Craniofacial Mesenchyme의 Electroporation

요약

Craniofacial 연골은 다른 조직들과 긴밀한 접촉을 개발하고 살아있는 동물의 조작 어렵습니다. 우리는 초기 배아 효과를 우회하면서 craniofacial 골격의 성장하는 동안 분자 도구를 제공하는 electroporation을 사용하고 있습니다. 이러한 접근 방식은 우리가 효율적으로 후보 분자를 테스트하실 수 있습니다 생체내 인치

초록

Electroporation은 정확한 시간 포인트에서 조직에 정확한 위치에 DNA 및 기타 유료 macromolecules을 전달하는 효율적인 방법입니다. 예를 들어, electroporation는 Xenopus의 신경 및 망막 개발 연구에 큰 성공과 함께 사용되었으며, 닭 및 마우스 ^1-10. 그러나 이러한 연구 모두, 조사관은 부드러운 조직을 타겟팅되지 않은 점에 유의하는 것이 중요합니다. 우리가 craniofacial 개발에 관심이 있기 때문에, 우리는 얼굴 mesenchyme를 대상으로하는 방법을 적응.

우리가 문헌을 검색하면, 우리는 놀랍게도, 연골 조직으로 성공적으로 유전자 전달의 거의 보고서를 발견했습니다. 이러한 연구의 대부분은 chondrogenic 셀 라인으로 siRNA 또는 단백질 전달, 또는 관절염 ^11-13의 동물 모델로 유전자 치료 연구했다. 같은 닭고기 드나 마우스와 같은 다른 시스템에서는 얼굴 mesenchyme의 electroporation 도전했습니다 (개인 communicat을이온, Craniofacial 개발 부서, KCL). 우리는 Xenopus의 procartilaginous 및 연골 조직에 electroporation 더 효과가있을 것을 가상. 우리의 연구에, 우리는 그 얼굴 연골에 유전자 전달의 얼굴 primordium가 여전히 이전의 연골 분화에 부드러운 조직으로 구성되어 있습니다 초기 단계 (28)에서 효율적으로 발생 보여줍니다.

Xenopus은 craniofacial 개발 분석을 위해 매우 접근 척추 시스템입니다. Xenopus의 배아는 초기 단계의 분석을 수 있도록 외부 수정된, 그리고 라이브 단세포 해상도 이미징뿐만 아니라 어머니 ¹⁴ 재사용을 촉진하기 때문에 Craniofacial 구조는 더 쉽게 볼 수 Xenopus의 다른 척추 모델에 비해 주로하고 있습니다. Xenopus의 유충이 디로 크고 쉽게 외부로 개발 척추 모델 중에서 Xenopus은 zebrafish보다 craniofacial 분석에 더 유용합니다ssect 및 개발 얼굴 지방은 고기의 상응하는 영역보다 이미지에 더 액세스할 수 있습니다. 또한, Xenopus은 zebrafish (~ 100,000,000년 가까이) ^15보다 인간 evolutionarily 가까이 있습니다. 마지막으로,이 단계에서 Xenopus의 tadpoles는 투명하고, 형광 단백질 또는 분자의 동시 표현이 개발 연골 쉽게 시각화를 허용합니다. 우리는이 접근법 우리가 신속하게 효율적으로 생체내 모델 시스템에서 후보 분자를 테스트할 수 것으로 기대하고 있습니다.

프로토콜

부품 1A. 장비

현미경 : 낮은 전력 목적으로 직립 스테레오 - 해부 범위

• 전압 / 펄스 발생기 : BTX ECM 830 스퀘어 웨이브 Electroporation 시스템
• 피펫 풀러 : P - 87 Micropipette 풀러 (셔터 악기 회사, CA)
• 속이는 사람 : 거친, 또는 결합 굵고 좋은가 준비에 따라 다릅니다.
• Micropipette 홀더 : 파인 과학 도구
• 전극 : 수제
• Electroporation 챔버 : 수제

L - 모양의 전극 :

1. 고순도의 8cm 0.4 mm의 텅스텐 와이어 (Goodfellow)과 midpoint에 부착을 잘라 접착제를 (우리가 블루 - 압정을 사용)를 사용하여 1ml 주사기. L - 모양에 주사기 및 굽힘 팁의 끝부분에서 노출된 4cm의 텅스텐 와이어를 떠나 끝에서 1cm (그림 1A).
2. 팁 이렇게 끝이 길이가 0.​​5 mm를 측정하는 것을 낸다. 티그의 끝은 전극 종착역입니다.
3. 주사기에 여분의 텅스텐 와이어 병렬를 실행하고 전극 펄스 발생기를 연결하는 그것을 사용합니다.
4. 전극 한 켤레를 만드는 과정을 반복합니다.
5. DC 케이블을 통해 사각형 웨이브 펄스 발생기에 전극을 부착합니다.

