실험 경추 척수 손상의 신경 전구체 세포 및 자기 조립 펩티드의 시너지 사용

요약

Treating cervical spinal cord injury with both self-assembling peptides (SAP) and neural precursor cells (NPC), together with growth factors, is a promising approach to promote regeneration and recovery. A contusion/compression aneurysm clip rat model of cervical SCI and combined treatment involving SAP injection and NPC transplantation is established.

초록

척수 손상 (SCI)는 환자와 그 가족에 대한 심각한 신경 학적 손상과 심리적, 경제적, 사회적 결과를 야기한다. 임상 적으로, SCI의 50 % 이상은 경추 ^{한 영향을} 미친다. 차 부상의 결과로, 염증, 세포 사멸 및 탈수 초화를 포함한 보조기구의 폭포는 마지막으로 골수 충치 ^2,3의 조직 흉터 및 개발을 선도 발생합니다. 모두 세포 이식, 통합 및 재생에 물리적, 화학적 장벽을 나타냅니다. 따라서 억제 환경을 형성 및 세포 이식 및 재생을위한 지원 환경을 만들 충치를 브리징 유망한 치료 대상 ^4입니다. 여기서, 동맥류 클립을 사용하여 자궁 SCI의 좌상 / 압축 모델을 설명한다. 완전 절개 또는 코드의 파열이 드문 때문에이 모델은 더 임상 적으로 관련된 다른 실험 모델보다. 또한 compariso에서특히 손상 배부 컬럼, 척수 둘레 압축 유리할 나타나는 중량 드롭 모델에 N. 클립 폐력과 지속 시간은 상이한 중증도를 얻도록 조절 될 수있다. 링 스프링 정확한 교정 및 클립 힘의 불변성을 용이하게한다. 생리 학적 조건에서 합성 자기 조립 펩티드 (SAP) 나노 섬유로 자기 조립 (self-assembly) 따라서, SCI ⁵ 응용 프로그램에 대한 호소한다. 이들은 코드의 손상을 최소화하는 병변에 직접 주입 할 수있다. 구조 조정 정책은 골수 충치를 해소함으로써, 재생 트리트먼트 손상된 코드를 갖출 수 있도록 발판을 세우는 생체 구조입니다. K2는 (QL)는 (QL6가) 다른 펩타이드에 비해 동 등 리터. ^(6)에 의해 도입 된 신규 SAP이며, QL6는 ⁶ .14 일 SCI 후 중성 pH에서 β-시트로 6K2를 자기 조립 급성기, 구조 조정 프로그램 후 병변과 신경 전구 세포 (NPC)의 중심에 주입 인제는인접 등의 컬럼에 cted. 세포 생존을 지원하기 위해, 이식 7 일 동안 삼투 마이크로 펌프에 의한 성장 인자의 연속적 경막 투여와 조합된다.

서문

척수 손상의 50 % 이상은 경추와 관련이 있습니다. 임상에서 두 가지 병태 생리 학적 메커니즘이 설명되어 있습니다 설정 : 이후 초기 척수의 타박상 및 골절, 출혈이나 부종에 의한 지속적인 압축을.

동맥류 클립 타박상 / 압축 모델을 모방 모두 병태 생리 학적 메커니즘 : 클립을 스냅하는 것은 타박상을 생산하고 클리핑의 기간은 골절, 출혈 또는 조직에 의한 임상 설정에서 압축이 마지막으로 중요한 이상 팽창 것을 양보, 압축 구성 요소를 나타냅니다. 사용 된 동맥류 클립은 정확하고 재현성 클리핑 힘을 보장 링 스프링에 의해 수정됩니다. 특히 헤미 절개 또는 타박상 모델이 동맥류 클립 모델을 모방 최고의 임상 비교. 흉부 손상을 입은 환자는 자궁 경부 INJ와 하반신 마비, 대부분의 환자에서 고통 동안uries는 tetraplegic 완전히 달라집니다. 자궁 코드의 해부학 적 구조는, 그러나, 흉추 또는 요추에 비해 상당한 차이를 나타내고, 따라서,이 프로토콜에서 특히 언급된다.

