침투 림프구의 분석을위한 비 효소 해리 신선한 인간의 조직에 대한 간단하고 빠른 프로토콜

요약

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45⁺ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

초록

선천성 및 후천성 면역 반응 모두에서 종양 탈출 특징으로 면역 시스템을 무력화하는 악성 세포의 능력은 지금 암의 중요한 특징으로 받아 들여진다. 유방암에 대한 우리의 연구는 종양 침윤 림프구가 종양의 진행과 환자 결과에서 재생하는 적극적인 역할에 초점을 맞추고있다. 이 목표를 향해, ​​우리는 그들의 원래 상태로 그들을 근접 평가하기위한 노력의 일환으로 정상 및 비정상 조직에서 그대로 림프 세포의 신속한 분리를위한 방법론을 개발했다. 표면 수용체 발현 비교하는 효소 - 소화 된 조직을 유지하면서 기계적 dissociator 쇼 모두 증가 된 생존율 및 세포를 회수하여 제조 균질. 또한, 나머지 불용성 물질의 소화 효소는 기본 균질의 양적, 질적 측정 가능성이 진정으로 조직 fragm에 침투 부분 집단을 반영하는 것을 나타내는 추가 CD45 ⁺ 세포를 복구하지 않았다천만에. 이러한 균질 림프 세포는 쉽게 면역 (표현형, 확산 등) 또는 분자 (DNA, RNA 및 / 또는 단백질)을 이용하여 특성화 할 수 접근한다. CD45 ⁺ 세포는 모집단 정화 시험 관내 팽창 또는 냉동 보관을 위해 사용할 수있다. 이 접근법의 또 다른 장점은 균질 물에서 뜨는 기본 조직과 정상 조직에서 악성 사이토 카인, 케모카인, 면역 글로불린 및 본 항원을 특성화하고 비교하기 위해 사용될 수 있다는 점이다. 이 프로토콜 기능을 매우 잘 인간 유방 조직 및 정상 및 비정상 다양한 조직에 적용 할 수 있어야한다.

서문

The tumor microenvironment is composed of various cell types with numerous studies showing they each play distinct and important roles in tumorigenesis^1,2. These include, but are not limited to, infiltrating immune cells, stromal cells, endothelial cells and tumor cells³. Ex vivo studies of tumor infiltrating lymphocytes (TIL; CD45⁺ cells or leukocytes, which are predominantly lymphocytes in breast tumors) from fresh human tissue samples is made difficult by their low frequency, the small sample sizes often available for research and the potential for loss of viability during extraction. Because immune cells infiltrating tumors are usually present as passengers rather than permanent residents in general they are easier to release from the tissue matrix.

Dissociating tumor tissue while maintaining cellular integrity is technically challenging and has traditionally been performed using a combination of mechanical and enzymatic steps to prepare single cell suspensions^4-8. This approach involves lengthy incubation periods and is associated with a significant reduction in cell viability as well as the loss of cell surface receptors by enzymatic cleavage. High quality flow cytometric studies characterizing TIL in the tumor microenvironment as well as clean purifications of CD45⁺ subpopulations by flow cytometry or antibody-coated beads are more difficult to achieve from enzyme-digested tumor tissue. In addition, the supernatant (SN) from the resulting tumor homogenate is not amenable to further analysis including quantification of secreted proteins (cytokines, chemokines, immunoglobulins or tumor antigens) or experimental treatment of normal cells, because of the potential for protein degradation in the enzymatic digests.

In our search for a method to prepare single cell homogenates from breast tissues [including tumor, non-adjacent non-tumor (NANT) and normal (from mammary reductions) breast tissues] without enzymatic digestion, we tested a variety of mechanical homogenization techniques. Homogenates prepared using a mechanical dissociator had increased cell viability (2-fold) and total cell recovery (2-fold) while preserving surface receptor expression. Enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45⁺ cells suggesting they were all released in the initial homogenate. Thus, this rapid and simple approach allows both qualitative and quantitative assessment of the CD45⁺ subpopulations present in various normal and malignant human tissues. An added advantage of this approach is that the SN from the initial homogenate (primary tissue SN) can be collected and stored for further analysis or experimentation.

