CometChip : Microarrayed 인간의 세포에서 DNA 손상을 측정하기위한 높은 처리량 96 글쎄 플랫폼

요약

여기서 전례 처리량 DNA 손상 혜성 분석 검출 할 수있는 플랫폼을 설명한다. 장치 패턴 마이크로 어레이에 포유 동물 세포와는 96 샘플의 병렬 처리를 할 수 있습니다. 접근법은 기본 레벨 DNA 손상, 노출 유도 DNA 손상 및 DNA 수선의 동력학 분석을 용이하게한다.

초록

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The ‘CometChip’ is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

서문

단일 세포 겔 전기 영동 (혜성 분석 일명) (SCGE) 분석은 기본 병변, abasic 사이트, 한 가닥 나누기, 이중 가닥 나누기, 가교 민감한 알칼리를 포함하여 DNA 병변의 광범위한 스펙트럼의 정량 널리 사용되는 기술이다 사이트. 분석의 기본 원리는 손상된 DNA가 손상되지 않은 DNA 이상으로 인해 분열과 superhelical 구조의 손실을 더 쉽게 마이그레이션 것입니다. 이동의 범위는 DNA 손상의 양에 비례하고, 형광 현미경을 이용하여 가시화 할 수있다. 이미지 캡처 및 개별 혜성 형 DNA의 강도 프로파일 분석은 세포 ^1-4 내 DNA 손상의 레벨을 나타 내기 위해 꼬리 같은 꼬리 길이, 꼬리 모멘트와 % DNA와 같은 파라미터 측정을 제공한다.

) 알칼리 혜성 분석 및 b)는 중립 혜성 분석 : 현재 혜성 분석의 널리 사용되는 두 가지 버전이 있습니다. 알칼리 혜성 분석은 가장 널리이며따라서 전기 영동 전에 DNA를 긴장을 높은 pH 버퍼를 사용하고 사용 된 버전은, 스트랜드 나누기 및 알칼리 성 사이트의 모든 유형을 검출한다. 이 이중 나선을 유지하고 오직 이중 가닥 나누기 ^{2,5 검출} 중성 버퍼를 사용하고 있기 때문에 중성 혜성 분석은, 다른 한편으로는, 이하 실행된다. DSBs을 유도하는 화학 물질 및 물리적 인자의 경우, SSBs가 콘서트에서 생성되고, 훨씬 더 높은 수준에서 형성된다 (예를 들어, γIR 유도 SSBs은 DSBs보다 일반적인 크기 순서입니다). 대부분의 DNA 손상 노출의 경우, DSBs 훨씬 덜 자주 DNA 손상의 다른 클래스보다, 따라서 감지하기 어렵습니다. 우리는 이전의 공보에 두 버전의 검출 창을 증명하고있다. ^6,7

혜성 분석 일상적 DNA 손상과 수리 및 유전 독성 시험 ^1,2,8-15에 대한 기초 연구를 위해 사용되었지만, 분석 인해 시료 대에 재현성이 나쁨을 갖는보고되었다샘플, 개인 대 개인 및 실험실 사이 변화. 이미지 수집 및 데이터 분석이 힘들고 때문에 또한, 분석은 낮은 처리량 부분이다. 함께, 이러한 제한은 대규모 연구에서 비교적 낮은 수용에 기여한다. 엔지니어링 기술과 원리의 통합을 통해 CometChip 전통적인 혜성 분석 ^6,7과 관련된 처리의 문제와 모순에 대한 해결책을 제공합니다. 요약하면, 칩을 만드는 데, 주형은 하나의 셀만큼 작은 직경 microposts을 만드는 포토 리소그래피를 이용한 마이크로 제조된다. 몰드이어서 겔 응고 후의 마이크로 웰 어레이 결과 용융 아가 로즈에 도장하는데 사용된다. 칩은 서로 다른 세포 유형과 호환 가변 크기의 우물 연구자를 제공하기 위해 개발되고있다. 칩을로드하려면, 미디어 세포가 중력에 의해 우물에 정착 할 수있다; 여분의 세포를 씻어됩니다. 포획 된 세포는 우리를 캡슐화저 융점 아가로 오스의 얇은 층을 보내고, 및 바닥이 96 웰 플레이트이어서 그 바닥 표면에 마이크로 웰 수백 96 macrowells 각을 만드는 겔 표면에 클램프한다.

