배아의 마우스 하트을 개발에있는 셀의 레테르를 붙이는 및 사출

요약

우리는 (E) 9.5 및 이후 단계 배아 일에 마우스 배아 내의 배아 또는 다 능성 세포로부터 유래 된 내인성 및 그래프트 세포의 세포 운명 및 표현형 모두를 모니터하기 위해, 염료를 주입하는 DNA 벡터, 바이러스, 세포를 일련의 방법을 설명 개발.

초록

체외 프로토콜 배아 또는 다 능성 줄기 세포 - 파생 상품의 운명을 테스트하는 것은 반드시 자신의 생체 내 가능성을 반영하지 않습니다 논쟁의 결과로되었다. 바람직하게는, 이러한 세포는 확정적 표현형을 획득하기 위해 적절한 배아 환경에 배치되어야한다. 또한, 염료 또는 레트로 바이러스 벡터에 세포를 라벨링 한 후 마우스의 연구를 추적 세포의 혈통은 여전히​​ 저조한 개발 기관과 함께 초기 단계의 마우스 배아에 주로 제한 남아있다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 E9.5 개발 이후 단계에서 마우스 배아에서 심장의 대상 지역에서 다양한 제를 주입하는 표준 및 초음파 매개 미세 주입 프로토콜을 설계. 배아의 체외 이식편 또는 배아는 다음 배양 또는 추가 자궁 내에 개발하기 위해 왼쪽으로 수 있습니다. 이러한 에이전트는 형광 염료, 바이러스, shRNAs, 또는 세포 유래 전구 세포를 줄기 있습니다. 우리의 접근 방식은 쿵푸의 보존을 허용기관의 nction 마이그레이션 및 표시 및 / 또는 주입 된 세포의 운명을 모니터링하면서. 이러한 기술은 다른 장기로 확장 할 수 있으며, 개발 생물학의 주요 생물학적 문제를 해결하는 것은 매우 도움이 될 것입니다.

서문

이상 10 년 전 인간 배아 줄기 세포 (HuESCs)는 인간 배반포 ^1에서 파생되었다. 그 후,이 세포는 인간의 발달 생물학의 충족 문제를 해결 연구의 중요한 분야의 대상이되고있다. HuESCs는 또한 재생 의료에의 희망을 제공하고 있습니다. 최근 몇 년 동안, 인간 유도 만능 줄기 세포 (유도 만능)은 유전 질환 ^2의 모델을 제공하고, 환자 맞춤형 체세포에서 생성 된. 심장 계통 ^3를 포함한 다양한 세포 계통,으로 배아 또는 유도 만능 줄기 세포의 분화에 대한 시험 관내 프로토콜에 많은 사람들이보고되고있다. 분화 된 세포는 종종 RNA 및 단백질 발현, 면역 염색, 및 / 또는 기능 시험 관내에서의 분석에 의하여 phenotyped된다. 그러나, 다 능성 줄기 세포 유도체들은​​ 완전히 CEL 취득 여부를 테스트하기 위해 적절한 배아 환경에 배치 될 필요L의 자신의 배아 대응의 운명과 그들이 지역 신호에 대한 응답으로 정품 생체 기능을 요점을 되풀이할지 여부. 조직 공학이 유망하지만, 아직 미발달 티슈 ^{4,5 개발되어} 생체 내에서 적절한 모든 알려진 알려지지 단서를 제공하지 않는다.

마우스 배아 등의 배아에있는 염료 또는 레트로 바이러스 벡터와 셀 라벨은 심장 개발 ^6시 세포 계통의 배아 출처에 중요한 정보를 가져왔다. 예를 들어, 고립 된 마음의 체외 배양 한 다음 생체 마우스 태아의 심장 막 공간에 주입 염료는 심 외막 세포와 그 후손 ^{7 레이블로} 사용되었다. 그러나, 염료 및 레트로 바이러스 셀 라벨은 대부분 ⁸ 더 쉽게 접근 할 수있다 여전히 제대로 개발 기관, 또는 닭의 배아와 초기 마우스 배아에 적용되었습니다. 예외가 전자의 대상으로 쉽게 뇌입니다mbryos ^9,10. 이러한 접근 방식은 아직 구타 배아 마우스의 심장에 적용되지 않았습니다.

