Midgestation 마우스 태아의 아래쪽 사방 정계 립의 시험 관내 Electroporation에

요약

이 연구의 발전을 설명 체외에서 electroporation 기술.

초록

마름모꼴의 입술은 신경 튜브와 넷째 뇌실 ⁽¹ 검토)의 roofplate 사이의 교차점에서 hindbrain에있는 배아 neuroepithelium입니다. 마름모꼴의 입술은 rhombomere 1 (R1)을 포함하고 소뇌의 뉴런의 연결을 다양한 brainstem의 lineages ^2-4로 상승을주는 낮은 마름모꼴의 입술 (LRL)를 생성하는 상위 마름모꼴의 입술 (URL)로 세분화 할 수 있습니다. LRL 파생 상품은 청각 와우각 핵의 뉴런과 균형과 모터 제어 ^5-8를 규제에 관련된 precerebellar 핵 분들을 포함합니다. LRL에서 Neurogenesis은 배아 일 (E) 9.5-16.5 ^{5, 9를} 포함 대용량 시간적 창을 통해 발생합니다. 다른 lineages의 연결이 neurogenic 창을 동안 뚜렷한 발달 일간 postmitotic 세포 (또는 태어난다)로 LRL에서 나온다.

유전자 발현 구조의 Electroporation을하는 데 사용할 수있는LRL progenitors의 유전자 발현을 조작하고 잠재적으로이 지역에서 생산된 ^10-12 뉴런의 운명을 바꿀 수 있습니다. utero의 electroporation의를 통해 마우스의 LRL progenitors의 변화 유전자 발현은 배아 일 E12.5 이상 ^{10, 12-14} 일에 태어 lineages 조작을위한 큰 성공을 거두었습니다. utero의 electroporations에는 사전에 E12.5이 주로 인해 성공하지 못했습니다 보여 주죠는 네 번째 뇌실의 roofplate, LRL로 electroporated되는 외인성 DNA를 제공하는 필요한 단계를 펑쳐링과 관련된. 그러나 많은 LRL 파생된 lineages 일찍 E12.5 ^9보다 LRL에서 발생합니다. 이러한 이전 출생 lineages는 측면 망상을 구성하는 뉴런, 외부 cuneate 및 소뇌 ⁵ 척수와 대뇌 피질로부터 입력을 연결하는 기능 precerebellar 시스템의 열등 olivary 핵을 포함합니다. LRL 표현을 조작하기 위해서는E12.5 미만 배아의, 우리는 배아가 electroporation에 따라 문화에 배치되는 체외 시스템에서 개발.

이 연구 E11.5에서 LRL progenitors의 유전자 발현을 조작을위한 효율적이고 효과적인 방법을 제공합니다. 크게 활성 배속 모터에서 구동 녹색 형광 단백질 (GFP)을 electroporated 태아는 reproducibly 문화 24 시간 후 GFP를 표명했다. 이 분석의 핵심 측면은 유전자 발현에만 때문에 외인성 유전자의 표현이 아니라 인해 이차 효과 변경되는 것입니다 electroporation과 culturing 기법에 따른니다. 그것은 내생 유전자 발현 패턴 electroporated과 교양 배아에 그대로 남아있는 것으로 확인되었다. 이 분석은 overexpression에 대한 plasmids의 도입을 통해 E12.5 미만 배아의 LRL에서 신흥 세포의 운명을 변경하거나 (RNAi를 통해) 아래로 노크를 활용할 수 다른 프로신경 전사 요인.

프로토콜

1. Electroporation 이전 준비

1. 맥시의 준비 (프라임 - 이건 또는 Qiagen)에 의해 electroporation을위한 DNA를 증폭. DNA의 농도는 효율적인 이해 1 밀리그램 / ML 최소이어야합니다.
2. microcentrifuge 튜브 1 X PBS (인산염 식염수 버퍼)의 0.01 % 빠른 그린의 5 μl로 DNA와 혼합 495 μL를 제거합니다.

