도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

요약

To investigate the blood-retinal barrier permeability and the inner limiting membrane integrity in animal models of retinal disease, we used several adeno-associated virus (AAV) variants as tools to label retinal neurons and glia. Virus mediated reporter gene expression is then used as an indicator of retinal barrier permeability.

초록

뮐러 세포는 망막의 주요 신경교 세​​포이다. 최종 - 피트는 외측 및 내측 제한 멤브레인 (ILM)에서 망막의 한계를 형성하고, 성상 세포, 외막 세포 및 내피 세포와 함께 이들은 혈액 망막 장벽 (BRB)을 확립한다. ILM은 망막과 유리체 사이에 조직 학적 경계를 정의하는 기저막 역할을하면서 BRB는 혈류와 망막 사이의 물질 이동을 제한합니다. 뮐러 세포 레이블링이 세포는 BRB와 ILM의 중요한 부분으로, 망막 장벽의 물리적 상태를 연구하는 것이 특히 관련이있다. BRB와 ILM 모두 자주 망막 질환에서 변경 및 질병 증상에 대한 책임이 있습니다.

이러한 에반스 블루 분석 또는 형광 안저 촬영 등의 BRB의 무결성을 연구하는 몇 가지 잘 확립 된 방법이있다. 그러나 이러한 방법들은 BRB 투과도 (T)의 범위에 대한 정보를 제공하지 않는다나노 미터 범위의 더 큰 분자, O. 또한, 그들은 같은 ILM 다른 망막 장벽의 상태에 대한 정보는 제공하지 않는다. 망막 ILM과 함께 BRB 투과성을 연구하기 위해, 우리는 질병 상태의 ILM과 세포 외 기질 단백질의 상태를 나타내는 동안 큰 분자 BRB의 투과성에 대한 정보를 제공 AAV 기반의 방법을 사용했다. 두 AAV 변종은 연구에 유용 : AAV5 및 ShH10. AAV5은 광 수용체에 대한 자연적인 굴곡 운동이 있지만 ILM이 손상되지 않은 경우 (야생 형 망막에 즉,) 유리체에 투여시는 외부 망막에 걸쳐 얻을 수 없습니다. ShH10는 신경 교세포 대한 강한 향성을 가지고 있으며, 선택적으로 건강하고 병에 걸린 망막 모두에서 뮐러 아교 세포 레이블을 것입니다. ShH10는 ILM이 손상되어 망막에보다 효율적인 유전자 전달을 제공합니다. 면역 조직 화학 및 혈액 DNA 분석과 함께 이러한 바이러스 도구는 질병 망막 장벽의 상태에 빛을 흘렸다.

서문

뮐러 세포는 망막의 폐해 주요 성분이다. 형태 학적으로, 이들은, 유리체와 접촉하는 반경 방향 및 망막 endfeet을 스팬 ILM 후자의 비밀 컴포넌트를 직면한다. ILM는 약 10 가지 세포 외 기질 단백질 (라미닌, 아 그린, perlecan, nidogen 콜라겐 여러 헤파린 설페이트 프로테오글리칸)로 이루어지는 기저막이다. 개발하는 동안, 그 존재는 신경절 세포 ^1-3의 망막 histogenesis, 시신경 축삭의 탐색 및 생존을위한 필수적이다. 그러나, ILM 성인 망막 본질적인이고 수술 ^사 망막 ^{손상시키지} 않고 특정 병리에서 제거 될 수있다. 유전자 치료에있어서, 상기 멤브레인 주입술 ⁵ AAVs를 이용한 망막의 효율적인 전달을위한 물리적 장벽이된다.

그들의 프로세스의 광범위한 arborization을 통해 뮐러 세포 영양 및 규제 suppo을 제공RT 망막 신경 세포와 혈관 세포 모두에. 뮐러 세포도 BRB ^(6)의 형성과 유지에, 망막 항상성의 조절에 관여한다. 꽉 접합 망막 모세 혈관 내피 세포 사이에, 뮐러 세포, 성상 세포와 혈관 주위 세포는 BRB를 형성한다. BRB는 당뇨 망막 병증, 망막 정맥 폐쇄 및 호흡기 질환 등 retina.In 많은 질병에 들어가는 특정 물질을 방지, 망막의 저산소증은 BRB ^7-9을 통해 누출이 발생합니다. 이 파열은 vasogenic 부종, 망막 박리와 망막 손상으로 이어지는 혈관 투과성의 증가와 연관되어있다.