염료 또는 바이러스에 직접 라벨을 보완하기 위해보다 고급 단계의 마우스 배아와 성인 마우스의 추적 혈통을 수행하는 셀 라벨 접근 방식은 크레 / 훈제 연어 기술을 이용하여 형질 전환 생쥐의 분석과 결합되어 있습니다. 크레 / 훈제 연어 방법 ^(11)는 그러나 재조합 효소의 발현을 구동하는 데 사용되는 게놈 규제 지역의 시공간 특이성, 그리고 크레 / 훈제 연어 재조합 ^(12)의 효율성으로 인해 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 그것은 단지 크레 식을 구동하는 데 사용 규제 지역의 활성화 후 전구체에 레이블을 지정할 수 있습니다 더욱이,이 방법은 완벽하게 세포 운명의 세포 이동 구동 인수의 특정 문제를 해결하지 않습니다. 또한 분명한 윤리적 인 문제에 대해 인간 배아에 적용 할 수 없습니다.

이러한 제한을 감안할 때, 우리는 새로운 P 시리즈를 디자인의 대상 지역에서 같은 형광 염료, 바이러스 등 shRNAs와 DNA 기반의 셀 라벨 벡터로 유전자 발현 조절 자, 또는 E9.5 개발 이후 단계에서 마우스 배아에서 세포와 같은 세포 라벨링 에이전트의 다양한 주입하는 rotocols 마음.

DNA / 세포 주사는 입체 현미경과 48 시간, 또는 48 ~ 72 시간 동안 고립 된 심장이나 배아 이식편 문화까지 생체 배아 문화와 함께 간단한 미세 주입 장치를 사용합니다. 우리는 또한 자궁에 배아의 마음 초음파 매개 미세 주입 프로토콜을보고합니다.이 기술은 배아 ^(13)의 개발을 모니터링 할 수 있으며 injectates 및 / 또는 표지 세포의 장기 추적 관찰 할 수 있습니다.

우리는 이러한 접근 방식은 장기의 기능을 보존하고 줄기 세포의 잠재력을 시험 관내 시험보다 더 대표적인 환경을 제공하는 것으로 나타났습니다. 또한, 마이그레이션을 수행 할 수있는 기회를 제공한다자신의 운명을 모니터링하는 세포를 표시 및 / 또는 주입. 궁극적으로, 이것은 지역 티슈 패터닝 및 주요 생물학적 과정의 더 나은 이해를 수득한다.

프로토콜

1. 준비

동물 절차

동물 윤리위원회의 승인을 받아야하고 바이러스에 작업에 대한 제도적 지침을 따르 HuESC 및 / 또는 IPSC (해당되는 경우)뿐만 아니라, 마우스 처리, 마우스 배아를 획득, 마우스 수술을 수행. 시간 제한 교배를 들어, 플러그의 날 배아 일 (E) 0.5 / 0.5 일 후 교미 간주됩니다.