골수 공동 및 흉터 조직 발달 복구 및 재생을위한 장애물이다. 이러한 장벽을 골격 물질의 사용을 극복하기 유망한 접근법이다. 자기 조립 펩티드는 병변의 진원지에 직접 주입 할 수있다. 그곳에서 그들은 공동 가교 나노 섬유 지지체에 조립하고 염증과 조직 겁을 줄여 억제 환경을 개선. 경질 재료를 주입하는 동안 척수 손상의 상당한 원인이 있지만, 유체 펩티드 안전하게 심한 손상없이 추가로 주입 할 수있다.

줄기 세포 이식 전에 자기 조립 펩티드 저해 환경 개선, 따라서, 셀을 지원 Integration 경추 척수 손상 후 최종적 분화, 기능 회복.

프로토콜

주 : 다음 실험 프로토콜 대학 건강 네트워크 (토론토, 캐나다)의 동물 관리위원회의 승인 관리 및 동물 보호의 캐나다 협의회에 의해 제조 된 실험 동물의 사용에 대한 가이드에 설립 정책에 따라하였습니다 .

1. 자궁 동맥류 클립 타박상 / 압축 모델

1. 수술기구 및 오토 클레이브는 70 % 알코올 욕에서 악기 바꾸어 surgcial 전체 과정 동안 멸균 조건을 유지하기 전에.
2. (1 : 1)의 조합으로 산소 (O _2), 아산화 질소 (N ₂ O)과의 Wistar 래트 (250~270g)을 마취시키다, 및 1.8 ~ 2.2 % 이소 플루 란 가스로 마취 마스크 자발 호흡을 지원한다. 마취 유도를 들어 1 분 동안 5 % 아이소 플루 란으로 시작하여 이후 줄일 수 있습니다. 고통스러운 자극 (예. 발에)함으로써 수술, 마취의 제어 깊이를 시작하기 전에. 지방 연고를 적용눈 건조를 방지하고 이후의 감염을 방지 할 수 있습니다.
3. 가열 쿠션 (37 ° C)에 쥐를 넣고 정위 프레임으로 머리를 고정합니다.
4. 경추 주위에 수술 부위를 면도하고 포비돈 요오드와 70 % 알코올로 소독.
5. 흉부 척추 몸체 (2) (T2)의 눈에 띄는에이 과정에 도달하는 경추 (C2)에서 척추 위의 중간 선 절개를합니다.
6. 직접 중간 선에 척추 근육의 바깥 층을 잘라 cranio-꼬리 방향으로 (출혈을 피하기 위해) 및 추가하면이 과정이의 spinosus와 엽층에 도달 할 때까지 퉁명스럽게 깊은 근육층을 해부하다. 견인기를 삽입합니다.
7. 후궁 절제술에 대한 목표 수준을 관찰 할 수있는 척추 본체 (T2)의 눈에 띄는이 과정이의 spinosus의 방향을. 식별 및 선택의 박판의 마이크로 수술 준비를 한 후, 엽층과이 과정이의 spinosus을 풀어 ligamenti flavae을 통해 잘라. 마지막으로, C척수 뼈 깎기 측면과 엽층을 통해 UT와 척수 자체의 압축을 피하고, 부드럽게 사람들을 제거합니다.
   참고 : 가장 일반적인 수준은 C5 / 6, C6 / 7, 또는 C7 / T1 있습니다. 수술 사망률은 부상의 수준 주동이 더 증가한다. 척추 주위 정맥동에서 출혈 일반적이며 스폰지에주의 압축에 의해 해결 될 수있다.
8. 코드를 들려줘하는 클립을 삽입하기 전에 (특히 레벨 C5 / 6시) 클리핑에서 그들을 절약하는 신경 뿌리를 신흥 식별합니다.
9. 부드러운 클립 유도를 보장하기 위해, 후크 추체 등의 측면에서 복부 경질를 풀고 클립 복도를 준비합니다.
10. 마지막으로, 오픈 클립을 삽입하고 타박상 부상을 달성하기 위해 종료 (급 폐쇄) 스냅인 수 있습니다. 클립 닫는 힘과 클립 폐쇄 기간은 외상의 강도와 압축의 정도를 결정합니다. 일반적으로 사용되는 15~35g과 clippi 사이의 클립 세력은예를 들어 1 분의 NG 기간. (그림 1).
11. 클립의 제거 후, ​​2 층에 근육을 적응하고 상처를 닫습니다.
12. 마취를 중지하고 흉골 드러 누움에 대한 충분한 의식을 차릴 때까지 지속적으로 관찰 아래에있는 동물 웨이크 업 할 수 있습니다. 마지막으로, 하나의 새장에 쥐를 넣어 수술 후 치료 지침을 따르십시오.
13. 동물이 부상 이러한 유형의 심각도 어려움을 겪고 있기 때문에, 수술 후 치료에 특별한주의를 지불해야합니다 :
    1. (3 일, 5 일 각각 임상 증상에 따라 대한 프레 놀핀과 멜 록시 캄) 진통제를 관리.
    2. 3 일 동안 추가 식염수 피하 보내기 (2 회를 50-10 밀리리터).
    3. 이일 전에 마시는 물에 항생제를 제공하고 7 일 후 수술까지 (예를 들어 Moxifloxacine)
    4. 방광 기능의 회복이 일정 할 때까지 방광 2-3 회를 짜내만민 명백한.
    5. 적어도 하루에 한 번 신경 학적 결손 및 운영 동물의 생리 학적 상태를 관찰한다.