이 프로토콜은 겔 준비, 셀 로딩, 투약 및 수리, 세포 용해, 전기, 형광 이미징을 포함이 칩 실험에 대한 일반적인 절차에 대해 설명합니다. 우리는 알칼리 각각 분석의 중립 버전을 사용하여, 공지 된 DNA 손상 제에 노출 lymphoblast 세포와 투여 량 반응 실험의 두 가지 예를 보여준다. 두 수리 실험은 또한 보수 반응 후 노광 시스템을 사용하여 평가 될 수있는 방법을 설명하기 위해 도시된다.

프로토콜

칩의 1 준비

1. 아래로 한 웰 직사각형 플레이트, 겔 필름 측에 패키지와 장소에서 칩 젤을 제거합니다.
2. 두 번 반복, 15 분 동안 PBS 1X 25 ㎖에 젤을 씻으십시오.
3. 유리 접시 이에 따라 겔의 라벨 방향에 설정 젤.
4. 부드럽게 젤 위에 거꾸로 바닥이 96 웰 플레이트를 누르십시오; 바닥이 아니라 판의 모든 우물이 젤의 영역 내에 있는지 확인하십시오.
5. 유리 클램프를 고정하는 플레이트의 각 측면에 1.5 ''바인더 클립을 사용합니다.
6. 과량의 PBS 대기음 각 웰에 버퍼.

2로드 셀

1. 세포 현탁액을 준비합니다 :
   1. 현탁 세포주, / ㎖ ⁵ 10 -10 ⁶ 세포의 최종 농도를 얻기 위해 용지로의 세포 현탁액을 희석한다.
   2. 자기편 세포주를 들어, 일반 착탈 / 트립신 프로토콜 및 D를 수행⁵ 10 -10 ⁶ 세포 / ml의 최종 농도로 매질에서 분리 된 세포를 ilute. 세포가 응집하면, 단일 세포 현탁액을 수득 셀 필터에 세포 현탁액을 통과한다.
2. 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액 100 ㎕를 추가한다.
3. 겔 필름과 커버 플레이트는 매체의 증발을 방지 할 수있다.
4. 세포가 37 ° C 배양기에서 적어도 30 분 동안로드 할 수 있습니다.
5. 각 우물에서 보육 및 흡인 미디어에서 칩을 제거합니다.
6. 바인더 클립과 바닥이 96 웰 플레이트를 제거; 각도로 유리 접시와 칩을 잡고 조심스럽게 아가 로스에 여분의 세포를 제거하는 1X PBS로 씻어.
7. 4 배 대물 렌즈와 밝은 필드 현미경을 사용하여 셀 로딩을 확인합니다. 불충분 로딩이 관찰되면, 단계 2.1로부터 반복한다.
8. 심지어 표면 (실험실 벤치)에로드 된 칩을 놓습니다. 이다 1 % 저 융점 (LMP) 아가로 오스와 오버레이 칩 37 ° C에서 사전은 따뜻하게. 약 사용 2̵일] LMP 아가 3 ㎖를 각각의 칩에 대해 필요하다.
9. 오버레이가 3 분 동안 실온에서 첫번째 공고히하고 완전한 겔화 5 분 동안 4 ° C 냉장고로 이동 할 수 있습니다.

3 분배 및 복구

참고 : 기본 DNA 손상 레벨을 공부 4 단계로 건너 뜁니다.

1. 조심스럽게 새로운 바닥이 96 웰 플레이트의 우물로 (이전 클램핑에서 생성) 칩의 우물을 맞 춥니 다. 다시 키를 누릅니다 바인더 클립 상단과 안전한 클램핑에 바닥이 96 웰 플레이트.
2. 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 원하는 양의 화학 물질 100 ㎕을 추가; 얼음에 또는 시간의 원하는 금액을 4 ° C 냉장고에 투약 / 치료를 수행합니다.
3. 물론 각에서, 흡인 화학 물질을 투여하고 1X PBS를 사용하여 잔류 화학 물질을 멀리 씻어 후. 직접 피해가 여기에 공부하는 경우, 4 단계로 진행합니다.
4. 에서 복구하는 칩에 세포를 수리 동역학을 연구 허용하려면37 ° C에서 미디어. 를 Lyse 특정 시점에서 (4 단계로 진행).
   NOTE : 수리 부착 밑 96 웰 플레이트와 함께 온칩 (on-chip)으로 수행 될 수 있거나, 칩 밑 96 - 웰 플레이트의 제거 후 별도의 조각으로 절단 될 수있다.

