 수 있습니다.
7. 부드럽게 이어지는 culturing에 대한 12 잘 요리에 잘 수있는 ablated 동물을 전송합니다. 메틸 셀룰로오스를 멀리 세척하는 E3 2-3 번 씻어.
8. 주사 후, 원하는 timepoint에 동물을 높이고 젊은 zebrafish의 배아 (그림 2) 설립 histological와 분자 기법을 따라 원하는대로 분석을 수행합니다.

3. 대표 결과 :

그림 1에 표시된 데이터는 절제 timecourse을 나타냅니다. dextran - conjugates와 근육내 주입 후, 근위 가느다란 관은 우선적으로 표시됩니다. dextran - FITC의 분사는 레이저 절제에 대한 신장 레이블을 위해 사용되었고, ablated 동물은 근위 가느다란 관 인구를 reimage 하나 추가 timepoint 다음과 절제의 dextran - rhodamine와 reinjected되었습니다. 표현 분석 기법 현장 하이브리드화처럼은 그림 2에 표시된 셀 절제 다음과 같은 단일 timepoints에 고정 표본의 변화를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

그림 1 : 레이저 박리 절차는 가느다란 관의 상피의 빠른 재생을 따라 (AC)에 세포 변화 Timecourse와 절제의 시간 (3 일, 패널)에서 zebrafish 유충 근위 tubules의 레이저 절제 이후에, 또는 하나 또는 셋. 일 포스트 절제 (매일 4, 패널 B, 일 7, 패널 C). (위) 회로도는 dextran - FITC (녹색) 및 dextran - rhodamine (빨간색)와 nephron의 위치를​​ 표시하고, (아래) 제어 및 레이저 ablated (LA) nephrons 라이브 영상.

그림 2. 레이저 절제 다음과 같은 유전자 발현 분석 일 3 레이저 절제 후, 배아는 고정 및 nephron의 근위 뒤얽힌 가느다란 관 세그먼트를 표시 slc20a1a에 대한 성적 증명서를 탐지하기 위해 현장 하이브리드화의 전체 마운트에 의해 처리되었다. (A) 레이저 절제의 대상이 아니었 제어 배아, (B) 가느다란 관의 상피의 큰 스트레칭이 ablated었고, (C) 배아가있는 가느다란 관의 상피의 짧은 간격이 ablated어진 배아. 블랙 라인이 참조를 제공할 수있는 근위 가느다란 관의 범위를 나타내는 파란색 라인 패널 BC의 레이저 절제의 범위를 표시하고, *는 제어 (비 - ablated) 패널 BC에서 contralateral nephron을 나타냅니다.

토론

zebrafish는 과학의 여러 측면에 걸쳐 널리 사용되는 모델 유기체이며, 응용 프로그램 중 ⁶ 성장하고 있습니다. 아키 같은 신장 질환의 연구에 zebrafish 모델 시스템의 고용은 중요한 관찰을 주도하고 신장 부상 ^7,8을 연구하는 좋은 모델이 될 것입니다. 합성되어 게놈과 장소에서 많은 분자 프로토콜로, 그것은 유전자 변형 모델, 유전자 최저 및 misexpression 연구를 활용하여 정교한 zebrafish 연구를 수행하는 점점 쉽게되었다. zebrafish는 큰 세대 크기와 잘 정의된 발달 단계와 짧은 라이프 사이클을하고 있습니다. 또한, zebrafish 배아와 애벌레 단계가 유기체의 절개없이 이미징 연구 가능하게, 대부분 투명하고 있습니다. 배아와 애벌레 단계를 통해, zebrafish이 발달 timepoints 중에 눈에 띄는 남아이 nephrons의 구성 pronephric 신장 있습니다. Zebrafish pronephric의 nephrons은 ^4,5 급성 신장 장애 연구에 대한 좋은 모델을 만들고, 구조 및 포유류의 대응하는 기능에 유사하고 있습니다.