Electroporation 챔버

1. ~ 5mm 무독성 플라스티신와 90mm 접시의 바닥 선.
2. electroporation 미디어와 함께 요리를 입력합니다.
3. 사용 5 호 시계 제조인의 집게는 T - 모양 잘 (그림 2) 싶습니다. 오랜 우물 ~ 2mm X 2mm X 10mm와 짧은을 ~ 2mm X 2mm X 5mm를 측정한다. electroporation 요리 세탁해서 활용할 수 있습니다.

부품 1B. 시약

DNA 또는 유료 macromolecules

• Micropipettes : 1mm 폭 4 "길이 borosilicate 유리 모세관 (WPI, TW100 - F)
• 문화 미디어 : 일반 수륙 양용 미디어 (NAM)
• > 10 X 재고 : 1100 MM NaCl, 20MM KCL, 10 MM 칼슘 (NO _{3) 2} • 4H ₂ O, 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산).
  • 4 ° C.에 압력솥 및 저장
  • 1 X NAM : 0.1 MM NaHCo ₃ 0.2 MM 나 ₃ PO ₄ 10X 주식, 버퍼에서 희석.
• Xenopus laevis tadpoles, 단계 28

DNA 준비 :

1. 표준 프로토콜을 사용하여 표현 plasmids를 준비합니다.
2. nuclease 무료로 H ₂ 0 1 μg / μl의 최종 농도로 DNA를 Resuspend.

* 우리는 같은 pCS2로 강한 CMV 프로 모터를 포함하는 벡터, 성공 있었 + [16]. 혈통 분석을 위해, 우리는 대개 0.1 μg / μl의 최종 농도에서 녹색 형광 단백질 (GFP pCS2 +)를 인코딩 DNA를 포함합니다. 0.1-3 μg / μl 사이 [DNA의 농도도 테스트했다. 우리는 발견 0.8 μg / μl inefficiently 표시 셀 아래의 농도, DNA의 농도 반면 이상 2 μg / & MU; 난 electroporation 효율을 향상되지 않았].

Morpholino oligonucleotide 준비 :

(참고 :. 수법의 살인인 걸 fluoresceinated해야합니다 (3' - carboxyfluorescein 수정)하거나 유료)

1. Resuspend morpholino의 oligonucleotides (수법의 살인인) (Genetools, www.genetools.com nuclease 무료로 H ₂ 0 2 mm의 농도에서).
2. 65 재고 솔루션의 열 나누어지는 ° C 5 분.
3. nuclease 무료 물에 0.5 mm의 최종 농도 희석.

* 0.1 - 1mM MO 솔루션은 테스트되었습니다. 0.5 MM MO 솔루션은 많은 mesenchymal 세포 electroporation에 충분했다.

Micropipettes

1. borosilicate 유리 모세관 (폭 1mm, 4 "긴 WPI 안돼. TW100 - F)에서 micropipettes를 준비합니다. 8-12밀리미터 긴 테이퍼 및 고급 팁과 micropipettes를 준비하는 바늘 풀러를 사용합니다.
2. 호감 팁 ~ 2mm팁에서 집게를 사용하여 톱니 휴식을 만들 수 있습니다.

미디어

1. 부화 미디어 : 1X 주식 신선한 4분의 3 일반 수륙 양용 미디어 (NAM)를 준비합니다. 0.025 MG / ML gentamycin을 추가합니다.
2. Electroporation 미디어 : 위에서와 0.1 % Benzocaine (시그마, 06950).

2. Electroporation

Micropipette 설정

1. ~ 1 μl 주입 솔루션 micropipette를 입력합니다.
2. micromanipulator에 micropipette를 확보하고 microinjector (Picospritzer II)에 첨부해 주시기 바랍니다.
3. 탁상에서 50 °의 각도 micropipette.
4. 20 PSI로 분사 압력을 설정합니다.
5. 펄스 30 NL를 삽입하는 micropipette를 보정합니다.

올챙이 준비

1. 5 분 electroporation 매체의 잠복기에 의해 무대 28 Xenopus의 애벌레를 마취.
2. electroporation 미디어 가득 electroporation 챔버에 anesthetized 올챙이를 전송합니다. 위치 배아긴 시간 잘 수 있도록 머리를 아래 지느러미 측면과 노출된 복부 측면과 함께 T - 교차점에 달려 것을. 머리는 약간 꼬리에 비해 상승한다.
3. 집게를 사용하면, 부드럽게 플라스티신 주변과 잘에서 올챙이을 확보. (참고 :.. 올챙이가 보안되지 않은 경우, 그것이 떨리는와 electroporation 동안 전극 연락을 얼굴 조직이 심각하게 손상될 수 있으므로이 경우에는 올챙이를 삭제 수 있습니다)

Electroporation

1. micropipette 팁 즉시 시멘트 선에 후부와 얼굴 mesenchyme에 넣습니다.
2. mesenchyme로 30 NL 솔루션을 주사.
3. micropipette를 철회.
4. 빠르게 배아의 머리 (그림 3) 병렬 전극 팁에 맞춥니다.
5. 8 50 MS, 20mV 사각형 펄스를 적용합니다.
6. 전극을 철회.
7. 집게를 이용하는 것은 신중하게 우물에서 올챙이 릴리스 3 / 4 NAM, 0.025 MG / ML gentamycin을 전송.
8. Tadpoles는 NAM, 0.025 MG / ML overn 4분의 3에 incubated 수 있습니다항공, 이상.
9. 24 시간 후에 형광 현미경에 의한 효율적인 electroporation을위한 화면 배아.