1. 미세 주사 바늘 :
   전 자궁 미세 주입 들어, 1 또는 10 μm의 내부 팁 직경이 각각 DNA 나 세포를 주입하는 날카로운과 원뿔 곡선 (이차 곡선) 끝 모양을 얻을 수있는 피펫 풀러 / beveller를 사용하여 유리 피펫 (1.2 mm 외부 직경 붕규산 모세관)을 당깁니다. 초음파 매개 주사의 경우, 사용 35분의 50 μm의 외경 / ID의 팁 1.14 mm/0.53 mm의 내부 / 외부 직경 (OD / ID)를 가지고 멸균 바늘을 사용자 정의.
2. 실리콘 가득 배양 접시 :
   사용 설명서에 설명 된 바와 같이, 실리콘을 준비합니다. 기입~ 1cm의 탄성 중합체 층을 깨끗한 유리 60mm 직경 페트리 접시. 공기 방울을 피하십시오.
3. 상품 :
   절차를 수행하는 동안 사전에 멸균 모든 수술 도구를 유지합니다.
4. DNA 준비 :
   하나의 튜브에 3 μg의 DNA 12 ㎕의 옵티-MEM을 추가합니다. 다른 튜브에 3 μL의 리포 펙 타민 2000 년 12 ㎕의 옵티-MEM을 추가합니다. RT에서 5 분 동안 품어 두 솔루션을 섞는다. 즉시 사용합니다.
5. 셀 준비 :
   10 ⁶ 세포 현탁액을 준비 / ML DMEM (둘 베코 이글 중간, 높은 포도당과 50 %의 쥐의 혈청). 최종 세포 현탁액의 50 μl의 8 ~ 10 배아 충분하다.
6. 준비 염료 :
   25 ㎎ / ㎖ DMSO에 녹색 형광 CDCFDA-SE를 사용합니다. -20 ° C에서 20 μL 씩 분주하고 저장을 준비 멸균 생리 식염수 또는 PBS 사용하기 전에 1:100 / 1:200 희석.
7. 바이러스 준비 :
   ~ 10 ¹⁰ -10 ¹⁰ TRA의 역가 상용 제 ^{3 세대} PGK-GFP를 발현하는 렌티 바이러스를 사용단위 / ml의 DMEM을 nsducing. 렌티 바이러스의 준비를 위해, Tiscornia 등 알. ^(14)는 개인 보호 장비를 착용하고 안전하게 사용과 바이러스 처리를 참조하십시오.

예 생체 내 주입에 대한 E9.5과 E10.5 태아의 2. 컬렉션

1. 배아 일 9.5 또는 10.5에서 임신 한 쥐를 안락사.
2. 70 % 에탄올로, 마우스의 흉부 및 복부를 살균.
3. 복부를 열고 PBS의 RT에서 자궁 경적을 검색하고 M16 매체와 실리콘으로 채워진 페트리 접시에 두 PBS 세척 후 전송하는 복부 정중선 절개를합니다.
4. 자궁의 혈관 측이 아래쪽이되도록 실리콘 층 곤충 핀 자궁 뿔 핀.
5. 표면 아래 1mm에 미세 집게와 자궁의 표면과 탈락의 뚜껑을 잘라.
6. 부드럽게 탈락의 벽을 확산하여 난황에서 배아를 검색 할 수 있습니다.
7. 37 °에서 배아를 저장; 세포 주입하기 전에 C M16 중간. 주사의 경우, 각 배아는 미리 예열 37 ° C에서 M16 매체로 채워진 실리콘 요리로 전송

입체 현미경 3. DNA 나 세포 주입

1. 해밀턴 주사기 뒤쪽에서 유리 피펫을 입력하고 끝에서 거품을 제거하기 위해 피펫을 흔들.
2. 미세 주입 홀더에 피펫을 설정; 50 보압 (DNA) 또는 30 (세포) 고전력 증폭기, 300 (세포)에 150 사출 압력 (DNA) 고전력 증폭기를 설정합니다. 0.2 초 (DNA) 또는 0.5 초 (세포)에 주입 시간을 설정합니다. 이러한 설정은 약간 microinjector과 펫의 종류에 따라 다를 수 있습니다.
3. 적절한 배아를 건드리지 않고 난황을 통해 실리콘 아래로 배아를 핀. 마음의 영역을보고 그냥이 지역 위의 주머니를 엽니 다.
4. 세포 주입하는 동안 움직임을 방지하기 위해 배아 주변에 4 개의 핀을 추가합니다.
5. (수동으로 설정) 미세 조작기를 사용하여, slowl다만 (그림 1) 주입하는 마음의 영역 위의 심낭 위 45 °의 각도로 y 위치 피펫 팁.
6. 관심 영역에 피펫을 이동하고 주사를 트리거합니다. 가능한 한 빨리 피펫을 가져 가라. 확실히 마음이 제대로 DNA / 세포 주입 후 구타되어 있는지 확인합니다.