뮐러 세포와 밀접 모두 BRB ILM 무결성에 중요한 역할을하고, 혈관 기저막과 연관된다. 따라서, 뮐러 아교 세포의 레이블을 다음 망막 장벽의 물리적 상태의 연구에 특히 관련이있다.

고전적인아군, BRB 투과성 혈장 알부민 비공유 결합 에반스 청색 염료의 전신 주입 이루어진 에반스 블루 분석법을 이용하여 측정된다. 상기 분석은 망막 혈관 ⁽¹⁰⁾ (프로토콜 섹션 5 참조)에서 알부민 누설 (중간 크기의 단백질, ~ 66 kDa의)을 측정한다. 또한, 혈관 누출 형광의 누설 증명 형광 망막 혈관 조영술에 의해 가시화 될 수있다 (작은 분자 ~ 359 다; 프로토콜 제 6 장 참조) ^11. 그럼에도 불구하고, 두 방법은 작은 분자와 단백질에 BRB 투과성의 평가를 할 수 있지만 ILM의 무결성에 대한 정보를 제공하지 않습니다.

따라서, BRB 투과성 공부, 우리는 큰 분자 (예를 들어, AAV 입자, 25 nm의 직경)에 BRB 투과성에 대한 정보를 제공 AAV 기반 방법을 사용 하였다. 사실, 우리의 방법은 그 제안하는 혈액에 AAV 전이 유전자의 존재를 감지 할 수 있습니다 ~ 25 nm의 직경 입자 것혈류로 침투 할 수 있습니다. 이 방법은 또한, 병리 적 상태의 ILM 및 세포 외 기질 단백질의 구조에 대한 정보를 제공한다. 두 AAV 변종은 연구에 유용 : AAV5 및 ShH10. Subretinally 주입, AAV5은 광 수용체와 망막 색소 상피 ^(12)에 대한 자연적인 굴곡 운동이 있지만 그대로 ILM ^5,13 야생 형 망막의 유리체에 투여시는 외부 망막에 걸쳐 얻을 수 없습니다. ShH10 특별히 신경 세포 ^{(14, 15)을} 통해 아교 세포를 대상으로 설계되었습니다 AAV의 변종이다. ShH10 선택적으로 손상된 장벽 ^(16)와 망막의 효율성 향상과 건강하고 병에 걸린 망막 모두에서 뮐러 세포 레이블. immuhistochemistry 및 혈액 DNA 분석과 결합 된 이러한 바이러스 도구 망막 장벽의 상태 및 질환에서의 관여 (도 1)에 대한 정보를 제공한다.

프로토콜

본 연구에 사용 된 모든 동물은 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용을위한 ARVO 방침에 따라 마음에 든다고 및 처리되었다.

HEK-293 세포를 ^{17, 18의} 일시 발현에 의해 재조합 AAV (rAAV) 1. 생산

참고 : 맥 클루 C, (2011) ¹⁹ 조브를 참조하십시오.