(4) 용해

1. 알칼리 혜성 분석을 수행하려면 :
   1. 1 % 트리톤 X-100 용해 스톡 용액 (2.5 M의 NaCl, 100 mM의 EDTA ₂ 나트륨, 10 mM 트리스, pH가 10)를 첨가하여 알칼리성 알칼리 용해 완충액을 작동 확인. 각 칩에 대한 용해 버퍼 작업의 약 25 ML을 준비합니다.
   2. 4 ° C에서 알칼리 용해 버퍼 작업 사전 진정.
   3. 멋진 작업 알칼리 용해 버퍼 칩 잠수함 및 용해가 4 ° C 냉장고에서 O / N을 수행 할 수 있습니다.
2. 중립 혜성 분석을 수행하려면 :
   1. 중립 용해 스톡 용액 (2.5 M의 NaCl, 100 mM의 EDTA ₂ 나트륨, 1 % (10)에 트리톤 X-100 및 10 %의 DMSO을 첨가하여 중성 용해 완충액을 작동 확인mM 트리스, 1 % N -Lauroylsarcosine, 산도 9.5). 각 칩에 대한 용해 버퍼를하면 약 25 ML을 준비합니다.
   2. 43 ° C에서 중립 용해 버퍼 작업 전 따뜻한.
   3. 따뜻한 작업 중립 용해 버퍼 칩 잠수함 및 용해가 43 ° C 배양기에서 O / N을 수행 할 수 있습니다.

(5) 전기 영동

1. 알칼리 혜성 분석을 수행하려면 :
   1. 1X PBS로 칩을 씻어 신속하게 용해 버퍼를 제거하고.
   2. 겔 필름 측이 양면 테이프를 이용하여 아래로 향하게하여 전기 영동 챔버 내의 보안 칩.
   3. 4 ° C 차가운 방에 챔버를 가져와.
   4. 그냥 젤을 커버하는 수준으로 차가운 알칼리 전기 영동 버퍼 (0.3 M의 NaOH, 1 ㎜ 나 ₂ EDTA)와 챔버를 입력합니다.
   5. 40 분 동안 알칼리 풀기 허용합니다.
   6. 1 V / cm와 차가운 방에서 30 분 동안 300mA에서 전기를 실행합니다. 차에 전기 영동 버퍼의 볼륨을 조절합니다바람직한 실행을 달성하기 위해 현재 mber.
2. 중립 혜성 분석을 수행하려면 :
   1. 용해 버퍼를 제거하고 2 × 15 분에서 4 ° C에서 중립 전기 영동 버퍼 (2 밀리미터 나 ₂ EDTA, 90 mM 트리스, 90 mM의 붕산, 산도 8.5)와 칩을 씻어.
   2. 겔 필름 측이 양면 테이프를 이용하여 아래로 향하게하여 전기 영동 챔버 내의 보안 칩.
   3. 4 ° C 차가운 방에 챔버를 가져와.
   4. 그냥 젤을 커버하는 수준으로 차가운 중립 전기 영동 버퍼 챔버 (2 밀리미터 나 ₂ EDTA, 90 mM 트리스, 90 mM의 붕산, 산도 8.5)을 입력합니다.
   5. 겔은 60 분 동안 차가운 방에 앉아 할 수 있습니다.
   6. 0.6 V / cm에서 전기를 실행하고 차가운 방에서 60 분 동안 6mA. 원하는 주행 전류를 달성하기 위해 챔버 내에서 전기 영동 완충액의 볼륨을 조정한다.

6 형광 이미징

1. COL에서 전기 챔버에서 칩을 제거D 룸.
2. 4 ° C 냉장고에서 2 × 15 분 동안 중화 버퍼 (0.4 M 트리스, 산도 7.5)에 젤을 중화.
3. 선택의 형광 DNA 얼룩 칩을 얼룩 (즉, SYBR 골드, 에티 디움 브로마이드) 공장에서이 절차를 권장합니다. 형광 현미경을 사용하여 이미지.

7 데이터 분석

같은 KOMET 5.5 표준 혜성 분석 소프트웨어에 의해 혜성 이미지를 분석합니다.

