Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

요약

이 기술은 이전 포유류의 세포의 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 세포에 미리 재배되고 세균 병원균의 세포 성장을, 수확 정상화하고 계량화 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 메소드는 프라이밍 단계뿐만 아니라 대상 셀 유형에 대한 호스트 세포의 다양한 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

초록

대부분의 세포 내 세균 병원균이 있습니다. 환경에서 확산을위한 자연 저수지로 민물 protozoans를 사용하여 Legionella pneumophila, 부대 '폐렴의 원인이되는 에이전트는 먼저 이전 포유류의 대 식세포의 감염 protozoan 세포에서 수확 체외 배양 균에 비해 병원성 이점을 얻게되었습니다. 이 중요한 독성 요소가 제대로 체외로 표현되지 않을 수 있습니다 제안합니다. 우리는 프라이밍 L.위한 다루기 쉬운 시스템을 개발 포유류의 세포 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 Acanthamoeba castellanii을 통해 pneumophila 사전. 모든 독성 요소의 기여는 protozoan의 프라이밍 후 야생 형 박테리아에 돌연변이 변종의 세포 성장을 비교하여 검사 할 수 있습니다. GFP-표현 야생 타입과 돌연변이 L. pneumophila의 긴장은 프라이밍 단계에서 protozoan monolayers를 감염하는 데 사용과 세포 성장의 후반 단계에 도달 할 수 있습니다. 형광 박테리아는 다음이 감염된 세포를 채취와 포유류의 대 식세포에 후속 감염 박테리아의 비교 숫자를 생성하는 분광 광도법에 의해 표준화되어 있습니다. 정량화를 들어, 라이브 박테리아는 형광 현미경, 유동 세포 계측법, 그리고 식민지 도금하여 사용 감염 후 모니터링됩니다. 이 기술은 강조하고 자연 수집 경로에 발생 될 환경을 모방하여 호스트 세포에 의존 유전자 발현의 기여에 의존하고 있습니다. 이 방법은 병원성 우위를 확보하기위한 수단으로 중간 호스트를 사용하는 세균을 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

서문

수많은 세균 병원체는 세포 내 구획의 생존과 복제 호스트 세포를 이용하기 위해 일반화 된 전략을 적응하고 있습니다. 많은 경우, 병원성 메커니즘은 protozoan과 metazoan 세포 사이의 비슷합니다. 그러나,이 두 microenvironments은 매우 다른과 독성 요인 ^1-4의 미분 표현 될 수 있습니다. 이 부대 '병 박테리아 Legionella pneumophila는 ubiquitously ⁵ 전 세계적으로 담수 환경과 연결되어 있습니다. 중요한 것은, L. pneumophila는 유전자 ^6-8을 재배에서 체외보다 다른 protozoan 셀을 종료 세균의 글로벌 유전자 발현 프로파일을 제안, 인간 단핵 세포 병원성 이득의 감염 이전에 protozoan 세포에서 재배. 자연에서 민물 amoebae는 침입 세균의 급속한 확대를 위해 영양이 풍부한 굴레를 제공합니다. L. 인간의 취득 pneumophila는 대개 세균을 포함 오염 된 물방울의 흡입에 따라 결정됩니다. 그것은 가능성이 이러한 방울 항구 protozoan 세포 관련 세균이, protozoan 전지는 기존의 수처리 관행 ^9,10에 더 강한 위치. ^11-13 protozoan 호스트 세포에서 세균의 세포 수명주기와 거의 동일한 방식으로 폐 폐포 대 식세포 진행의 감염.

생존과 진핵 세포에서 복제하기 위해, L. pneumophila 다트 / ICM은 숙주 세포 ^14-16의 세포 기질에 거의 300 '이펙터'단백질을 제공하는 칭했다 전문 유형 IVb 분비 시스템을 사용합니다. 이러한 효과기 단백질은 집합 적으로 세균 ^17,18의 복제 허용 구획을 생성하기 위해 셀룰러 프로세스를 파괴하는 기능을 수행합니다. 세포 복수에 결함이있는 변종의 점 / ICM 전송 결과를 구성하는 26 유전자의에서 삭제iplication ^19-23. 역사적으로, 개별 이펙터 인코딩 유전자의 삭제는 거의 세포 성장을위한 감쇠 변종이 발생하지 않습니다. 이러한 현상은 중복 기능과 effectors의 paralogous 사본 등 여러 가지 가설에 기인되었습니다.