2. 배아 하베스트

1. CD-1 생쥐 (할란)의 시간이 초과되었습니다 matings을 마련한다. 질 플러그의 존재를 확인하고 질 플러그가 배아 일 (E) 0.5으로 관찰되는 날짜를 생각한다. 태아도 11일 플러그 (E11.5)를 시각화 후에 수확한다.
2. 70 % 에탄올로 소독 도구를 놓습니다. 사용하기 전에 적어도 한 시간 동안 자외선과 판상 흐름 후드를 드셔보세요. 스프레이 후드, 해부 트레이, 그리고 70 % 에탄올로 범위를 해부. 37까지 사전 열 1 X PBS는 ° C.
3. E11.5에서 Institut의 승인 조건에 따라 여성을 안락사시켜야동물의 관리 및 사용 (ICCUA)에 대한 ional위원회. 층류 후드의 해부 트레이를 놓습니다. 70 % 에탄올과 여성의 복부를 스프레이.
4. 복막 캐비티를 열고 해부 트레이에 성벽을 달아주는. 그것이 복막 캐비티 내에 달려 있도록 자궁 뿔을 내밀어 봐요.
5. 조심스럽게 자궁 뿔의 벽을 열고 했네요. 부드럽게 멀리 태반에서 난황에서 배아를 제거하는 20 밀리미터 스푼 (파인 과학적 도구)를 사용합니다. 100 밀리미터 조직 배양 접시에 플레이스 배아 2.2에 preheated되었습니다 멸균 1 X PBS의 10 ML과 prefilled.
6. 현재 모든 배아에 대해 반복합니다.

3. E11.5의 태아의 Electroporation (그림 1)

1. 20 밀리미터 스푼을 사용하여, 37에 preheated되었습니다 멸균 1XPBS의 10 ML로 prefilled 새로운 100mm 요리 ° C.에 최초의 배아를 전송
2. 신중을 다시 0.05 X 0.02 밀리미터 팁 (파인 과학적 도구)로 11cm의 집게를 사용하여이동하고 난황을 버리고.
3. 위치 배아 그래서 그 지느러미 측면은 그림 1A에서 만화과 비슷한 정도로까지 직면하고 있다고. 부드럽게 배아를 개최하기 위해 7mm 전극 충격기 (하버드 장치)를 사용합니다. 전극은 hindbrain 넷째 뇌실의 수준에서 신경 튜브의 양쪽에 위치해야합니다. 뇌실은 맨눈으로 볼 수 있지만 해부 현미경을 사용하면 정확한 패들 배치를 용이하게하실 수 있습니다. 심폐 소의 위치는 electroporated DNA를받는 지역을 결정하기 위해 중요합니다. 지느러미 배아 hindbrain의 낮은 마름모꼴의 입술 (LRL)이 원하는 경우 심폐들이 직접 번째 뇌실 개구의 가장 넓은 부분을 측면되는 그러한 장소 여야합니다.
4. 0.01 % 빠른 그린과 혼합 플라스미드 DNA를 구축하도록 한 CC의 주사기를 사용하십시오. 혼합물 500 μL은 적어도 8-10 배아 (3.5 참조) electroporation 충분해야합니다.
5. 부드럽게 찔린 roofplate 오븐한 CC의 주사기에 부착된 25G 8분의 5 투베르쿨린 바늘로 네 번째 뇌실을 erlying 및 뇌실로 DNA를 염색 혼합물을 주입. 성공 주사는 전체 심실 시스템 (그림 1C)을 작성 DNA-염료 혼합물을 특징으로하고 있습니다. 일반적으로 주입 DNA-염료 혼합물의 양은 50 미만 μL입니다. 혼합물의 부분이 배아를 둘러싼 PBS로 뇌실 밖으로 새는 경향으로 정확한 금액은 배아 사이의 변수입니다. DNA-염료 혼합물을 전달하는 대체 수단 midbrain을 overlying 연구개를 펑쳐링하여 심실 시스템에 액세스를 통해 것입니다. 다시 말하지만, 성공적인 주사는 전체 심실 시스템을 작성 DNA-염료 혼합물을 특징으로하고 있습니다.
6. 전기 펄스 발생기 (BTX) 및 7 밀리미터 전극 충격기를 사용하여 다섯 사각형 펄스를 제공합니다. 각각의 펄스는 각 펄스 사이의 500 MS와 펄스 당 50 V, 지속적인 다섯 MS입니다. 긍정적으로 충전 전극에 가장 가까운 조직 얘기가 그러면됩니다플라스미드 백업 E.