결과

이 첫 번째 예에서, 우리는 H ₂ O _2를 사용하는 산화 적 손상에 노출 된 후 인간의 임파 세포에서 DNA 손상의 초기 레벨을 정량화하기위한 방법을 설명한다. H _{2 O이} 유도 된 기본 병변 및 단일 가닥 나누기를 평가하기 위해, 알칼리 혜성 조건이 사용됩니다. 로딩이 완료되고 세포가 아가 로스 오버레이로 캡슐화 한 후, 바닥이 96 - 웰 플레이트는 96 칩의 구획을 작성하는 표면 상에 가압된다. 웰 96는 각각 상이한 화학 물질의 종류 나 농도로 투여 될 수있다. 여기서 H ₂ O _(2)의 네 개의 다른 투여 량을 사용하고, 1X PBS가 음성 대조군으로 사용 하였다. 배열 혜성의 대표 이미지는 처리하지 않은 그림 1A, (위), 50 μM (가운데) 및 100 μM (아래) H ₂ O ₂ -exposed 샘플 혜성 꼬리의 서로 다른 수준의 입증에 표시됩니다. 혜성 이미지 분석 될 수 perfor일반적으로 각 혜성 꼬리 전체 형광 강도 및 이동 거리에 따라 손상 수준을 정량화하는 상용 소프트웨어를 사용 메드. 측정은 일반적으로 계산된다 50-100 조건 당 혜성 및 중간치 (하나 % 테일 DNA 또는 꼬리 길이)에서 수행된다.도 1b는 H의 네 개의 다른 농도에 노출 TK6 임파 세포 혜성에서 분석 백분율 테일 DNA 응답 곡선을 도시 ₂ O _2. 독립적 인 실험 간의 일관성은 세포에서 화학 처리의 다양한 수준에서 DNA 손상 반응을 평가하는데이 접근법의 효능을 보여준다.

(macrowells 중 예를 들어,)와 같은 실험의 반복 사이의 샘플들 사이의 변화에 대한 자세한 내용은, 간 샘플 간 실험 변동성은 각각도 2a와 2b에 그려졌다. 96-w의 각 실험 내에서, 각 웰엘 칩은 다른 샘플에 해당하고, 따라서 잘 간 편차는 물론 장치의 샘플 간 편차를 보여준다. 여기서, 96 - 웰 칩의 12 웰에 넣은 TK6 세포를 H ₂ O _2의 동일한 투여 량으로 처리하고, 처리 후 즉시 용해. 다른 모든 실험 단계를 병렬로 수행하고, 각 macrowell에서 최소 50 혜성의 중간 값은도 2a에 그려졌다. 표준 편차는 3.99 %로로 중간 값의 평균은 꼬리에 77.53 %의 DNA이다. 이 자료에서, 우리는 샘플 중 변동 계수는이 분석 ^6,16의 향상된 견고성을 보여주는 기존의 분석보다 배 낮은 여러 개의 5.2 %이라고 계산한다. 분석의 재현성에 대한 자세한 내용은, 우리는 75 μM의 H ₂ O ₂ 칩에 TK6 세포를 노출과 DNA 손상의 직접적인 수준을 분석 할 수 있습니다. 이 실험은 각 실험의 여섯 배 데이터 F 플롯 하였다 반복 하였다igure 2B. 동일한 실험 조건에서, 우리는 그림의 회색 막대로 표시, 57.87 %로 41.76 %에 이르는 결과를 얻었다. 여섯 반복의 평균은 2.04 %의 평균의 표준 오차로, 49.57 %이다. 반복 중 낮은 변화는이 소설 장치에서 수행 혜성 분석은 재현성이 높은 것을 의미한다.