1. AAV 벡터 플라스미드의 대규모 플라스미드 제조 (적어도 1 ㎎ / ㎖)을 정제. 3 플라스미드를 사용합니다. AAV 역전 된 말단없이 복제 및 캡시드 유전자를 운반하는 AAV 헬퍼 플라스미드 LTR에, AAV ITR이 전사 플라스미드로 지칭 운반 유전자 발현 카세트, 및 아데노 바이러스 헬퍼 유전자 E2, E4 및 VA RNA 유전자를 공급하는 플라스미드를 지칭 됨 반복 pHELPER으로합니다.
2. 이 3 개의 플라스미드 폴리에틸렌 이민 (또는 다른 형질 전환 시약)을 사용하여 293 세포를 형질 감염. 형질 전환 효율이 80 % 이상인 양호한 VI에 필요RAL 수익률.
3. iodixanol 기울기에 293 세포 용 해물에서 재조합 AAV를 정화. 15 %, 25 %, 40 % 및 60 % iodixanol 그라데이션을 획득하기 위해 사용된다. , AAV 입자를 함유하는 40 % iodixanol 분획 수집 0.001 % 플루로 PBS에 대해 1 시간 및 완충액 교환 (인산 완충 생리 식염수)에 대해 500,000 XG에서 초 원심 분리 한 후 분획을 농축시킨다.
4. 바이러스 게놈 역가 ^(20)를 확인하려면, QPCR 다음에 DNase의 ProteinaseK 다이제스트를 수행합니다. 정방향 및 역방향 프라이머는 AAV2 ITR 위치한 62 BP 영역을 증폭. 표준 플라스미드, 프로브는 FAM으로 표지하고 (BHQ) 소광 블랙홀 갖는다.
5. ITR 프라이머, 100 nM의 순방향 ITR 프라이머, 100 nM의 AAV2 ITR 프로브, 0.4 mM의 dNTPs를, 2 mM의 MgCl2를, 1X 백금의 Taq 완충액, 1U 백금 역방향가 340nm를 사용하여 25 μL의 최종 부피의 qPCR (정량적 폴리머 라제 연쇄 반응)을 수행 DNA 형성 촉매 5 μL 템플릿 (표준, 샘플 및 템플릿없이 제어).
6. 용표준은, 연속 희석을 배 10 7 X에 형질위한 플라스미드를 사용하여 (5 μL ^10월 10일에서 10월 4일까지 게놈 / ㎖의 최종 농도에서 얻어진 2 × ^{109 3} 10 2 × 게놈 / ㎖ 각각).
7. 변성의 40주기 다음에 15 분 동안 95 ° C에서 초기 변성 단계에 의해 프로그램을 시작 1 분, 어닐링 / 신장 95 ℃에서 1 분, 60 ° C에서. 단기 기억이나 장기 저장 기간 동안 -20 ℃에서 4 ℃에서 보관.

AAV 2. 유리체 강내 주입

1. 케타민 (50 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)와 C57BL6J 마우스를 마취의 반사, 적절한 마취를 나타내는 철수 반사와 꼬리 핀치 응답을 바로 잡고의 손실을 확인합니다. neosynephrine 5 %의 각막 응용 프로그램에 의해 동공을 확장하고 안약 0.5 % mydriaticum. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
2. 초 미세 30 G의 disposab 전달제작 : 적도를 통해 바늘과 유리체에, 윤부 옆에 (애기 K, 주피터 (2007) ^{21 참조).} 유리체의 중심에 바늘의 직접 관찰과 ShH10-GFP 또는 AAV5-GFP의 1 10 × 4 ⁽¹¹⁾ 부사장을 포함하는 1 μL 재고 (그림 1)을 주입한다. ILM 실험에 대한 제어로 한쪽 눈을 사용하십시오. BRB 실험에 두 눈을 주입한다. 주입 눈에 항 염증 항균 국소 치료를 적용합니다.
3. neosynephrine와 동공을 확장하고 mydriaticum 눈 이미징 떨어진다. GFP (녹색 형광 단백질) 식 일주, 이주 1 월, 유리체 강내 주입되어 2 개월 후 (그림 1)을 따라 안저 카메라로 안저 검사를 수행합니다. CO ₂ 흡입 1-2개월 후 주사로 쥐를 희생.