일부 독성 요소는 호스트 세포 관련 세포 성장 ^(24)의 맥락에서 표현됩니다. 우리는 특정 이펙터 만 protozoan 감염의 맥락에서 표현 된 경우, 이펙터의 노력이 모두 체외에서 배양 된 야생 타입의 변형과 비교되지 않을 수 rationalized. replicative에서 투과성 단계로 L. pneumophila는 전환이 문화 ²⁵ 고정 단계에 들어가면서. 위상 전환 표현형은 세포 성장을하는 동안 발생 및 운동성 ²⁶ flagella의 조립을 통해 예시되어있는 영양소를 고갈를 나타냅니다. 때문에 L. pneumophila 더 inva입니다protozoan 세포에서 수확 때 sive 및 악성, 우리는 호스트 대 식세포가 발생 될 때 더욱 충실 세균의 병원성 상태를 표현하는 검정을 개발을 모색하고 있습니다.

이를 위해, 우리는 첫 번째 (프라이밍 세포)와 두 번째 (대상 셀) 무대 감염 모두에 대한 적절한 호스트를 수용 할 수있는 다목적 protozoan의 프라이밍 분석을 개발했습니다. 감염 과정은 안정적으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 박테리아의 사용을 통해 다루기 쉬운 것입니다. protozoan Acanthamoeba castellanii의 감염 모델은 널리 필드에 ^27에서 사용되는 방법론을 따른다. 프라이밍 단계 L.에게 들어 pneumophila의 긴장이 표시 '투과성'박테리아를 (그림 1A) 생산 액체 미디어에 고정 단계로 체외에서 재배되고있다. 박테리아는 다음 A.의 monolayers를 감염하는 데 사용됩니다 castellanii 18 시간 동안 세포 생활주기의 후반 단계를 달성합니다. 대형 액포가 포함되어ING 박테리아는 형광 현미경 (그림 1A)를 사용하여이 시점에서 시각화 할 수 있습니다. Protozoan 전지는 다음 lysed되고 lysate에서 발견 한 박테리아는 형광 플레이트 리더를 사용하여 512 nm의에서 방출 측정합니다. 형광은 타겟 세포의 감염 (그림 1, * 상관 관계 곡선)에 대한 다중성 수준의 감염 (나 역시)를 계산하는 광학 밀도와 상관 있습니다. 침공 (T ₀₎ 18 시간 후 침공 (T ₁₈₎ 후, 대상 세포는 세포 내 박테리아를 대표하는 형광에 대한 평가합니다. 형광은 현미경과 유동 세포 계측법에 의해 모니터링 할 수 있으며, 가능한 카운트는 식민지 도금을 통해 측정 할 수 있습니다. 프라이밍 분석은 항상 야생 형 L.과 감염에 의해 동반 pneumophila 및 도트 / ICM 유형 IV 분비 시스템 (Δ dotA) (그림 1A)에 결함이 부담. 이 중요한 야생 형 사이의 직접 비교에 대한 내부 통제를 제공합니다감염 과정에 사용되는 차있는 isogenic 돌연변이 변종. 프라이밍 단계 동안 avirulent Δ dotA 변형의 포함은 체외에서 배양 아르 isogenic 돌연변이 변종과 관련된 감쇠 성장 phenotypes의 관찰에 대한 임계 값을 설정합니다.