수리 역학을 평가하기 위해, 세포 치료 후 신선한 미디어에 자신의 DNA를 복구 할 수 있습니다. 다양한 시점에서 macrowells을 용균은 시간이 지남에 DNA 손상의 변화를 보여준다. 예는도 3에 도시된다.이 실험에서는 TK6 셀은 먼저 칩에 캡슐화 된 50 μM의 H ₂ O ₂ 처리, 및 60 분간 노광 후까지 복구시켰다. 셀은 각각 0, 20, 45 및 60 분에서 용해시켰다. 상이한 시점에서 주제 혜성 이미지는도 3a에 도시되고, 시간이 지남에 따라 DNA 손상 수치의 변화도에 플롯(b). 이 데이터는 거의 모든 손상의 ₂ O ₂ 처리 45 분 후 H 내에서 수리 것으로 나타났습니다. 다양한 변수가 사용될 세포주 및 약제의 종류를 포함하여, 보수의 속도에 영향을 미칠 수있다. 따라서 연구자들은 프로토콜 (즉, 수리 시간을 연장하는 것은) 자신의 조사에서 추가 요구를 수용하기에 변경을 할 수 있습니다. 여기서 우리는 7 methylguanine 포함한베이스 병변을 유도하는 것으로 알려져 알킬화제를 TK6 세포를 다른 유전자 독성 제 N - 메틸 - N '-Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG)와 도전 특징이 칩을 사용하여 수리 실험의 또 다른 예이다 제공 및 3 methyladenine. 이러한 병변은 자연 antibody에서는하거나 DNA의 glycosylases에 의해 효소를 제거하여 어느 사이트를 abasic로 변환됩니다. 얻어진 abasic 사이트는 알칼리성 조건 하에서 분해함으로써 칩에 검출 될 수있다. 초기 노출 긴로부터 명백 손상의 상당한 증가를 야기세포는 DNA 복구 동안 그대로 복원 같이 꼬리, 시간이 지남에 따라 이들과 꼬리가 감소된다. 알킬화 및 산화 적 손상은 주로 두 염기 절제 복구 경로에 의해 복구되지만, 생성 된 병변의 크기 및 복구에 관여하는 단백질은 다양하다. 이러한 변형은 위치뿐만 아니라, 얻어진 abasic 사이트 수리 상이한 요금을 abasic하는 변환 상이한 레이트로 이어질 수있다. 그림 4에서, TK6 세포의 수리 역학은 0.1, 1에 노출하고, MNNG의 3 ㎍ / ㎖의 표시됩니다. MNNG에 의한 손상이 더 이상 지속 나타나고 H ₂ O ₂ - 유도 손상에 비해 느린 속도로 삭제되기 때문에이 실험에서, 우리는 2 시간 후 - 노출 실험 시간을 연장했다.

중성 조건을 이용하여 분석 DSBs 알칼리 조건을 이용하여 단일 - 가닥 병변 분석 프로토콜과 매우 유사하다. 초기 손상 레벨을 표시하려면 TK6 세포 GIR의 변수에 노출되었다, 얻어진 세포 용해 및 중성 pH (도 5a)에서 전기 영동 하였다. 그것은 혜성 꼬리의 형태가 알칼리 분석 조건 다르다는 것을 주목할 필요가있다. 이 분석을 이용하여 관찰 DNA 단편화를 달성하기 위해, 사용 된 IR 투여 량은 알칼리 조건을 사용하여 손상하는 데 필요한 용량보다 (0-100 Gy의) 상당히 높다. 또, 테일 길이가 중립 혜성 분석법 ^{7 사용시} DNA 손상의 정도를 반영하는 가장 중요한 파라미터 인 것을 발견했다. 분석 된 투여 량 반응 곡선을도 5B에 도시되어있다. 세포에서 DNA 이중 가닥 나누기의 수리도 평가 될 수 있고, Weingeist 등으로 나타났다. 알. ^7. 이와 함께, 중립 CometChip는 DNA DSBs의 높은 처리량 분석을위한 유용한 도구를 제공합니다.

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그림 1. H ₂ O ₂ 량 알칼리 혜성 분석을 사용하여 TK6 세포의 반응. (A) 50 μM (가운데) 및 100 μM에 노출 치료 TK6의 lymphoblasts (위)와 TK6 세포 (아래) H ₂ O _2에서 배열 된 마이크로 웰 혜성 4 ° C에서 20 분. 스케일 바는 100 μm의입니다. (B) H H ₂ O _(2)의 다양한 수준에 노출 TK6 셀 ₂ O ₂ 용량 반응. 각 데이터 포인트는 적어도 50 개인 혜성의 중앙값 백분율 테일 DNA는 각 실험에서 얻어진 3 개의 독립적 인 실험의 평균이다. 오차 막대는 3 개의 독립적 인 실험에서 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 간 샘플 및 간 실험 가변성. (A) 샘플 간 차이. TK6 lymphoblast 인간 세포를 96 - 웰 칩의 웰 (12)에 로딩 하였다. 각 웰을 50 μM의 H 100 ㎕에 _{노출이 O이} 4 ° C에서 20 분. 셀은 즉시 용해와 % 테일 DNA를 분석 하였다. 각 웰의 데이터는 여기에 표시됩니다. 각 상자에는 중간 각도에서 최소 50 개인 혜성을 나타냅니다. 12 웰의 평균 표준 편차는 3.99 %이며, 변동 계수는 5.2 %로 계산되고, 77.53 %이다. (B) 실험 대 실험 편차. TK6 인간의 lymphoblast 세포는 4 ° C에서 20 분 동안 75 μM의 H ₂ O ₂ 100 ㎕에 노출, 96 - 웰 칩에로드. 셀은 즉시 용해와 % 테일 DNA를 분석 하였다.동일한 실험을 6 회 반복하고, 각각의 반복 된 데이터는 그레이 바대로 도시되어있다. 각 상자에는 각 반복에서 최소 100 개인 혜성의 중간 % 꼬리 DNA를 나타냅니다. 6 반복의 평균 여기서 다시 막대로서 도시, 49.57 %이다. 6 반복의 표준 편차는 4.99 %이며, 평균의 표준 오차는 도면 오차 막대로 표현, 2.04 %로 계산된다.