2. (십사일 부상 후) 구조 조정 정책과의 NPC를 주입

1. 1.1에 기재된 바와 같이 마취를 유도한다. 1.3, 정위 프레임에 쥐의 머리를 고정 바늘이나 상처 클립을 제거하고 상처 포비돈 요오드와 70 % 알코올로 수술 영역을 소독.
2. 조심스럽게, 견인기를 삽입, 척추 주위 근육을 해부 두라에서 현미경으로 흉터 조직을 제거하고 병변 사이트를 다시 노출.
3. 1 %의 농도로 준비되는 SAP (W / V) 외 매트릭스 겔을 수행한다. QL6의 구조 조정 정책은 생리 학적으로 적합한 pH는 주입 전에 버퍼링 할 필요가 없습니다. 척수의 구조 조정 정책의 시각화를 들어, QL6 (QL6-FITC)의 형광 유도체를 사용합니다.
4. 이 부분들 각각에 분산 된 병변의 중심에있는 SAP (5 마이크로 리터 (μL)을 주입정중선의 2.5 μL 양자. 마이크로 유리 모세관 (100 마이크로 미터 (μm의) 외경 (OD))와 정위 프레임에 연결 해밀턴 주사기를 사용합니다. 날카로운 바늘의 끝으로 조심스럽게 경질을 열고 상처를 입은 척수에 유리 모세관 정위 2mm (mm)를 삽입합니다.
5. 부피의 1/3를 주입 한 후, 1.5 mm 깊이로 바늘을 제거한 후 상기 1/3 1mm. 전체 볼륨을 주입 한 후 주사기를 제거하기 전에, 겔 형성을 안정화 5 분을 기다립니다.
6. 의 NPC를 생성하려면, 성인을 DsRed 마우스 (또는, 녹색 YFP 긍정적 인 마우스)를 사용하고 격리하고 paraventrical 영역 ^{4,18,21에서} 그들을 육성.
7. 세포 현탁액에 90 % ~ 생균의 존재를 나타내는 트리 판 블루 염색으로의 NPC 생존력 평가. 성장 매체 (50 X 103 살아있는 세포 / μL)에 세포를 희석 한 후 세포 이식을 위해 그들을 사용합니다.
8. 네 2 μl를 확인 (8 μL 총 VOLUME, 2mm 주동이와 부상 사이트의 꼬리가에 좌우 4 × 10 ^5의 NPC) 척수 주사를 포함. 경질의 개봉 후, 해밀턴 마이크로 유리 모세관에게 척수의 등쪽 표면 아래에 1.5 mm를 삽입하고 세포 현탁액의 2 μl를 주입. 약 0.5 μL / 분 (분)에 주입 속도를 선택합니다.
9. 각각의 주입 및 코드 중 모세관의 제거 전에 끝에서, 새로운 세포 부피를 수용하기 위해 연신 적어도 1 분 허용 조직 기다린다. (그림 2)