4. 배아, 고립 된 마음, 그리고 이식편 문화

1. 페니실린 / 스트렙토 마이신, 37 ° C에서 미리 예열하고 40 % O ₂ 산소 보충 25 % M2 매체 75 %의 쥐의 혈청 문화 E9.5의 배아.
2. , 25 ㎖ 유리관에 2 ㎖의 배양액을 추가 부드럽게 배아를 추가하고, 튜브에 캡을 나사 결합하기 전에 40 % O _2와 옥시. 회전 또는 (30 회전 / 분)을 흔들어 동안 37 ° C에서 36 시간까지 배양한다.
3. 원하는 시점 (예 : 24 시간)에서 첫 번째 드에 의해, 마음을 건드리지 않고, 미세 집게로 조심스럽게 마음을 해부하다배아를 capitating; 마음은 말초 유출 관을 사용하여 잡아 당겨 소비세 쉽다.
4. 문화 12 - 웰 플레이트에서 설정 리겔 코팅 인서트 50 % FCS와 DMEM에있는 다른 36 ~ 48 시간 동안 마음입니다. 심장의 문화 ^(15)의 개선 된 프로토콜에 대한 다이어 & 패터슨 (2013)를 참조하십시오.
5. 관심 영역의 이식편을 확인합니다. 예를 들어, 콜라겐 1 형 겔 ^16에 48 시간의 아트 리오 심실 운하 (AVC)와 문화를 해부하다.