TK6의 lymphoblasts 그림 3. H의 수리 ₂ O ₂ - 유도 손상. (A) 도식 대표 혜성과 수리 연구. TK6 세포는 손상을 에이전트로 처리하고 용해하기 전에 37 ° C에서 미디어에 복구 할 수 있습니다. (B) 네 & #에서 20 분 동안 50 μM의 H ₂ O ₂ 처리 후 TK6 세포의 수리 역학176, C. 각 데이터 포인트는 적어도 50 개인 혜성의 중앙값 백분율 테일 DNA는 각 실험에서 얻어진 3 개의 독립적 인 실험의 평균이다. 오차 막대는 반복 실험에서 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

TK6의 lymphoblasts에서 MNNG에 의한 손상의 그림 4. 수리가. TK6 세포는 4 ° C에서 30 분 동안 0.1, 1, 3 μg / ml의 MNNG으로 처리하고, 120 분 후까지 37 ° C에서 미디어에 복구 할 수 있습니다 노출. 적어도 50 개인 혜성의 중앙값 백분율 테일 DNA는 세 개의 독립적 실험을 각각 얻었다. 오차 막대는 표준 오차를 나타낸다3 개의 독립적 인 실험에서 평균의.

40 Gy를 (가운데)와 80 Gy를 (아래) 감마 방사선에 노출 치료 TK6의 lymphoblasts (위)와 TK6 세포로부터 그림 5. 중립 혜성 분석을 사용하여 TK6 세포의 IR의 용량 반응. (A) 배열 된 마이크로 웰 혜성. 스케일 바는 100 μm의입니다. 감마선의 다양한 수준에 노출 TK6 셀 (B)의 IR 투여 량 반응. 각 데이터 포인트는 칩에 6 macrowells에서 풀링 적어도 300 혜성의 중간 꼬리 길이 (μm의)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

환경과 같은 인간 세포 내에서 유비쿼터스 genotoxins 불가피 응력 세포 DNA에 손상을 가하지. 사실,이 정상 상태 ^(18)에서 인간의 세포에 존재하는 DNA 병변 1,000 개 존재하는 것이 추정되었다. 인간의 손상 감수성 및 수리 역학을 이해하는 것은뿐만 아니라 기초 연구에 대한 통찰력을 제공 할뿐만 아니라 신약 개발의 도움을받습니다. 아이러니하게도, 암을 촉진하는 DNA 손상의 능력에도 불구하고, DNA 손상 제는 암을 치료 DNA 손상에 관한 지식을 개인화 의학 관련 복구하기 위해 매우 높은 수준으로 사용된다. CometChip은 오랫동안 존재 DNA 손상 분석 혁명을 미세 가공 방법을 이용하여 신규 연구 장치이다. 기존의 혜성 분석의 동일한 원칙을 바탕으로,이 칩은 훨씬 더 높은 처리량과 더 나은 재현성을 제공합니다. 우리는 여기에서이 칩을 사용하는 방법을 설명합니다. 그 유틸리티와 견고성을 명확히하기 위해, 우리는 이리저리 결과를 보여m 칩은 여러 다른 DNA 손상 제에 의해 유도 된 손상을 평가하는 데 사용되었으며,이 DNA 복구를 평가하는 곳에 사용 된 여러 실험. 함께 여기에 제시된 결과는 칩 사용에 대한 유용한 정보를 제공하고, DNA 손상 및 수리에 대한 연구에 광범위한 적용 가능성을 보여줍니다.