프로토콜

참고 : 모든 표본은 각 환자에서 얻은 정보를 담은 서면 동의 연구소 쥘 보르 데의 의료 윤​​리위원회의 승인을 프로토콜을 사용하여 획득 하였다.

조직 파쇄 1. 준비

1. 절제된 조직 (수술실에서 절제 악성 및 정상 조직)를 해부 즉시 픽업 훈련받은 사람이 병리 실험실에 있습니다. 종양, NANT는 (가능한 한 종양에서 가장 먼 거리를 촬영) 및 정상 조직의 조각은 정기적으로 (1) 내에 처리 - 인체 조직에 대한 표준 바이오 안전성 절차를 사용하여 BSL2 실험실에서 수술 절제의 3 시간. 프로토콜의 흐름도는도 1에 도시되어있다.
2. 모든 조직편 (정상 및 종양 NANT)을 달아 길이, 폭, 높이 (길이 x 폭 x 높이)를 측정한다. 이는 세포의 개체군에 대한 후속 정규화 중요한 단계, 추출 된 RNA 등이며
   NOTE : 샘플 크기의 범위는 더 지방이 가능하다면 100 10,000 mm의 ^3입니다.
3. 조직이 실제로 종양의 일부임을 확인하기 위해 H & E 염색 용 유리 슬라이드에 종양 조각을 각인.
   1. 종양 조각에 유리 현미경 슬라이드를 누르면 몇 초 동안 손가락으로 부드럽게 압력을 적용하여이 작업을 수행합니다.
   2. 물에 세척 과정에서 다음 2 분 동안 이소프로판올과 슬라이드를 수정합니다. 마이어의 헤 마톡 실린 30 초 동안 조직을 Counterstain과.
   3. 물 여섯 화장실에서 슬라이드를 씻으십시오. 15 초 동안 Phloxine B 2 % 얼룩.
   4. 물 한 욕조와 이소프로판올 및 마무리의 네 화장실 의해 물 한 욕조에 씻으십시오.
   5. 1 분 드레인에 대한 이소프로판올에 품어. 자일 렌의 두 화장실에 걸린.
   6. 자일 렌을 기반으로 장착 매체를 마운트합니다. 종양 세포 수 (그림 2)에 대한 검사.
      참고 : - 기질, 림프 또는 광고 주로 종양 세포가 각인 된 슬라이드에 충실ipose 세포는 거의 종양 세포 사이에 공간을두고, (그림 2) 남아.
4. 멸균 사용 - 화학적으로, 무 혈청 조혈 세포 배지 1 ㎖를 함유하는 작은 배양 접시에서 조직 단편을 배치 작은 조각 (2 ㎜ × ² ~ 1)로 그것을 실온에서 (이하 매체 라 함)와 주사위 메스.
5. 기계 dissociator의 C 관 (조직 조각 + 매체) 모두를 전송합니다.
6. 파스퇴르 피펫을 사용하여 매체의 2 ㎖로 배양 접시와 메스를 씻어 C 관 (해리에 대한 매체의 볼륨 = 3 ㎖)이 추가.
7. 단일 세포 현탁액에 조직 조각을 균질화 C 튜브의 기계적 dissociator 프로그램 A.01 (가장 부드러운 프로그램)를 사용합니다. (한 사이클 = 25 초) 장치에서 C 튜브를 놓고 두 번 연속으로 프로그램을 실행합니다.
   참고 :이 균질화 절차는 설립과 인간의 유방 조직, 다른 다치 대한 검증되었습니다또는 또는 조직 유형이 다른 프로그램을 사용해야 할 수도 있습니다 먼저 테스트해야합니다.
8. 장치에서 C 튜브를 제거하고 50 ML 튜브에 앉아 40 μm의 셀 스트레이너에 직접 균질을 가만히 따르다. 단계 1.6에서와 동일한 파스퇴르 피펫을 사용하여, 셀 스트레이너로 C 튜브에 남아있는 액체를 옮긴다.
9. 1 ㎖의 마이크로 피펫 팁을 사용하여 15 ML 튜브에 여과 된 액체를 전송합니다. 일시적으로 셀 스트레이너 및 50 ml의 튜브를 유지.
10. 배지 3 ㎖로 추가로 C 튜브를 헹구고 여전히 다시 50 ㎖ 튜브에 장착 셀 스트레이너로, 단계 1.6에서와 동일한 파스퇴르 피펫을 사용하여,이 전송. 부드럽게 연속적으로 용출액 오염을 막기 위해 폐기 된 깨끗한 파스퇴르 피펫 또는 1 ml의 팁을 사용하여 여과기 주위를 이동하여 50 ㎖ 튜브에 unhom​​ogenized 조직에 갇혀 잔류 액의 최대 양을 짜내.
11. 거꾸로 t의 셀 스트레이너를 배치그는 원래 C 튜브와 unhom​​ogenized 조직은 다시 C 튜브에 떨어질 수 있도록 매체의 3 ㎖ 씻어.
12. A.01 프로그램의 두 사이클 단계 1.7로 다시 균질화.
13. 50 ML 튜브에 앉아 셀 스트레이너를 통해이 두 번째 균질을 붓고, (단계 1.10에서와 같이) 3 ㎖ 매체를 다시 C 튜브를 씻어 다시 최대 압박 50 ML 튜브에 앉아 셀 스트레이너에 파스퇴르 피펫으로 전송 셀 스트레이너에 갇혀 잔류 결합 조직으로부터 액체의 양.
14. 이 시점에서, ~ 2.5 ml의 부피는 15ml의 튜브이고 ~ 50 ㎖ 튜브에서 9 ㎖의.