신장은 신진 대사 액체 폐기물의 시신을 깨끗하게 기관으로 제공, 인간과 다른 척추 동물의 생존에 중요합니다. 이 클렌징 기능은 혈액을 필터하고 분비에 대한 질소 폐기물을 수집 여과물를 수정하고 동시에 유체 및 전해질 균형을 유지하기 위해 신장 nephrons의 능력에 달려있다. Nephrons는 덕트에 혈액 필터, 상피 가느다란 관과 유출로 구성되어 있습니다. 모두 세 부분의 구조와 기능 무결성 nephron의 기능에 필수적인 것입니다. nephrotoxins에 노출, 국소 빈혈 또는 비뇨기 유출 트렉츠의 방해를 포함하여 신장 다양한 모욕, 아키 ¹ 발생할 수 있습니다. 아키의 병리는 종종 급성 관 괴사 ^1,2와 연결되어 있습니다. 임상 연구는 신장 장애를 다음의 것은 신장 실패의 원인과 상황에 따라 70~80%에서 어디서나 다양 사망률을 가지고 것으로 나타났습니다. 그러나, 아키의 기본 원인 빠른 진단과 반전은 점점 괴사성 nephron의 tubules의 재생을 통해 복구와 관련된 것입니다. 최근 운명 매핑 연구 손상된 nephron의 tubules를 다시 채웁니다 주요 세포 인구가 인접, 손상되지 않은 지역에서 발생한 ¹² 상피 세포는 것을 보여주었다. 이러한 연구 결과는 신장 줄기 / 전구 세포 과정에 참여할 수있는 가능성을 제거하지 않은, 그리고 독립적인 보고서 골수 파생된 세포가 신장 재생 ¹³ 기여할 수 있다고 제안했습니다. 그것은 지속적인 조사가 더 신장 상피 세포 재생의 소스를 해결하기 위해 필요한 것이 분명하다.

nephron 재생과 개발 모두 주 mesenchymal와 상피 세포 사이 phenotypes 상태에서 스위치 현상을. nephron 개발하는 동안, mesenchymal 전구 세포가 관 상피 ³ 양식에 지하 막에 연결, 고정 표현형로 구분. 급성 신장 실패 다음과 상피 세포의 추측 철새 현상 mesenchymal 표현형에 dedifferentiation을 요구. 흥미롭게도 최근 연구 손상된 신장의 mesenchymal 세포가 개발 중에 ¹⁴ mesenchymal 세포와 유사한 표현 프로필을 전시하는 것이 좋습니다. 다양한 보고서는 세포 접착 분자, 매트릭스 단백질, 크린 시토킨 및 chemokines의 변화를 감지했습니다. 상피 전이에 대한 제안 mesenchymal 따라 전지는 지하 막에 재조 립하고 관 상피 활동을 reinitiate. 이 과정에서 중요한 유전자를 결정하는 것은 우리의 실험실과 다른 사람에 대한 연구의 주제로 계속됩니다. 대부분이 과정의 주요 요소를 명료하게하다하는 작업이 남았지만, 현장에서 상당한 진전이 gentamicin의 효과에 관한 연구로 이동해왔다.

gentamicin에 의한 아키와 신장 장애는 의학 ¹⁵ 사용 nephrotoxic 화합물의 유행을 고려 적합합니다. 그람 음성 세균 감염에 대한 치료로 사용, aminoglycosides의 행정부는 가지 경우 10~25%에서 급성 부상 발생합니다. 약물 함께 많은 관 세포에서 apoptosis 또는 괴사의 결과, 부정적인 세포 효과 과다 발생합니다. 연구 megalin과 endocytosis에 관여 cubulin에 의해 형성된 복잡한 우선적으로 바인딩하는 약물을 발견했습니다. 그들은 이러한 세포의 표현에 국한되지 않습니다하지만 이러한 분자는, 근위 가느다란 관의 상피 세포에서 풍부하게 발견됩니다. 산화 스트레스 유도, vasoconstrictors의 출시, 휴대 ATP, hypoxia의 고갈, phospholipases의 억제의 결과로 세포의 신호 전달을 통해, gentamicin 및 유사 항생제 말이죠상피 세포의 apoptosis와 괴사. 또한, 항생제는 사구체 여과 속도의 드롭 결과 nephron 혈액 필터 (glomerulus)의 mesangial 수축을 트리거하고 부정적인 혈류를 필터링하는 신장의 능력을 변경. 반응 산소 종, immunostimulatory 분자, 그리고 phospholipases의 활성화의 생산은 급성 신장 실패로 연결 치명적인 병리학을 만드는, nephron의 확산 효과를했습니다.