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 셀 로딩 효과를 달성하는 것이다. 많은 세포주는 서스펜션과 부착 세포를 모두 포함하여이 시스템에서 테스트되었습니다. 효율성을로드하면 휴대 타입, 셀 크기, 로딩 농도와 시간과 같은 많은 변수에 따라 달라집니다. 같은 림프 세포와 같은 서스펜션 세포주 작업하기 가장 쉬운입니다. 세포 현탁액의 농도는 96 - 웰 당 ^4월 10일에서 6월 10일까지 셀마다 다를 수 있고, 로딩은 대개 15-30 분에서 완료된다. 더 높은 세포 밀도는 로딩을 용이하게하고 마이크로 웰에 세포 정착에 필요한 시간을 단축.

부착 세포에 대한로드 매개 변수 서스펜션 세포 다를 수 있습니다. 중국어 햄스터 난소 (CHO) 세포와 같은 세포주는 현탁 세포와 유사한 적재 효율 (다음 트립신)을 가지며, 따라서 유사한 하중 조건을 사용하여 발견되었다. 이러한 쉽게 현탁 세포 집합체를 형성하는 종양 세포와 같은 다른 세포 유형은, 추가 처리를 필요로한다. 현탁액 매체 트립신 단세포 필터를 통해 세포 현탁액을 전달하고로드하는 동안 첨가하여 셀 클러스터의 형성을 억제 할 수있다. 마지막으로, 로딩 시간의 관점에서, 시간은 20 분에서 1 시간으로 변할 수 마이크로 웰에 부착 세포주 캡처 필요한. 그 결과, 사용자가 추가 조사를 진행하기 전에 최적의 적재 상태를 결정하기 위해 파일럿 실험을 수행하는 것이 권장된다. 로딩 효능 DAPI 또는 다른 DNA와 캡슐화 세포를 염색하여보다 정확하게 밝혀 시야 현미경 또는 가시화 될 수있다형광 현미경으로 평가 이전에 얼룩.

이 방법 및 칩의 하나의 주요 장점은 다양성이다. 먼저, 셀이 과잉 씻겨 때문에 연구자들은 특정 작업 세포 농도에 한정되지 않고, 균일 한 마이크로 어레이는 혜성 밀도를 보장한다. 둘째, 마이크로 웰은 크기가 다른 세포 유형을 수용하도록 크기를 가변으로 할 수있다. 복수의 셀이 하나의 마이크로 웰에서 캡처되는 경우에도, 다중 셀 혜성 자기 교정 수율 일관된 결과는 단일 세포 혜성 ^6,7 비교된다. 마이크로 어레이의 셀을 패터닝하는 또 다른 이점은 모든 혜성 혜성 인해 산만에 노이즈를 감소시키고 자동화 영상 분석을 용이하게하고, 고정 된 위치와 동일한 초점 평면에서 다음 점이다. CometChip에서 제공하는 처리량과 감도가 크게 향상은 대규모 연구 분석의 응용 프로그램을 수 있습니다. 이와 함께, 칩 제공연구원, 독성 학자, 임상 및 역학에 대한 DNA 손상 평가를위한 SA 유용한 도구.

혜성 분석법은 DNA 손상의 광범위한 검출에 우수한 감도 알려져 있지만,이 분석은 또한 낮은 특이성에서 겪고있다. 이 프로토콜을 사용하면 크게 분석의 재현성 및 처리량을 향상 시키지만, 특이도에서 발전을 보여주지 않습니다. 그럼에도 불구하고, 다른 방법으로 분석이 더 높은 특이성을 달성하는데 효과적인 것으로보고되었다 다중화. 하나의 예는 정제 병변 특정 효소의 포함이다. 이 효소는 검출 가닥 나누기 및 abasic 사이트 ^1,19-21로, 그렇지 않으면 발견 할 수없는 기본 병변을 변환 할 수 있습니다. 널리 사용되는 예는 산화 DNA 수정 ^{19, 22를} 보여 수리 효소 formamidopyrimidine-DNA의 glycosylase (FPG)입니다. 효소 분해 단계는 세포 용해 후에 적용되기 때문에, 시스템은 동일한 방식으로 처리 될 수있다프로토콜 변경없이 사 전통 아가로 오스 슬라이드. 상세한 프로토콜은 여기에 설명되지는 않지만,이 방법은 과거 많은 전통적인 혜성 분석 사용자가 적응 한 내용 및 프로토콜을 용이하게 찾을 수있다. 이전 책에서, 우리는 형광등에 의한 손상 ^(22)를 식별하기 위해이 방법을 사용했다.