경막 3. 주입은 성장 인자 응용 프로그램 용 펌프

1. 세포 생존을지지하는 성장 인자와 뇌척수액 (CSF)을 풍부하게하기 위해, 0.5 μL / hr의 희석율, 0.04의 카테터 직경, 7~14일 걸쳐 서브 durally 성장 인자 희석 마이크로 삼투 펌프를 사용하여 cm 외경, 100 μL의 저장 볼륨.
2. 바람직한 성장 인자를 선택(예를 들어, 뇌 유래 성장 인자 (BDGF), 표피 성장 인자 (EGF), 섬유 아세포 성장 인자 (FGF))는, 펌프 6-10 시간 전에 주입을 채우고 37 ℃에서 수욕 펌프 평형.
3. 즉시 NPC 주사 한 후, 펌프를 배치하는 피하 홈을 준비합니다. 바람직한 위치는 펌프 자체로 인한 큰 불편을 회피 로컬 thoraco- 복부 영역의 좌우 측면이다.
4. 성장 인자의 높은 농도를 얻기 위해, 카테터의 선단이 개방 병변 사이트 주변 끝내는데. 따라서, 인접 상위 또는 하위 레벨의 스킵 - 후궁 절제술을 수행합니다. SCI가 C7 / T1에있을 경우, 예를 들어, C5의 작은 후궁 절제술을 수행한다.
5. 피하 홈에 펌프를 넣어 필요한 길이로 카테터를 단축하고 운동 관련 전위를 방지 척추 주위 근육에 여러 봉합 (6.0)로 고정합니다.
6. 날카로운 끝 (C5에서, 예를 들어) 경질을 연 후바늘, 경막 하 공간에 카테터를 소개하고 어떤 저항없이 코드를 부상없이 꼬리 방향으로 활공 할 수 있습니다. 예 C6의 생략 된 얇은 판은 카테터의 고정 및 안정화 등의 추가 포인트를 제공합니다.
7. 카테터가 원활하게 실행 및 배되어 있지 않은지 확인하십시오.
8. 봉합 또는 클립 레이어 닫기에 의해 근육, 피부,. (그림 3)
9. 마취를 중지하고 흉골 드러 누움에 대한 충분한 의식을 차릴 때까지 지속적으로 관찰 아래에있는 동물 웨이크 업 할 수 있습니다. 마지막으로, 하나의 새장에 다시 넣을 및 수술 후 치료 지침을 따르십시오.
10. 비록, 동물이 시간 시점에서 부분적으로 회복 할 수있는 특수 수술 후 치료를 제공합니다 :
    1. (3 일, 5 일 각각 임상 증상에 따라 대한 Buprenorthine과 멜 록시 캄) 진통제를 관리.
    2. 2 일전까지 물을 병에 항생제를 제공칠일 수술 후 (예를 들어 Moxifloxacine).
    3. 필요한 아직도 경우, 방광을 압박 계속합니다.
    4. 쥐가 탈수 나타날 경우 추가 피하로 준다.
    5. 적어도 하루에 한 번 운영하는 동물의 신경 학적 기능과 생리 학적 상태를 관찰하십시오.
    6. 2 일전 NPC 주사를 면역 억제 치료를 관리하고 7 일 후 transplanation (미노)과 희생까지 (sandimmune)까지 각각.