조직의 상층 액과 세포의 2. 분리

1. 실온에서 600 XG에서 15 분 동안 15 ㎖ 중의 균질 물 및 50 ㎖ 튜브를 원심 분리기.
2. 깨끗한 튜브에 15 ML 튜브에서 SN을 가만히 따르다 일시적으로 4 ℃에서 저장한다. 이 뜨는 = 차 종양, NANT 또는 정상 TIssue SN (최종 부피 2.5 ml)을 연속적으로 정화와 미래 분석 (아래 참조) -80 ° C에서 저장 이전에 분주합니다.
3. 50 ML 튜브에서 상층 액을 제거한다.
4. 부드럽게 1ml의 배지의 최종 부피 모두 세포 펠렛을 재현 탁. 요약하면, 첫째 부드럽게 (딱딱한 표면에 튜브를 눌러) 모두 튜브에 세포 펠렛을 휴식. 배지 500 μL와 50 ml의 느슨한 세포 펠렛을 재현 탁하고 제 펠렛을 재현 탁하는 15ml의 튜브에이 세포 현탁액을 전송. 세포의 최대 복구를위한 매체의 두 번째 500 μL 한 번이 단계를 반복합니다.
5. 혈구를 사용하여 생존 세포의 수를 계산하고 : 작은 튜브로 전송 세포 현탁액 10 μL은 트리 판 블루 10 μL (희석 한 1)과 혼합한다.
   주 :이 시점에서 세포 현탁액의 분획은 또한 셀 크기, 입도를 평가하는 유동 세포 계측법에 의해 분석 될 수 있고 더 PREC 모집단에 대한 마커의 수가 제한 원한다면이전에 광범위한 분석이나 실험에 균질의 상대적인 세포 분포의 이세 평가. 흐름에 의해 모든 분석은 세포 계측법 개체군의 정상화 CD45 라벨을 통합합니다.
6. 실온에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 종양, NANT, 또는 정상 조직에서 셀은 추가의 정제 또는 분석을위한 준비가되어 있습니다. 수술과 같은 날에 수행 할 때 이러한 추가 단계가 최상이다.
   주 : 유세포 분석뿐만 즉시 1 초 동안 볼 텍싱, 세포 펠렛을 적혈구 세포 용해 완충액 0.4㎖를 첨가하고 방에서 10 분의 최소 배양하여 항체 라벨링 후 용해되어야 잔류 적혈구 세포 분류되지 분석하기 전에 온도 (빛으로부터 보호).