이 방법의 주요 이점은 이전에 사실상 불가능했던 연구의 문을 여는 것이 제공 처리량이다. 동일 플랫폼 (96)의 샘플을 처리 할 수​​있는 능력뿐만 아니라 노동력과 시간을 줄일뿐만 아니라, 소음을 감소 실험 크게 재현성을 향상시킨다. 간 샘플 변동이 칩 ^6,7 관찰 편차보다 2 배 더 높을 수있는 전통적인 슬라이드 대 슬라이드 편차,보다 상당히 낮다. 소음 감소는 샘플 간의 미묘한 차이를 검출 할 수 있도록, 향상된 민감도를 이끈다. 장치는 이동 단말기를 채용하므로ndard 96 - 웰 포맷으로, 그것은 일반적인 연구 장비와 호환 및 기술 HTS. 평균 연구원 ~ 수일에 걸쳐 유리 슬라이드 (30)를 처리 할 수​​ 있다고 가정하면, 샘플 (100)의 평가를 필요로하는 연구를 고려한다. 각 샘플은 세중 수행 할 필요가 있음을 감안할 때, 그것은 또한 필연적으로 변화를 샘플링 할 샘플에서 고통을 것 같은 연구를 완료하는 데 1 개월 정도 걸릴 것이다. 대조적으로,이 칩 (100)의 처리 조건, 삼중의 각각은 몇 판을 필요 사흘 수행 될 수있다. 처리량이 주요 개선은 이전에는 불가능했다 연구에 문을 엽니 다.

여기에 제시된 프로토콜은 표준 혜성 분석을 수행하기위한 기본 절차와 CometChip 플랫폼을 사용하는 데 필요한 단계를 모두 변경됨을 설명한다. 고유의 DNA 손상 수준 및 후속 보수 응답 모두를 측정 할 수있는 능력으로, 분석은 고도로 관련된생물학적, 임상 다양한 응용 프로그램. 게놈의 특정 화학 물질 노출의 영향에 대한 정보는 질병 예방과 치료를 용이하게한다. 또, DNA의 손상 감도 및 개인 ^23,24 중 수리 능력의 변화를 결정하는데 상당한 관심도있다. 이 기술은 이러한 대규모 연구에 필요한 처리량을 제공한다. 개인간 차이에 관한 지식 예민한 사람들을 식별 및 개별 치료법 또는 preventions 전략을 설계하는데 중요하다. 여기에 제시된 기술은 가까운 미래에 표준 방법론이 될 가능성을 가지고 높은 처리량, 객관적이고 정량적 DNA 손상 분석 플랫폼을 제공하고, 종합적.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
UltraPure LMP Agarose (low melting point)	Invitrogen	16520	Multiple suppliers
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS) 1x	Gibco by life technologies	14190	Multiple suppliers
Crystalline NaCl	Macron Chemicals	7581-06	Multiple suppliers
Crystalline Na2EDTA	Macron Chemicals	4931-04	Multiple suppliers, Irritant
Crystalline Tris (base)	Sigma-Aldrich	T1503	Multiple suppliers, Irritant
Crystalline Tris (acid)	J.T.Baker	4106	Multiple suppliers
Crystalline N-lauroylsarcosine	Sigma-Aldrich	L9150	Multiple suppliers, Highly toxic by inhalation, Irritant
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Multiple suppliers, Harmful by ingestion., Irritant
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D4540	Multiple suppliers, Combustible Liquid, Target Organ Effect
Crystalline NaOH	Macron Chemicals	7708-06	Multiple suppliers, Corrosive
Hydrochloric acid	VWR	BDH3871	Multiple suppliers, Corrosive
Crystalline boric acid	Sigma-Aldrich	B6768	Multiple suppliers, Target Organ Effect, Teratogen, Reproductive hazard
CometChip	Trevigen		Under development for distribution, contact Trevigen directly to obtain materials necessary
1-well dish	Thomas Scientific	73521-420
Bottomless 96-well plate	VWR	655000-06
1.5' binder clips	Staples		Multiple suppliers
Glass plate	Tag Hardware		Customized to size of 96-well plate
Owl Horizontal Electrophoresis System	VWR	27372-131	Multiple suppliers
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	164-5050	Multiple suppliers