3. 면역 조직 화학

1. 망막 저온부 (그림 1)의 경우, L을 제거하는 탈핵 눈을 해부1 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 ENS와 각막 및 침수 수정.
   1. 실온에서 1 시간, 실온에서 또 다른 시간 동안 20 % 수 크로즈 10 % 수크로오스에 미리 고정 눈 Cryoprotect. 밤새 4 ° C에서 30 % 자당 용액 Cryoprotect. 동결 등을 알아내는 매트릭스로 수지를 포함에 eyecups을 포함합니다. 10 μm의 저온부를 확인하고 특수 냉동 조직 절편 치료를 슬라이드에 마운트하고 그 염색시 조직의 준수를 향상시킬 수 있습니다.
   2. 5 분 동안 PBS pH를 7.4에서 0.1 % 트리톤 X100와 섹션을 Permeabilize 하시려면. PBS에서 세척 배 및 블록 1 % BSA와 함께 PBS에서 실온에서 1 시간, 0.1 % 트윈 20 대.
2. 망막 flatmounts (도 1)의 경우, 박리를 용이하게하기 위해 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드에서 탈핵 쳐다.
   1. 15-30 분에서, 각막 및 렌즈를 제거하는 눈을 해부. ORA 세라 주위 절단함으로써 망막 색소 상피 (RPE) 및 공막으로부터 망막을 분리하고,시신경. 망막 및 형질 망막 세포에 형광 단백질 (고정이 24 시간을 초과 할 수 없습니다) 해결하기 위해 또 다른 30 ​​분 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 담가. 멸균 PBS, pH가 7.4에서 5 분을 씻으십시오.
   2. (1 % BSA, 2 % 정상 염소 또는 당나귀 혈청 PBS, 0.5 % 트리톤 X-100) 버퍼를 차단하는 PBS를 변경하고 실온에서 4 시간 또는 4 박 ° C 중 하나에 대한 버퍼를 차단에 품어.
3. 실온에서 또는 4 ° C에서 하룻밤 중 4 시간 동안 차단 버퍼에 차 항체와 조직을 품어. PBS로 세척 배.
   참고 : 다음과 같이 사용 된 항체는 다음과 같습니다 항 라미닌 (/ 1,000 1) 라벨 ILM, 안티 로돕신 클론 4D2 (1/500) 표시 막대, 안티 - 글루타민 합성 효소 클론 GS-6 (1 / 1,500) 라벨 뮐러 세포 , PNA 렉틴 (1/40) 라벨 콘.
4. 방 템피에서 1 시간 (저온부) 또는 2 시간 (flatmounts)에 대한 버퍼를 차단에 알렉사 형석 복합 이차 항체의 500 희석 : 1 조직을 품어rature와 빛으로부터 보호. PBS로 세척 배.
5. 망막 완화 컷을 확인하고는 광 수용체 또는 망막 신경절 세포 (RGC) 어느 한쪽이 위쪽으로 향하게하여 유리 슬라이드에 flatmount. 4 ° C에서 coverslip에 저장을 적용, 수성 mountingmedium를 추가합니다.
6. 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 공 초점 현미경을 수행합니다. 여기 및 발광 크로스 토크를 줄이기 위해, 이미지 라인으로 순차적으로, 라인을 획득. 표본화 정리에 따라 스텝 크기를 정의합니다. 최종 이미지에 과포화 픽셀을 최소화 노출 설정을 사용합니다. Z-프로젝트 기능에서 최대 강도를 사용하여 마지막 8 비트 RGB 색상 모드로 변환 한면에 피지와 프로세스 12 비트 이미지, 프로젝트 Z 섹션.

마우스의 혈액 샘플 4. PCR 분석

1. 마취 C57BL6J 마우스의 음경 정맥 AAV-GFP의 1 내지 10 행 × 4 ¹¹ 입자를 함유하는 100 μL 스톡 (5 % 이소 플루 란을 주입초 미세 6mm 바늘 인슐린 주사기를 사용하여 가까운 챔버 유도 및 수술 중에 코 콘을 통해 이소 플루 란의 2.5 %)에 대한. 이 동물은 AAV 입자 순환의 양성 대조군이 될 것입니다.
2. 주입하고 3 시간, 24 시간 2 일, 3 일 ShH10 유리체 강내 주입 후 또는 intrapenile 주입 (그림 1) 전후 마우스 꼬리에서 샘플 혈액. 약 10 ~ 20 μL 헤파린 튜브에 수집됩니다. 절차의 완료 후 CO ₂ 흡입 쥐를 희생.
3. 당신의 선택의 추출 키트를 사용하여 혈액 샘플에서 게놈 DNA를 추출합니다.
4. 게놈 DNA의 PCR 증폭을 수행합니다. 이 프로토콜은 다음 프라이머 쌍을 사용 GFP를, 5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 ', 안티센스 5'-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'을 감지. 다음 PCR 프로그램을 수행 하였다 : 95 ° C에서 2 분 (1 사이클); 95 ° C 45 초, 55 ℃ 1 분, 72 ℃에서 45 초 (30 회) 72 ° C 5 분 (1주기)4 ° C 유지.