심장 I N 자궁 내 5. 초음파 유도 주사

1. 초음파 기계 및 microinjector의 설정 :
   1. 레일에 40 MHz의 변환기와 미세 주입 설정으로 고해상도 초음파 시스템을 사용합니다.
   2. 주입 당 69 NL에서 microinjector에 주입 볼륨을 설정합니다. microinjector 프로그래밍을위한 제조 업체의 미세 주입 설명서를 참조하십시오.
2. microi의 준비njection 설치 및 주입 :
   1. microinjector에 유리 마이크로 피펫을 놓습니다. 최대 볼륨까지 흡입에 의해 효율적으로 주입, 첫 번째 코트에게 미네랄 오일과 피펫의 안쪽을 보장합니다. 그 후 바늘 내부에 오일 1 ~ 2 밀리미터를 떠나, 다시 기름을 꺼냅니다.
   2. 최대 볼륨에 도달 할 때까지 injectate 대기음. 이 끝을 무디게하고 주입을 더욱 어렵게 만들 것으로 바늘 끝으로 모든 표면에 닿지 않도록주의하십시오.
   3. 주입 동안 배아를 함유 자궁 뿔을 안정, 중앙 컷 소 슬릿을 가진 얇은 실리콘 막에 의해 덮여 중간에 구멍이 변경됨 페트리 접시 (2.5 cm 직경)를 사용하고, 절개 사이트 위에 올려 놓으 . 접시의 가장자리에서 점토의 3-4 덩어리를 배치하여 마우스 처리 테이블에 페트리 접시를 안정.
3. 주입 절차 :
   1. 전에 마취하는 (원하는 배아 단계에서) 임신 한 쥐의 복부를 면도SIA는 머리를 제거합니다. 잔여 머리를 제거하고 70 % 에탄올로 소독 화학 제모 제와 복부를 처리합니다.
   2. 얼굴에 마스크를 통해 산소 / 이소 플루 란과 임신 마우스를 마취. 절차의 나머지 기간 동안 1.5 % 다음에 초기 마취, 100 % 산소에 3 ~ 5 %의 이소 플루 란을 사용합니다. 마우스가 충분히 부드럽게 발 및 / 또는 꼬리를 집어 마취되어 있는지 확인합니다.
   3. (37 ° C에서 가열로 설정) 마우스 처리 테이블에 마우스 부정사를 놓고 각막의 탈수를 방지하기 위해 윤활제와 눈을 포함한다.
   4. 전극에 전극 젤을 적용 및 심박수, 호흡 수, 및 ECG를 모니터링 전극에 발을 테이프. 몸의 온도를 모니터링하기 위해 직장 온도계를 배치합니다.
   5. 먼저 마우스를 시각화 및 초음파에 의해 배아를 계산하여 임신인지 확인합니다. 복부 초음파 젤을 적용하고 방광 위의 스캔 헤드를 놓습니다. 일관성을 위해, 우선 방광을 시각화방광의 위치에서 시작하여 왼쪽에있는 배아과 오른쪽 자궁 뿔을 계산합니다. 배아 마음이 정상적으로 박동되어 있는지 확인합니다.
   6. 마우스가 임신 한 경우, 점토와 미래 절개 위의 페트리 접시를 놓습니다. 요리는 직접 접촉되도록 약간 복부에 접시를 누릅니다.
   7. 접시를 제거하고 다시 복부를 소독. 복부 및 복막을 열고, 약 0.75-1 cm 질보다, 1.5 cm 복부 정중선 절개를합니다. 내부 장기에 손상을 피하십시오.
   8. 집게로 왼쪽 또는 오른쪽 자궁 경적을 외면 화하다, 부드럽게 요리의 실리콘 멤브레인을 당겨, 다시 점토의 요리를 안정. 방지 광범위이 자궁 혈관과 여성 및 / 또는 배아의 조기 사망의 출혈을 일으킬 수 있기 때문에, 잡아 당기거나 조작.
   9. 배아 주입 된 적절한 기록 유지를 보장하기 위해 다시 배아를 계산합니다.
   10. U에 초음파 젤을 적용이미지 terine 뿔 마음과 탈수를 방지하기 위해.
   11. 이미지 최초의 배아를 주입 할 수 있습니다. 배아 심장의 정상적인 박동을 확인하고 태아의 꼬리 - 두개골과 좌우 방향의 기록을 유지. 필요한 경우, 올바른 방향을 확인하기 위해 약간 자궁 뿔의 위치를​​ 변경. 이 어려운 증명하는 경우, 다음 배아로 이동합니다.
   12. 약간 (그림 3) 심낭의 외부 배아 위의 45 ° 각도로 바늘의 위치를 미세 주사 바늘로 조심스럽게 자궁에 구멍을. 이 아트 리오 심실 홈 (그림 3)을 향해 가리 키도록 심 외막 세포의 표지를 들어, 이미지 네 개의 챔버보기 마음과 바늘을 위치. 각도를 조정해야하는 경우, 바늘을 빼, 및 재배치. 이 바늘을 깰 수 있으므로, 자궁 안쪽에 바늘의 각도를 조정하지 마십시오. 이러한 사지 또는 태반 등의 조직을 천공하지 마십시오.
   13. 바늘을 이동심낭 벽에 상냥한,하지만 빠른 움직임으로 찔린. 일반적으로, 거기에 약간의 저항이 될 것입니다,하지만 너무 빨리 바늘을 이동하는 바늘 끝은 심장 자체에 구멍을 발생할 수 있습니다. 팁 아트 리오 심실 홈의 심낭 공간에서 생을 마감한다. 심막 출혈의 경우에, 혈액 세포는 흰 눈 형상 패턴으로 표시 될 것이다. 이 경우, 배아를 주입을 중지하고 다른 배아로 이동.
   14. injectate을 주입한다. 하트 개발에 대한 악영향을 방지하기 위해 심막 공간으로 극대 700 NL 주입한다. 심낭의 약간의 시간적인 부종에 의해 적절한 주사를 모니터링합니다.
   15. 주입 후, 밖으로 바늘을 뽑아 injectate 여전히 바늘이 조직의 조각에 의해 막힌되지 않았 음을 확인하기 위해 배출 될 수 있음을 확인.
   16. 이미지 처리 테이블의 위치를​​ 변경하고 다음 배아를 주입. 방지하기 위해 (한 자궁 경적에) 3-4을 최대로하기 위해 주입 된 배아의 수를 유지대향 자궁 경적 제어 배아를 허용하고, 절차가 배아 발달을 방해하지 않았 음을 보장하기 위해 마취를 확장했다.
   17. 배아의 원하는 번호를 주입 한 후, 여분의 초음파 젤을 제거하고 부드럽게 적절한 위치에 복부에 다시​​ 자궁 경적을 배치합니다.
   18. 하나의 복막과 복부 근육 봉합 층, 피부에 대한 봉합의 두 번째 레이어를 사용하여 산모의 복부를 닫습니다.
   19. 진통제의 첫 번째 복용량으로 마우스를 주입한다. 전에 12 시간 간격으로 마취와 세 개의 추가 주사를 끝으로 0.05 ~ 0.1 ㎎ / ㎏ 프레 놀핀 15 분 중 하나 주사를 사용합니다.
   20. 마취를 중단하고 프로 시저의 적절한 복구를 위해 마우스를 모니터링 할 수 있습니다. 주택의 후속 원하는 기간에 대한 개별 케이지에 임신 한 마우스.