3. 대표 결과 :

형광 분자의 사용은 electroporated 배아 쉽게 검사 수 있습니다. 그림 4는 14.5에서 incubated MO electroporated tadpoles ~ 12, 48 electroporation 후 96시간의 전형적인 배치, ° C.를 보여줍니다 형광 현미경을 사용하여 수법의 살인인 즉시 electroporation 후 시각과 electroporation 후 며칠 동안 계속하실 수 있습니다. 우리의 경험에서 형광 무대 46 (~ 5 일 후)에 약하게 분명하다. 연골에는 형광은 차별화 (~ 스트리트 42)의 발병 이후 크게 감소하지만, MO 형광는 pharyngeal endoderm 등 다른 세포 유형에 더 강력하게 지속. 형광 현미경은 oligonucleotides는 연골 등 여러 craniofacial 조직에 통합됩니다 것을 보여줍니다. Oligonucleotide 형광 C은 종종 머리 양쪽에 조직에서 시각 수 있습니다. 이것은 가능성이 electroporation하기 전에 느슨한 craniofacial mesenchyme 내내 사출 솔루션의 빠른 확산에 의한 것입니다.

1 집에서 만든 전극을 그림. L - 모양의 텅스텐 와이어는 무독성 점토 또는 퍼티를 사용하여 1 ML의 주사기에 첨부되어 있습니다. (A) 전극 말단은 5mm를 측정합니다. (B) 테르 병렬 실행 등, 전극의 쌍을 연결합니다. 전극 DC 케이블에 의해 펄스 발생기에 연결된 있습니다.

이 Electroporation 챔버 그림. (A) 플라스티신 줄지어 90mm 요리는 미디어와 시계 제조인 없음 5의 집게와 함께 새겨진 T - 모양의 챔버로 가득합니다. (B) 긴 쪽을 2mm X 2mm에게 X10 mm를 측정짧은 조치 2mm X 2mm X 5mm를 하다니. 배아의 머리가 T - 접합, 복부 측면에 달려있다.

3 도식 보여주 electroporation 절차를 그림. 성 28 올챙이는 복부 측면은 최고, electroporation 챔버에 배치됩니다. Micropipette는 얼굴 mesenchyme 기본 시멘트 선에 삽입됩니다. 주입. Micropipette은 제거하고 L - 모양의 전극은 병렬로 머리를 측면 정렬됩니다. 팔 50 MS, 20 MV 사각형 펄스를 적용합니다. 전극을 철회. 원하는 단계로 tadpoles 성장. 수법의 살인인 또는 형광 현미경을 사용하여 GFP 발현을 Visualise.

사 대표 tadpoles 12 (A), 48 (B) 및 96 (C) 시간 게시 electroporation을 (단계 30, 34 각각 44) 그림. ( "- B") 형광등 MO는 사슴에 craniofacial mesenchyme 내에서 시각 수 있습니다초밖에 30 34. 형광은 스테이지 44 (화살촉, C' - C ")에 연골에서 발견하실 수 있습니다. 창자는 매우 autofluorescent입니다.

토론

이 비디오에서는, 우리는 Xenopus tadpoles의 얼굴 mesenchyme에 electroporation - 중재 유전자 전달의 가능성을 증명하고있다. 이 방법을 사용하여, 우리는 나중에 시간 지점에서 특정 조직을 대상 있도록 유전자 기능을 조작의 조기 개발 효과를 무시할 수 있습니다. 우리의 연구는 우리 electroporated 세포뿐만 아니라 관심 단백질에 대한 세포 자율적인 요구 사항의 혈통을 조사 수 있도록, craniofacial mesenchymal 세포의 불일치 인구가 영향을받을 수있는 것으로 나타났습니다. 라이브 영상과 결합, 우리는 craniofacial 개발하는 동안, 시간이 지남에 따라, 유전자 기능을 연구하기 위해이 방법을 사용할 수 있습니다. 이 소설의 방법은 organogenesis의 연구 Xenopus의 tractability를 강조 표시합니다. 우리는이 방법이 널리뿐만 아니라 morphogenesis 및 기타 조직의 분화 연구를 적용할 수 있습니다 것으로 예상.