프로토콜

1. 프라이밍 단계 감염에 대한 Legionella pneumophila의 문화의 작성

1. 모든 L. 변환 이소 프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 인코딩 플라스미드 pAM239과 분석에 사용 pneumophila의 변종은 녹색 형광 단백질 (GFP) ²⁸ inducible. 연속은 철과 시스테인로 박테리아 변종은 숯불 효모 추출물 한천 (CYEA)는 6.25 μg / ML chloramphenicol (CM) (플라스미드 유지 보수 용)과 72에 품다를 포함하는 버퍼 N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic 산을 (ACES) 보충 37 번 시간 ° C.
2. 보충 ACES에 박테리아 스트레인의 inoculum는 6.25 μg / ML의 CM과 1 밀리미터 IPTG로 (예) 효모 추출물의 국물을 버퍼 전송 37에 궤도 셰이커에 고정 단계 (O / N)으로 육성 ° C.
3. 형광 현미경을 사용하여 체외 문화에서의 GFP 발현을 확인합니다. 덮개를 유리 슬라이드에 문화의 10 μl를 전송슬립와 GFP의 여기 / 방출 큐브 (AMG EVOS 층)와 60X 목적을 사용하여 이미지입니다.
4. 멸균 H ₂ O를 사용 1시 10분에 체외 문화의 각 100 μl 나누어지는을 희석 1 ㎜의 IPTG, 6.25 μg / ML의 cm 물과 빈 네 100 μl를 사용하여 미디어를 확인합니다. 분광 광도계를 사용하여 dilutions의 OD600 측정 (바이오 RAD 스마트 사양 플러스)를보십시오. 체외 문화에 각각에 대해 나 역시 = 20에서 잘 감염에 볼륨이 필요한 계산 : V = [(아메바 시드) × - 나] / [OD ₆₀₀ X (희석 계수) × (상수)] = [(1 X 10 ⁶ ) × (20)] / [OD ₆₀₀ X (10) X (1 × 10 ^6)] = 2/OD _600. 박테리아의 농도는 OD _600에 따라 결정된다 = 1.0 = 1 × 10 ⁹ CFU / ML.

2. Acanthamoeba castellanii를 사용하여 프라이밍 단계 감염

1. 유지 RT에서 175cm ^두 플라스크에 ATCC 712 PYG 매체에 amoebae을 배양.
2. amoebae 막에서 미디어를 교체tures 박테리아 액체 문화를 시작하기 전에 24 시간. 같은 날 액체 박테리아 문화가 시작되며, 수집하고 hemocytometer를 사용하여 가벼운 현미경에 셀을 계산합니다.
3. 1 개 10 ⁶ 세포 / ML의 최종 농도에 새로운 미디어 amoebae을 희석. amoebae 1 ML의 aliquots로 씨는 12도 세포 배양 접시 RT O / N.에서 반복 pipettor과 품다를 사용하여
4. 부화 후, 1 ML 멸균 PBS는 10 ML 혈청 학적의 피펫과 피펫 수동 보조를 이용한 3 배 12도 세포 배양 플레이트의 우물을 씻는다.
5. PBS의 흡인 후, 1 ㎜의 IPTG와 각도에 6.25 μg / ML cm로 감염 미디어 (ATCC 712 PYG 미디어 마이너스 포도당, 펩톤, 그리고 효모 추출물)의 1ml를 추가합니다. 1 시간에 RT에있는 접시를 품다.
6. 나 역시 = 20에서 우물을 감염. 5 분 (Eppendorf 5810R) 400 XG에서 판을 원심 분리기 5 분에 37 ° C의 물을 욕조에 떠. 37 ° C, 18 시간에 대한 5퍼센트 CO ₂ 인큐베이터로 판을 전송합니다.
7. 박테리아의 세포 용해와 수확을 호스트하기 전에 형광 현미경에서 라이브 셀 이미징을 사용하여 감염을 확인합니다.

3. 대상 셀 무대 감염에 대한 THP-1 세포을 퍼 뜨리고

1. (사전 액체 박테리아 문화를 설정하고이 과정을 24 시간을 시작합니다). 10% 열 inactivated 태아 소 혈청 (FBS)와 RPMI 1640 미디어 가까운 confluency에 75cm ^두 문화 플라스크에 THP-1 세포를 배양.
2. hemocytometer를 사용하여 정지 세포 수를 계산, 1 × 10 ⁶ 세포 / ML의 농도 10 % FBS, 100 NG / ML phorbol-12-myristate-13-아세테이트 (PMA)를 RPMI 1640 미디어 THP-1 세포를 희석 , 및 12도 세포 배양 접시에 1 ML aliquots에서 판. 37 48 시간의 번호판을 길러 ° C, 5 % CO _2.

