두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

요약

뉴런의 경험에 의존하는 분자 변화는 행동 문제에 대한 응답으로 적응하는 뇌의 기능에 필수적입니다. 생체 내 두 광자 이미징 방법은 유전자 인코딩 기자를 통해 개인의 대뇌 피질의 뉴런 이러한 분자 변화의 추적을 허용하는 여기에 설명되어 있습니다.

초록

경험에 대한 응답으로 변경하는 뇌의 능력은 건강한 뇌 기능을 위해 필수적이며,이 과정에서 이상이 뇌 장애의 ^1,2의 다양한에 기여합니다. 더 나은 뇌 회로가 동물의 경험에 반응하는하여 메커니즘을 이해하려면 라이브 동물에 시간의 연장 기간 동안, 뉴런의 주어진 집합의 경험에 의존하는 분자 변경 사항을 모니터링 할 수있는 능력이 필요합니다. 경험 및 관련 신경 활동이 뉴런 ^1,2에서 유전자 발현 변화를 실행하는 것으로 알려져 ^{있습니다하지만,} 방법의 대부분은 이러한 변화를 감지하는 것은 여러 일 동안 동일한 뉴런의 반복 관찰을 허용하지 않습니다 또는 개별 뉴런에게 ^3를 관찰하기에 충분한 해상도를 필요가 없습니다 ^4. 여기, 우리는 위에 각각의 대뇌 피질의 뉴런의 경험에 의존 유전자 발현 변경 사항을 추적하기 위해 유전자 코드 형광 기자와 두 광자 현미경 생체에 결합하는 방법을 설명 일상의 경험 코스입니다.

잘 구축 된 경험에 의존 유전자 중 하나는 활동 - 규제 cytoskeletal 관련 단백질 (아크) ^{5,6입니다.} 아크의 전사는 빠른 속도이며, 매우 심화 neuronal 활동에 ^{3 유도,} 그리고 단백질 제품은 glutamate 수용체 및 장기 시냅스 소성 ⁷ endocytosis를 규정한다. 아크의 표현이 널리 ³ 특정 행동에 참여 neuronal 회로를지도에 분자 마커로 사용되었습니다. 이러한 연구의 대부분에서 아크 표현식은 고정 뇌 섹션에 원위치 하이브리드 또는 immunohistochemistry에 의해 발견되었다. 이러한 방법은 아크의 표현은 아크 식의 세포 패턴 일 동안 반복적으로 또는 독특한 경험을 여러 에피소드와 함께 변경 될 수는 조사되지 않은 방법을 행동 경험, 이후 흥분성의 뉴런의 일부에 번역 된 것으로 밝혀 있지만. ntent는 "> 생체에서 두 광자 현미경은 살아있는 뇌 ^8,9의 경험에 의존 세포 변경 사항을 검토 할 수있는 강력한 방법을 제공합니다. 두 광자 현미경에 의해 라이브 뉴런의 아크 식의 검사를 활성화하려면, 우리는 이전에 생성 한 가짜을 마우스 줄에 GFP 기자가 내생 아크 프로모터 ^(10)의 통제하에 배치됩니다.하는이 프로토콜은 수술 준비와 라이브 동물의 neuronal ensembles 경험에 의존 아크 - GFP 표현 패턴을 추적 이미징 절차를 설명합니다.이 방법에서는 , 만성 두개골 창가 먼저 관심 대뇌 피질의 지역으로 아크 - GFP 마우스에 이식되었다. 그 동물 한 후 반복적으로 며칠 동안의 원하는 행동 패러다임 후 두 광자 현미경에 의해 이미징했다.이 방법은 수행 동물 일반적으로 적용 할 수 있습니다 다른 형광 기자 경험에 의존 분자 변경 ^4.

프로토콜

아래에 설명 된 실험 절차는 정신 건강 동물 관리 및 사용위원회의 국립 연구소에 의해 승인 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 있었다.

1. 사전 수술 준비

1. 무균 수술 전에 뜨거운 구슬 살균기에있는 모든 도구를 청소, 70 %의 에탄올과 수술 사이트를 청소하고, 깨끗한 드롭 옷을 내려 놓았다. 멸균 장갑을 착용한다. ML / g, intraperitonially 0.02에서 주어진 신선하게 조리 된 1.2 % avertin 솔루션과 동물을 마취. 또한, 수동 청소 회로와 코 콘, 유도 5 %, 유지 보수를 위해 1.5 %를 통해 isoflurane 가스로 마취. 전체 진정 작용을 보장하기 위해 꼬리 나 발가락 pinches을 사용하여 마취 수준을 확인합니다.
2. 멸균 안과 연고과 동물의 눈을 감아, 그리고 신선한 dexamethasone를 삽입 (0.2 밀리그램 / kg)와 carprofen (5 밀리그램 / kg) subcutaneousl뇌 붓기와 염증 ¹¹ 방지하기 위해 Y. 귀 사이의 머리 위에 머리를 면도하고, betadine 스크럽과 70 % 에탄올 세 번갈아 면봉으로 피부를 소독.
3. 37 동물 세트 아래의 물 순환 가열 패드와 함께 earbars와 stereotaxic 수술 단계에있는 동물을 마운트 ° C. 정기적으로 동물의 마취 수준을 확인하고 필요에 따라 원래 마취 복용을 보완.
4. 지역을 마비하기 위해 두피 피부에서 0.5 % Marcaine 200 μl를 삽입. 피부를 절개하고 두개골을 통해 피부 플랩을 제거합니다. 골막을 제거하고 깨끗한 면봉으로 지역을 건조.