4. 태아의 문화

1. 층류 후드에서는 10 % 태아 소 혈청 5 % 말 혈청, 1 %의 글루타민, 1 % 페니실린 / preheated되었습니다 스트렙토 마이신과 보완 DMEM/F12 미디어 2 ML과 함께 12도 문화 접시의 바깥쪽 우물을 채울 37에 ° C. 문화 조건 드 샌디에고 및 동료에서 적응되었다. ¹⁵
2. 포셉과 midsection (심장 아래)에서 층류 후드의 핀치 배아와 태아의 후부 부분을 제거합니다. 12 잘 배양 접시 가득 우물 중 하나로 앞부분 일부를 놓습니다.
3. 모든 배아에 대해 반복합니다. 문화의 오염을 피하기 위해 12 잘 판만을 외부 우물을 채웁니다.
4. 5% CO _2와 37 ° C 배양기에서 문화 배아. electroporated 플라스미드의 표현 24 시간 이내에 관찰할 수 있어야합니다.
5. 이상 배양 시간이 원하는되어야, 2 ML과 함께 새로운 12 잘 접시의 밖으로 우물을 채울미디어 4.1에 사용됩니다. 멸균 스푼으로 새 접시에 잘으로 배아를 전송합니다. 37 ° C 배양기에 다시 넣습니다. 최대 48 시간까지를위한 문화가 가능합니다.
6. 원하는 문화 시간에 도달하면 (아래) 분석을 위해 배아를 채운다.

5. 분석을위한 태아의 작성

1. 다섯 분에 대해 4 ° C에서 1 X PBS에서 배아를 씻어. 반복합니다.
2. 4 ° C.에 2 시간 1XPBS의 2 % paraformaldehyde의 분석 (PFA)의 배아를 고정
3. 다섯 분에 대해 4 ° C에서 1 X PBS에서 배아를 씻어. 반복합니다.
4. 4에서 하룻밤 1 X PBS의 30 % 자당에 배아를 평형 ° C.
5. 드라이 아이스 / 에탄올 욕조를 사용하여 최적의 절삭 온도 (-10 월) 화합물의 배아를 포함시킵니다. 태아도 -20 ° C.에 저장될 수
6. 30 μm의 섹션으로 그라 이오 스탯 (Leica)과 (VWR, Superfrost 플러스) 슬라이드에 마운트에 관한 섹션 배아. -20 ° C.에 저장

6. Immunohistochemistry 분석

1. ^16에 설명된대로 Immunohistochemistry이 수행되었다. 마우스 α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100; 토끼 α-Ngn1 (제인 존슨) 1:5000, 토끼 α-Ptf1a (제인 존슨은이 연구에 사용되는 일차 항체 dilutions는 토끼 α-GFP (Invitrogen) 1:2500 포함 ) 1:2500, 토끼 Math1 (제인 존슨) 1:100. 4 ° C에서 하룻밤에 염색법 트레이에 슬라이드 평면, 표본 측면을 품어.
2. 슬라이드는 복합 현미경 (올림푸스 BX51)을 분석했다.