4. 프라이밍 단계 감염 후 대상 셀 무대 감염 박테리아의 처리

1. 중이오 amoebae에서 미디어를 대기음.
2. 를 Lysemoebae는 10 분 동안 RT에서 얼음 차가운, 멸균 초 필터링 (UF) H ₂ O와 품다 500 μl을 사용합니다.
3. 풀 유형을 변형하고 형광 플레이트 리더를 (분자 장치 Spectramax 쌍둥이 EM)을 사용하여 풀링 된 lysates 각각에 대해 E _{512 nm의 측정을에} 따라 lysates.
4. - + 0.0019 calcOD ₆₀₀ = 0.0008 (lysate 배경 E ₁₀₂₄₎ : 풀링 된 lysates에 대한 OD ₆₀₀ 측정을 계산합니다. 수식이 이전 OD ₆₀₀ L.의 dilutions의 E _{512 nm의 측정을} 모두 직접 비교를 그래프화할 수에 의해 결정되었다 체외 문화에 고정 단계 (그림 1 *)에서 pneumophila는 야생 타입의 표현 GFP. 감염된 아메바와 같은 실험 조건에 따라 감염되지 않은 아메바의 lysates은, 빈로 사용 방정식에 포함 된 보정 값 (예를 들면 lysate 배경) 제공됩니다. 볼륨 필요한 t에서 잘 감염 O - 나 = 20 각 lysate 수영장에 대해 계산됩니다 V = [(THP-1 시드) × - 나] / [calcOD ₆₀₀ X (상수)] = [(1 X 10 ⁶⁾ X (20)] / [calcOD ₆₀₀ X (1 × 10 ^6)] = 20 / calcOD _600.
5. PBS로 3 배 THP-1 세포를 씻어 각도에 1 ML 신선한 RPMI 1640을 (10 % FBS)를 추가합니다. 37 번 1 시간에 품다 THP-1 세포 ° C, 5 % CO _2.
6. 풀링 된 lysates를 사용하여 - 나 계산에서 THP-1 세포를 감염. 우물 일련의 흐름 cytometric 분석을위한 대조군으로 제공 감염되지 않은 상태로 유지 할 수 있습니다. 프라이밍 단계의 처리는 이하의 30 분에 완료해야합니다. lysates는 감염되기 전에 박테리아 유전자 발현의 변화를 제한하는 얼음에 보관됩니다.
7. 판을 원심 분리기, 온도를 높이 떠 있으며, 프라이밍 단계에서와 같이 품다.
8. 한 시간 후 감염, 흡인하여 미디어를 제거하고 세포 박테리아를 제거 할 수 PBS로 3 배 우물을 씻는다.
9. fre 1 ML을 추가쉬 RPMI 우물에 1,640 (10 % FBS)과 보육에 판을 반환합니다. 바로 미디어 교체 후 시간은 시간 제로 (T ₀₎ 역할을합니다. 37 14-16 시간의 THP-1 세포를 배양 ° C, 5 % CO _2.

5. 실험 분석

5.1 라이브 셀 이미징

감염된 10X에서 형광 현미경 (AMG EVOS 층)를 사용하여 우물 또는 20X 배율 (그림 1A-D) 이미지. 이미지는 프라이밍 단계 및 대상 셀 무대 감염 모두에서 감염의 수준을 결정하는 중 질적 또는 양적 비교할 수 있습니다.