2. 만성 두개골의 창 수술

1. 부드럽게 관심의 두뇌 영역을 통해 3~5밀리미터 직경의 원을 설명하기 위해 0.5 mm 버와 고속 치과 드릴을 사용합니다. 주기적으로 깨끗한 면봉과 멸균 0.9 % 생리와 치워 뼈 먼지와 시추 사이트를 젖었 어. 뼈가 흘러요 경우, g를 사용하여elfoam는 출혈을 가릴하고 중지 기다리 멸균 식염수에 presoaked.
2. 마지막 뼈 층에 도달하면 미세 스쳐 집게로 뼈 섬을 들고 제거합니다. 창 뼈 봉합을 교차하는 경우 뼈의 아래 칸에 경질 된 첨부 파일이 발생 될 수 있습니다. 뼈 플랩가 해제되기 때문에 이러한 부드럽게 제거해야합니다.
3. 롤은 표면을 청소하고 중지 할 경질 막 출혈을 기다리 노출 경질을 통해 부드럽게 젤 거품을 moistened 중요 단계를 :. 모든 경질 막 출혈이 멈췄을 때까지 진행하지 않습니다. 두개골 창 안에 갇혀된다 혈액은 일반적으로 불투명 한 창으로 연결됩니다.
4. 경질이 위의 경질을 제거, 특히 두꺼운 곳 관심 지역 위치에 따라 경우 필요할 수 있습니다. 이 경우 부드럽게 아주 좋아 포셉과 함께 아래의 피아에서 경질을 분리, 고급 집게 또 한 쌍의와 함께 해제 경질에 작은 절개를 한 후 절단 가장자리를 파악하고 부드럽게경질을 분할. 경질은 얇은하지만 강한이기 때문에, 경질의 손상 가장자리로 뇌를 갈라하지 마십시오.
5. 멸균 ACSF 또는 멸균 식염수 지역을 씻어.
6. . 경질 또는 PIA를 통해 멸균 유리 coverslip (3-5mm) 중요 단계를 놓는다 : 주변 두개골 곡선 크게하면, 경질 또는 PIA는 지역의 coverslip과 긴밀한 접촉을하지 않을 공간을 채워 Kwiksil ¹² 접착제를 사용하여 그는 이미징되지 않습니다.
7. 탄성 접착제와 유리 coverslip의 가장자리를 충당하기 위해 시아 노 아세틸렌 젤을 사용합니다. . 모든 시아 노 아세틸렌 젤은 뇌 표면을 만지지을 허용하지 않음 : 시아 노 아세틸렌 젤, 또는 krazyglue 및 치과 시멘트 혼합물로 전체 노출 두개골 중요 단계를 다룹니다.
8. 두개골의 반대편에서 주문 제작 금속 헤드 고정 막대를 삽입 할 수 있습니다.
9. 케토 프로 펜의 intraperitonial 주입, 5 밀리그램 / kg, 강한 후, 따뜻한 복구 챔버에 동물을 반환R 통증 관리. 두 일 후 operatively에 대한 진통제를 계속합니다.
10. 수술 회복 2 주 후, (유도 5 %, 유지 보수를 위해 1.5 %) isoflurane과 동물을 마취, 머리 고정 프레임과 주문 제작 현미경 단계에 마운트, 광학 명확성을 위해 두개의 창을 확인 푸른 빛 조명 아래에서. 뇌 표면 혈관 투명도는 두개의 창 품질 높은 나타내는 것입니다. 혈관 가장자리가 급격하게 정의하는 경우, 창은 사용 가능한이 될 수 있습니다. 두 주 후 수술 회복 시간은 수술에서 회복 할 수있는 동물에 대한 충분한 시간을 허용하는 것이 좋습니다. 두개골의 창은 일반적으로 삭제하고 개선이 기간 동안, 그리고 경질의 두개골이나 증점 안정제의 regrowth는 윈도우의 품질을 떨어까지 개월 추가 주 동안 광학 투명 남아 있습니다.