4. 조직 평가

1. 관측 시간의 끝 (예. SCI 후 사주) 깊은 마취 (5 % 아이소 플루 란 2 ~ 3 분)에서에서 동물을 희생하고 4 찬 150 ml의 다음 50 ㎖ 감기 (4 ° C) 생리 식염수로 transcardially을 관류 0.1 M 인산 완충 식염수 (PBS)에서 % 파라 포름 알데히드.
2. 척수를 제거하고 24 시간 동안 0.1 M 인산 완충 식염수 (PBS)에서 4 % 파라 포름 알데히드에 넣어.
3. 48 시간 동안 cryoprotection에 대해 25 % 자당 용액에 척수를 넣습니다.
4. <30 ㎛의 두께와 길이 저온부를 제공합니다.
5. 배경 사용 DAPI (1,000 일)를 제공하는 모든 세포 핵의 면역 조직 화학 염색하십시오. DsRed의 긍정적 인 NPC의 빨간색 표시, QL-6 FITC는 녹색 표시, 둘 다, 따라서 특별히 염색 할 필요가 없습니다. (그림 4).
6. 주사 전자 현미경 (SEM)을 위해 샘플을 2 시간 동안 12 ° C에서 글루 타르 알데히드에 담근 5 분 동안 에탄올 10 % 증분 단계에서 천천히 탈수하고, 1 시간 동안 가압 액체 CO ₂ 사이펀에 배치하자. 스퍼터 코터를 이용하여 금을 코트 지지체. 히타치 S-3400N 주사 전자 현미경으로 이미지를 가져 가라. (그림 5)

결과

전술 한 절차를 수행하면. SAP 지지체 캐비티를 브리징하고 억제 환경의 개선, 적은 조직 무섭게 및 NPC 생존의 증가를 제공 얻을도 4 윌 얻어지는 랫트 척수의 종단면을 도시 부상 사이트 SCI 후 6 주에서 QL6의 SAP 주입 및 NPC 이식 후 사주. QL6 펩티드가 성공적으로 진원지에서 집계, 코드에 주입 반그림자에 rostro - 꼬리 쪽을 확산되었다. 전자 현미경도 5에, 상기 프로그램...

토론

이 프로토콜은 래트에서 경추 손상 모델을 수행 할 수 있도록 독자 자궁 SCI 후 잘 회복을 촉진하고있는 SAP의 NPC와 결합 된 처리 방법을 사용하기 위해 개발되었다.

특히 (헤미) -transection 모델 또는 체중 감소 및 진동 모델, 클립 타박상 / 압축 모델이 주요 병태 생리 학적 외상 메커니즘을 모두 나타내는 다른 자궁 경부 외상 모델에 비해 - 타박상 및 압축률 때문에 모방 최고의...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aneurysmal clip	SharpTech
Surgical microscope	Leica
Micro injection system	World Precision Instruments, Inc.
Small animal stereotaxic instrument	David Kopf Instruments
Hamilton syringe	Hamilton company
Subdural pumps	Alzet osmotic micro pump 1007D
Surgical instrument	Fine Science tools
Isoflurane USP	Pharmaceutical Partners of Canada Inc.
0.9% Sodium Chloride injection USP	Baxter
7.5% Povidone iodine	Purdue Pharma
70% Isopropyl alcohol USP	GreenField Ethanol Inc.
QL6 SAP	Covidien
0.4% Trypan blue	Gibco
Platelet-Derived Growth Factor (PDGF)	Sigma
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma
Fibroblast Growth Factor (FGF)	Sigma