gentamicin 및 이와 유사한 항생 연구가되어 있고 신장 재생 연구에 중요한 도구가 될 계속되지만, 그들은 특정 질문을 해결에 도움이 될 수있는 정밀도를 부족합니다. 이 프로토콜에 설명된 레이저 절제 방식과 함께 zebrafish를 사용하여 우리의 시스템은 정밀한 연구 도구의 필요 대답을 제공합니다. 레이저 박리는 연구자에 이르기까지, 신장 가느다란 관의 focal 분야에서 세포 파괴를 유발 수있는 작은 (2-3) 비교할 수없는 정밀 대형 (> 50-100) 인구에. 이 프로토콜에서는, 우리는 우선적으로 근위 가느다란 관 상피 인구 라벨 dextran - conjugates에 노출 이전에 개발된 방법을 이용한다. 또는 가느다란 관 중 하나 이상의 지역에 녹색 형광 단백질을 표현하는 유전자 변형 zebrafish 라인을 사용할 수 있습니다. 예를 들어, cadherin17 : eGFP 유전자 변형 zebrafish는 (근위 인구에 불구하고 약한) 말초 가느다란 관의 지역에서 강한 형광을 전시 및 기타 가느다란 관 세그먼트의 재생 연구 ¹⁶ 유용할 수 있습니다. nephron의 가시는 시간이지나면서 세포의 변경 시간 저속 비디오 녹화를 설정합니다. 같은 현장 하이브리드화 또는 immunohistochemistry의 전체 마운트로 유전자 발현 연구와 결합하면, 연구자들은 시간이 지남에 따라 nephron의 분자 변경을 감지할 수 있습니다. 함께 촬영, 이러한 전략은 신장 상피 세포가 파괴되면 발산 이벤트의보다 역동적인 이해를 형성하기 시작할 수 있습니다.

우리의 레이저 박리 모델의 주요 주의해야 할 점은 그것이 인간 아키에 발산 생리적 조건의 일부 측면을 요점을 되풀이 수있다는 것입니다. 순간 물리적 손상으로 유도된 세포 죽음은 세포에 괴사에 이르게 이벤트의 폭포 다른 있으며, 각 microenvironments 이러한 체액성 요소는 동일하지 않을 수 있습니다로. 또한, 거기에 신장 부상 중에 유도된 apoptosis의 증거를 존재하고, 그러한 결과는 레이저로 다음과 같은 모욕을 발산 여부를 알 수 없습니다. 그러나, 단지 세포 배양과 같은 좋은 답변을 몇 가지 매우 통제된 환경이 필요한 질문은 레이저 절제는 매우 아키의 생체내 모델의 제어 역할을 것이라는 도구입니다. 따라서, 통찰력 가능성이 높습 다른 신장 부상의 조사에 적용 가능성이 인간에 더 나은 진단을 만드는 데 사용할 수있는 근본적인 통찰력의 발견을 촉진합니다 zebrafish에서 신장 상피 박리 연구에서 얻고.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
배아 요리	매	35-1005
해부의 포셉	Roboz	RS - 5010
주입 바늘	서터 Intruments	BF100 - 50-10
Ultrapure 아가로 오스	Invitrogen	16500-500
40 kilodalton (KD) Dextran - 플루오레신	Invitrogen	D1845
플라스틱 전송 pipet	Samco 과학, 피셔	204 13-711-23
Tricaine	시그마	E10521
메틸 셀룰로오스	시그마	M0262
우울증 슬라이드	어부	S175201
12 - 잘 요리	코닝	3512