7. 대표 결과

그림 1A의 개략도 electroporation 실험을 묘사. 그림 1B는 조작 이전 E11.5 배아의 화살보기를 표시합니다. 0.01 % 빠른 그린에서 플라스미드 포함 배속 :: GFP의 주입에 따라 동일한 배아는 그림 1C 및 일방적 GFP를 전시 대표 고정되지 않은 배아에 나와 있습니다지느러미 hindbrain 24 시간 다음과 문화의 표현은 그림 1D에 표시됩니다. 성공적으로 electroporated되는 LRL의 영역의 범위는 변수이며 전극의 위치에 크게 의존 것 같습니다. 우리의 연구에 그것은 electroporated 배아 65 (80 %)의 52 밖으로 성공적으로 GFP를 표명 사실을 발견했습니다. 조직은 그것이 고정 및 immunohistochemical 분석 (아래)에 따라 여러 부분 이상의 지역화된 지역에서 GFP 양성 반응이 있었다면 성공적으로 electroporated로 간주되었다. 이 기준을 충족하는 데 실패 태아도 electroporation의 실패로 득점했다.

electroporation 효율의 자세한 평가는 넷째 뇌실의 수준에서 electroporated 배아의 가로 부분에 GFP에 대한 immunohistochemistry를 수행하여 ascertained 될 수 있습니다. 그림 2는 일방적를 표시 배아의 대표 시리얼 섹션을 보여줍니다GFP를 표현. 그림 2A는 배아의 왼쪽은 긍정적인 전극쪽으로이라고 설명하고 이상적인 설계도를 보여줍니다. 가로 구역 (그림 2A의 중간 만화로 대표되는 수준에서) hindbrain 조직 (그림 2C와 2D)의 왼쪽에 독점적으로 지역화된 GFP 발현을 알 수있다. 그림 2C에 나타난 그 ~ 300 μm의 주동이의 이상 부분의 심사는 명시적 GFP (그림 2B)을하지 않으므로 LRL의 electroporated 면적은 신경 튜브의 전체 앞쪽에-후부 축을 연장하지 않았다.

유전자 표현의 조작이 분석의 유틸리티는 내생 단백질에 대한 표현 도메인의 안정성에 의존적일 수 밖에 없습니다. LRL는 proneural 전사 요인 차등 표현 ⁽¹ 검토)을 특징으로 독특한 전구 도메인을 소지으로 특징되었습니다.이러한 요소의 하위 집합 (Mash1, Math1, Ngn1 및 Ptf1a)는 LRL, 미래 연구 ^16-18의 과목에 precerebellar 신경 subtypes의 사양에 그들의 제안 및 / 또는 특징 역할로 인해 분석에 선정되었습니다. 이들 네 단백질은 E11.5 ^16-18에서 꼬리 hindbrain에서 매우 특징적인 표현 도메인이 있습니다. 우리는 문화를 배치했다 배아 크기가 증가하는 데 실패하며 맥락막 얼기의 상피와 E11.5 및 E12.5 ⁵ 사이에 발생 LRL 및 roofplate, 형태학의 이벤트 invagination 생산을 시작하는 데 실패했음을 관찰했다. 이러한 관찰을 바탕으로 그것이 태아의 정상적인 개발이 중지 또는 조잡한 지연과 교양 배아에 대한 비교 가능한 컨트롤 E11.5에 미개한 배아있을 것을 결정했다.

문화와 electroporation은 내생 단백질의 수준을 방해하지 않게하기 위해, 우리는 immunohistoch하여 네 가지 단백질을 분석electroporated 그리고 최소 24 시간을위한 다음 교양했다 34 다른 배아에 emistry (IHC). 표 전 보관 정상적인 단백질 수준. 그림 3은 대표 IHC 데이터를 보여주는 것으로 분석 각 마커와 배아의 비율에 대한 분석 배아의 수를 보여줍니다 단백질의 두 분석에서 Mash1 (그림 3A 및 3B)와 Math1 (그림 3C 및 3D). 우리는 E11.5 (그림 3A와 3C)에서 제어 배아에 비해 배아의 대부분은 표현에 따라 electroporation과 문화 (그림 3B 및 3D)의 정상 수준을 유지 것을 관찰했다. 중요한 것은, 이러한 단백질의 특성 표현 도메인은 perturbed되지 않았습니다.