5.2 유동 세포 계측법

1. 다른 감염의 방출 봉우리는 유동 세포 계측법 (BD FACS Calibur)로 비교할 수 있습니다. 감염된 THP-1 세포를 Trypsinize 부드럽게 피펫으로 PBS에 혼합하여 우물에서 그들을 씻어.
2. 2 1800 XG 15 ML 팔콘 튜브 및 펠렛에 풀 변형 유형으로 세포를테이블 탑 원심 분리기에 분.
3. 1 ML PBS에서 알약을 일시 중지하고 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 전송할 수 있습니다.
4. 1800 X g (Eppendorf 5424)에서 중지를 원심 분리기 1 ML PBS에서 산탄에게 다시 일시 중지합니다. 결과 현탁액이 높은 흐린 경우 (OD ₆₀₀ ≥ 1.0) 사람들은 흐름 cytometer의 라인 막힘을 방지하기 위해 추가 PBS (1시 3분)에 희석해야합니다.
5. 흐름 cytometer의 평균에 대한 및 샘플 주사 사이의 세척 단계 살균 필터 PBS를 사용합니다. 이전 대상 셀 감염 샘플의 주입에 감염되지 않은 대상 세포의 전진 /면 분산시킵니다.
6. 488 nm의 레이저 여기와 FL1 채널을 사용하여 각 조건에 대해 총 20,000 이벤트를 수집합니다.
7. 게이트 포스트 캡처 전지 인구는 감염되지 않은 세포와 막대 그래프의 플롯 형광 강도 (FlowJo) (그림 1E)를 제외 할 수 있습니다.

5.3 CFU 도금

1. 효율성 O를 검사유동 세포 계측법에 수확 세포의 CFU 도금에 의해 F 감염. 초 필터링 H ₂ 10 ^-1에서 O, 10 ^-2, 10 ^-3에서 샘플 시리얼 dilutions을 준비합니다.
2. 6.25 μg / ML의 CM 각 희석 CYEA 판의 1 / 3로의 플레이트 20 μl.
3. 72 시간에 37 ° C에서 접시를 품다.
4. 이쑤시개와 셀 카운터를 사용하여 식민지를 계산합니다.

결과

전체 감염 프로세스에 대한 일반적인 결과는 그림 1에 설명되어 있습니다. 야생 형 L.에 감염된 A.castellanii의 monolayers을 그린 셀 형광의 micrographs 라이브 프라이밍 단계 동안 pneumophila는 그림 1A에 표시됩니다. 프라이밍 단계의 성공적인 측정이 전부다에서 GFP이라는 세균으로 채워 큰 액포를 포함하는 호스트 세포의 약 90 %의 인구로 이어질 것입니다. 18 ?...

토론

박테리아 유전자 발현이 밀접하게 생활주기의 진행과 주변 microenvironment의 신호에 응답의 조합을 통해 제어됩니다. 이러한 L. 같은 Vacuolar 병원균 phagosome에 compartmentalized 때 pneumophila는 호스트 세포 유래 단서의 다양한 응답 할 수 있습니다. 숙주 세포에 영양소를 고갈의 집단 결과, 세균은 이후 숙주 세포 ²⁵ 성공적인 배포에 필요한 요소를 표현하여 보상. L.는 pneumophila 효율...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
chloramphenicol	Fisher Scientific	BP904-100	antibiotic
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
ACES	Sigma	A9758-1KG	media component
ATCC medium: 712 PYG	ATCC		growth media for protozoans
1X PBS	Fisher Scientific	SH30256FS	phosphate buffered saline
activated charcoal	Fisher Scientific	C272-212	media component
yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500	media component
peptone	BD Diagnostics	211677	media component
agar	Fisher Scientific	BP1423-2	media component
L-cysteine, 99%+	Acros organics	173601000	media supplement
Ferric nitrate nonahydrate	Fisher Scientific	I110-100	media supplement
Equipment
EVOS fl	AMG	EVOS fl	fluorescence microscope
Smart Spec Plus	Bio-Rad	170-2525	spectrophotometer
5810 R centrifuge	Eppendorf	22627023	bench top centrifuge
Repeater plus	Eppendorf	22230201	repeating pipette
SpectraMax Gemini EM	Molecular Devices		microplate reader
Softmax Pro 5.3	Molecular Devices	0200-310	microplate reader software
5424 microfuge	Eppendorf	22620401	table top microcentrifuge
Fast-release pipette pump II	Scienceware	379111010	pipette aid
FACS Calibur	BD Bioscience		flow cytometer
FlowJo 7.6.1	FlowJo	license	flow cytometery software
15 ml tube	BD Falcon	352096	polypropylene conical tube
1.6 ml microfuge tube	Neptune	3745.X	microcentrifuge tubes