3. 투 광자 현미경을 스캔 행동 프로토콜 및 레이저

1. 맑은 c와 동물ranial 창은 환경 자극에 노출 또는 행동 교육 세션을 받게 한 후 최대 아크 - GFP 표현시 이후 이미징 될 것입니다. 행동 프로토콜을 시작하기 전에 동물이 기준 아크 - GFP 표현 수준에 매일 변화를 최소화 할 수있는 일관성있는 가정 케이지 환경에서 보관해야합니다.
2. 관심 뇌 지역에 따라, 행동 훈련 또는 환경 적 자극의 패러다임을 시작합니다. 예를 들어, 동물 연속 일 동안 다른 시각적 환경에 노출 될 수 있으며, 시각 피질에 ¹⁰ 자극 - 특정 응답을 식별 할 시각적 인 자극 후 매일 이미징.
3. 뉴런의 아크 - GFP 형광은 일반적으로 이시간 자극 후 전성기 수준에 도달합니다. 실험 타임 라인은 자신의 최대 형광 수준에서 뉴런의 아크 - GFP 표현의 검출을 용이하도록 최적화 할 수 있습니다.
4. 행동 교육 세션이나 environmenta 후난 자극이 완료 (유도 5 %, 유지 보수를 위해 1.5 %) isoflurane과 동물을 마취하고 두 광자 현미경으로 머리 고정 프레임으로 맞춤 제작 현미경 단계에있는 동물을 탑재합니다.
5. 동물의 머리 위치는 두개골에 이식 금속 막대를 사용하여 스테이지에 직접 연결 헤드 고정 프레임에 고정되어 있습니다. Isoflurane과 산소가 계속 코 콘을 통해 마우스에 공급하고 있습니다. 바디 온도는 가열 패드를 사용하여 유지됩니다.
6. 현미경 감지기는 어두운 방에있는 두 광자 레이저 스캔을 실시하여 주변 광으로부터 보호되어 있는지 확인합니다. 이미징을위한 20x 또는 25x (1.05 수치 조리개) 물 침지 렌즈를 사용합니다. 첫째, 에피 형광 조명 아래, 미래의 이미지 정렬을위한 CCD 카메라와 관심의 뇌 영역에 걸쳐 표면 혈관 패턴의 이미지를 획득.
7. 3-D 이미지 스택을 얻기 위해 스캔 두 광자 레이저를 시작합니다. 올림푸스 FV1000MPE 다중 광자 현미경은 우리의 설정에 사용됩니다. 두 광자 레이저의 여기 파장 길이는 920 nm의에서 설정하고, 목표에서 방출 레이저의 힘은 약 50 MW로 설정되어 있습니다. 방출 형광 동시에 표본에 가까운 위치 외부 2 채널 photomutiplier 탐지 시스템을 사용하여 녹색과 빨간색 채널 (570 nm의에서 이색 성 거울, 495-540 nm의 및 570-625 nm의에서 차단 필터)에서 검출된다. 조직 자동 형광이 채널 ^{13, 14} 모두에 나타납니다 반면, 아크 - GFP 형광 만 녹색 채널에 나타납니다.
8. 일반적인 이미지 스택은 약 320x320x100 μm의 크기 (너비 x 길이 X 깊이), 0.5 μm / 픽셀의 수평 해상도, 3 μm / 픽셀의 수직 해상도를 갖추고 있습니다.
9. 이미지 스택을 인수 후에는 홈 케이지에 동물을 반환합니다. 다음 행동 및 이미징 세션까지 동물을 방해하지 마십시오. desir으로 일에 걸쳐 행동 및 이미징 절차를 반복거구나. 다시 같은 이미징 위치에 방향에 이전에 취득한 뇌 표면 혈관 이미지를 사용합니다.

결과

이 프로토콜은 살아있는 동물에서 개별적으로 대뇌 피질의 뉴런의 경험에 의존하는 분자 변경 사항을 추적 할 수있는 방법을 설명합니다. 만성 두개골 창이 먼저 유전자 표현의 형광 기자를 들고 마우스에 관심이 대뇌 피질의 영역으로 생성됩니다. 두 광자 현미경 그런 다음 각각의 뉴런에 behaviorally 유도 분자 변화를 관찰하고 여러 일 동안 뉴런의 같은 세트에서의 변경 (그림 1)을

토론

생체 이미징 방법에 여기에 설명 된 라이브 동물의 여러 일 동안 뉴런의 같은 세트에서 아크 유전자 발현의 변화 반복 시험을 할 수 있습니다. 그것은 다양한 행동 경험에 대한 응답에서 개별 뉴런의 신경 소성 관련 분자 역학에 대한 정보를 얻을 수있는 효율적이고 다양한 방법입니다. 이러한 현장 하이브리드 화 및 immunostaining의 표준 histochemical 방법은 해상도 ^{3 개?...}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
장비의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
FV1000 다중 광자 레이저 스캐닝 현미경	하늘	FV1000MPE	영상
해부 현미경	Omano	555V107	외과
마우스 Stereotaxis 수술 단계	하버드 장치	726335	외과
20X 또는 25X 물 침지 목표	하늘	XLPL25XWMP	영상
머리 고정 프레임과 현미경 단계	사용자가 만든	N / A	영상
좋은 포셉	정밀 과학 도구	11251-20	외과
치과 드릴 버	정밀 과학 도구	19007-05	외과
CCD 카메라	QImaging	QICAM 12 비트	영상