1 그림. 회의 E11.5시 태아의 Electroporation. () 도식전자 electroporation 실험. E11.5의 배아는 격리되어 0.01 % 빠른 그린에서 플라스미드 표현식 번째 뇌실로 주입된다. 배아 그러면 전극 충격기의 어귀 사전 문화에 주입 이전 E11.5 배아의 (B) 화살 볼 수있게 된에 50 V 펄스를 받게됩니다. (C) 같은 E11.5의 배아는 0.01 % 빠른 그린에서 플라스미드의 주입에 따라. (D) GFP의 일방적 hindbrain 표현 문화의 24 시간에 따라 E11.5의 배아에서 관찰. 메가바이트-midbrain, 4V - 넷째 뇌실.

그림 2. Electroporated 조직에서 GFP의 표정은. () 왼쪽에있는 만화는 E11.5 배아 주위에 전극의 위치를 묘사. 중동 만화는 배아의 왼쪽에있는 플라스미드 인코딩 GFP의 이해와 표현을 묘사. 오른쪽에있는 만화는 내 덕분에 배아를 통해 촬영한 이상 형인 가로 섹션의 개략도이다evels는 중간 만화의 검정색 라인으로 표시. 문화의 24 시간 이후 electroporated E11.5의 배아를 통해 가로 섹션에 GFP를위한 (B-D) Immunohistochemistry. 화살표는 roofplate (RP) 어떤 트랩 이차 항체를 나타냅니다. 이미지 10X 배율로 촬영하고 있습니다. 표시된 섹션의 상대적인 수준은 ()의 중간 만화를 통한 가로선으로 표시됩니다. 메가바이트-midbrain, 리터 4V-넷째 뇌실, RP-roofplate.

그림 3. 로어 마름모꼴의 입술에 내생 단백질의 표현 Mash1 (A와 B) 또는 편대의 편대 장으로 electroporated 있었다 배아으로 (A, C) 교양 아니었 E11.5의 배아의 가로 섹션을 비교 Math1 (C와 D)에 대한 Immunohistochemistry. : : GFP, 24 시간 (B와 D)에 대한 교양. 이미지 10X 배율에서 찍은.

Proneural Transcripti팩터에서 분석	태아의 수 분석	일반 표현식 패턴을 유지 비율
Math1	15	86.7 %
Mash1	12	83.3 %
Ngn1	7	71.4 %
Ptf1a	6	백퍼센트

LRL에서 정상 Proneural 전사 인자 도메인을 유지 Electroporated과 교양 태아의 표 I. 비율.

토론

본 연구에서 제시된 시험 관내 electroporation 기술의 효율적 회임 12 일 이내에 젊은 배아에서 유전자 발현을 조작하는 데 활용할 수있는 새로운 방법입니다. 문화에 대한 태아의 위치는 도입 유전자의 표현을 허용하고 electroporated 배아는 생체내에 남아 허용하는 경우 주죠 지켜 circumvents. 이 기술은 electroporation 기반의 연구 이전에 액세스할 수있었습니다 배아 progenitors에서 유전?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
그라 이오 스탯	Leica	CM-1850
Biologie 팁 Dumoxel는 뒤몽 포셉을 취급	좋은 과학 도구	11252-30
20mm 모리아 다공 스푼	좋은 과학 도구	10370-17
ECM 830 스퀘어 웨이브 Electroporation 생성기	BTX (VWR)	47745-928
하버드 장치 7mm Tweezertrodes * 전극	BTX (피셔)	BTX450165
피셔 Isotemp CO 2 인큐베이터	어부	1325525
NAPCO CO 2 가스 조정기	어부	15497020
12 음 조직 배양 플레이트	BD 팔콘 (피셔)	877,229
HyClone 리퀴드 미디어 DMEM/F-12 (1:1), L-글루타민과 HEPES로, 500mL	써모 과학 (피셔)	SH3002301
HyClone * 기증자 말 혈청	써모 과학 (피셔)	SH3007402
Inactivated 태아 소 혈청, 공인, 히트	Invitrogen	16140-063
cellgro * 10,000 IU 페니실린 10,000 μg / ML 스트렙토 마이신	Mediatech (피셔)	MT-30-002-CI
HyClone * L-글루타민, L 글루타민; 200.85 % NaCl에서 0mM	써모 과학 (피셔)	SH3003401
빠른 그린	어부	AC41053-0250	0.01 %