조직 뜨는 3. 명확화

1. 4 ℃에서 15 분 동안 15,000 XG에서 조직 SN와 1.5 ml의 튜브를 원심 분리기.
2. 조심스럽게 t 제거그는 만지거나 펠렛을 방해하지 않고 뜨는. 수와 원하는 분량의 볼륨에 따라 깨끗한 튜브 (또는 튜브)에 전송합니다.
3. 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 뜨는을 저장합니다.

4. 환자의 혈액

1. 헤파린 튜브에 정맥 천자에 의한 제어 수술 전에 일 각 환자의 혈액 샘플을 수집합니다. 혈장과 버피 코트를 얻기 위해 브레이크 오프 20 ºC에서 10 분 동안 400 XG에 혈액을 원심 분리기.
2. 혈장을 분리하고 20 ºC에서 15 분 동안 10,000 XG에서 원심 분리하여이를 명확히. 향후 사용을 위해 -80 ° C에서 나누어지는 및 저장 플라즈마. 매체에서 버피 코트를 희석
3. 즉시 분석 모집단 분리, DNA / RNA / 단백질 추출 또는 동결에 앞서 표준을 Ficoll-hypaque 구배 원심 분리를 이용하여 단핵 세포를 분리.

5. 유동 세포 계측법

1. 제조에 따라 라벨 세포빛으로부터 보호 4 ° C에서 R의 지침. 세포 펠렛을 세포 용해 완충액 0.4 mL를 넣은 후 표지 항체 조직편으로부터 세포 현탁액를 Lyse 적혈구.
2. 소용돌이는 즉시 1 초간 및 빛으로부터 보호 실온에서 10 분의 최소, 부화. 세척하지 않고 데이터 수집을위한 유동 세포 계수기에 표시된 세포를 전달합니다.

결과

시판 티슈 해리 용액 또는 콜라게나 제의 다양한 실험 혼합물의 DNase 및 / 또는 히알루로니다 제 억제제 중 하나와 조직 절편의 소화 효소는 세포 표면 수용체의 다양한 절단. 최초 유방 종양 침윤 CD4 ⁺ T 세포에 대한 우리의 연구가 집중, 신속 인해 소화 효소 표준 ^{프로토콜을} 사용하여 ^4-8 표면 CD4 수용체의 절단에 중요한 기술적 문제를 제시 하였다. 우리는 높은 생존 성 림...

토론

이 연구는 이후의 세포 분류, 추출, 동결 보존 및 / 또는 CD45 ⁺ 개체군의 표현형 분석을위한 소화 효소없이 정상 및 악성 유방 조직 균질의 빠른 준비를위한 최적화 된 방법을 설명합니다. 이 실험적인 접근의 목표는 밀접하게 자신의 생체 상태를 반영하고 수술실에서 신선한 조직의 최소한의 조작으로 정상 조직에 비교 TIL의 이미지를 생성하는 것입니다. 지금까지, 우리의 실험실>...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber	Marienfield	640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain
VersaLyse	Beckman Coulter	A09777	for flow cytometry experiments
Fixable viability Dye eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	for flow cytometry experiments
anti-CD3 FITC	BD Biosciences	345763	for flow cytometry experiments
anti-CD3 Vio Blue	Miltenyi Biotec	130-094-363	for flow cytometry experiments
anti-CD4 PE	BD Biosciences	345769	for flow cytometry experiments
anti-CD4 APC	Miltenyi Biotec	130-091-232	for flow cytometry experiments
anti-CD8 ECD	Beckman Coulter	737659	for flow cytometry experiments
anti-CD8 PerCP	BD Biosciences	345774	for flow cytometry experiments
anti-CD19 APC-Vio770	Miltenyi Biotec	130-096-643	for flow cytometry experiments
anti-CD45 VioGreen	Miltenyi Biotec	130-096-906	for flow cytometry experiments