결과

상기 주입 프로토콜을 사용하여, 세포를 표지 및 / 또는 마우스 배아 심장에 주입 될 수있다. 개념의 증거로 몇 가지 예는 주입 프로토콜과 생체 AVC 이식편, 고립 된 심장, 또는 전체 배아 문화 (그림 1) 결합 된 표시됩니다.

도 1은 세포 주입 전의 배아의 제조를 나타낸다. 난황 (그림 1A)의 무결성을 유지하면서 E9.5의 배아의 탈락에?...

토론

위에서 설명한 내 심장 생체 주입 프로토콜은 중간 단계 (E9.5 - E11.5) 마우스 배아에서 최소 48 시간 동안 심근 기능을 보존하도록 설계되어 있습니다. 이러한 주입 방법은 DNA 나 세포의 공간적 대상으로 주입 할 수 있습니다. 그림 1-3에 나와있는 몇 가지 예는 생체와 같은 내막 또는 심 외막 세포의 EMT으로 제한된 심장 지역에서 개최 발달 과정의 생체 분자 메커?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Setups/Hardware
40 MHz Transducer	VisualSonics	MS550S
Microinjector	VisualSonics
Microinjector	Eppendorf	5242
Micromanipulator	Eppendorf	5171
Nitrogen			required to pressurize the injector
Rail system	VisualSonics
rotator			to rotate glass tube with embryos inside the incubator
Standard incubator			5% CO2, 37 °C
stereomicroscope	Zeiss	Discovery. V8
Vevo 2100	VisualSonics
Microinjection
Borosilicate capillary tubes	World Precision Instrument	KTW-120-6	1.2-μm external diameter
Pipette puller	Sutter	Model P87
Microinjection needles	Origio-Humagen	C060609	OD/ID 1.14 mm/53 mm, with 50/35 μm OD/ID tip
Hamilton syringes
Petri dishes			10-cm diameter
Mineral oil	Sigma	M8410
Silicon membrane	Visualsonics		4.3 x 4.3 cm
Play-Doh
Isoflurane	Vet One
hair removal agent	Nair
Eye lubricant	Optixcare	31779
Electrode gel (Signa)	Parker
Suture	Sofsilk 5-0	S1173
Ultrasound gel	Aquasonic
Buprenex Buprenex (buprenorphine hydrochloride)	Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc.	NDC 12496-0757-1	0.05-0.1 mg/kg in saline
Other
Silicone Elastomer	Dow Corning	Sylgard 184
Glass petridishes	Fine Science Tools		60-mm diameter
Insect pins	Fine Science Tools	26002-20
Media and culture reagents
Optimem medium	Life Technologies	51985026
M2 medium	Sigma	M7167
Dulbecco’s Eagle Medium	Lonza	BE12-640F	high glucose and 50% rat serum
M16 medium	Sigma	M7292
Rat serum	Janvier	ODI 7158
Pennicilin/streptomycin	Life Technologies	15140-12
oxygen 40%	Air liquid		required to oxygenate the embryo culture medium
Fetal calf serum	Fisher	RVJ35882
Matrigel	BD	356230
Collagen type I	BD	354236	to coat culture dishes for explant culture
Culture dishes	Dutcher /Orange	131020
Injectates
CDCFDA-SE	Invitrogen/Molecular Probes	C1165	25 mg/ml DMSO. Store at -20 °C. Dilute 1:100-200 in saline before use.
PGK-GFP-expressing lentivirus			~8E9 transducing units/ml DMEM
Lipofectamine 2000	Life Technologies	11668019