5. 선택 에반스 블루 방법

주 : 에반스 블루 제 ¹⁰ 이용한 망막 혈관에서 알부민의 누설을 측정함으로써 혈관 투과성 정량화.

1. 5 ㎛의 필터를 통해 5 분간 초음파 세정기에서, 여과 및 생리 식염수 (6 ㎎ / ㎖), 초음파 처리에 의해 용해 에반스 블루 염료를 준비한다.
2. (단계 4.1, 이소 플루 란 흡입) C57BL6J 마우스를 마취 반사, 철수 반사와 적절한 마취를 나타내는 꼬리 핀치 응답을 바로 잡고의 손실을 확인하고 음경 정맥 (그림 1)을 통해 에반스 블루 (45 ㎎ / ㎏)을 주입. 쥐의 발, 총구, 귀이, 에반스 블루 주입에 따라 염료의 흡수와 분포를 확인 명확 블루가 있는지 확인합니다.
3. 케타민 (50 ㎎ / kg)과 자일 라진 (10 ㎎ / kg)와 염료의 주사 후 C57BL6J 마우스에게 3 시간 및 마취 rightin의 손실을 검증g는 적절한 마취를 나타내는 리플렉스. 샘플 intracardially 500 헤파린 튜브에 혈액 μL 및 시트르산 완충액 좌심실을 통해 2 분 동안 마우스를 관류 (0.05 M, pH가 3.5, 시트르산 7.8 g, 증류수 1 L 시트르산 나트륨 3.8 g을 용해) 혈관 수축을 방지하기 위해 37 ° C로 미리 예열. 마우스는 관류를 통해 희생된다.
4. 신중하게 관류, 명백히하다 및 후 망막을 수집하는 운영 현미경으로 두 눈을 해부하다 (3.2 절 참조). 원심 증발기에서 건조 망막 하룻밤, 무게, 그리고 (100 XG)를 진탕 65 ° C에서 18 시간 동안 포름 아미드 100 ㎕와 망막을 배양하여 에반스 블루 염료를 추출합니다. 4 ° C에서 2 시간 동안 20,798.5 XG에 30K 오메가 필터 튜브 원심 분리기 망막 샘플 및 원심 분리기 혈액 샘플을 4 ℃에서 15 분 동안 20,798.5 XG에.
5. 흡광도를 측정하기 위해 두 상층 액을 사용합니다. 최대의 흡광도 FO를 감산하여 각 시료의 흡광도를 결정740 nm에서 흡광도 최소값이 620 nm에서 에반스 블루 R. 포름 아미드 에반스 블루의 표준 곡선에서 혈장과 망막 에반스 블루 농도를 계산한다. 시간당 건조 망막 (플라즈마 / g 망막 건조 중량 / 인사 μL)의 그램 당 에반스 블루의 마이크로 리터의 BRB 투과성을 표현한다.

6. 선택적 형광 안저

주 : 마우스에서 망막 혈관으로부터 누설 나트륨 플루오 레세 인의 복강 내 주사에 의해 시각화 될 수있다.

1. C57BL6J 마우스 마취 (이소 플루 란 흡입을, 단계 4.1 참조)과 눈 (neosynephrine 및 mydriaticum)를 드랍 동공을 확장. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
2. 형광 안저 0.1 ml의 멸균 식염수에 10 %의 나트륨 형광의 복강 0.01-0.02 ml를 주입한다.
3. 안저 카메라를 사용하여 주사 후 양쪽 눈의 영상을 수집한다. 프로 후 공동으로 ₂ 흡입 쥐를 희생시저.
   참고 : 망막 혈관 조영술에 표시 될 20 초 필요하다. 형광 이미지는 주사 후 3-10 분 사이에 최대 포착되어야한다. 누설 명소 (있는 경우) 2.5 분 후에 관찰 할 수 있습니다. 나중 시점에서 화질 인해 나트륨 플루오 레세 곧 분석에 사용 된 후에 얻어지는 유리체, 따라서로 이미지 만이 확산 손실된다.

결과

동물 모델은 ILM (- B도 2a)의 구조를 도시 섭동 있다면 우리는를 사용 ShH10 뮐러 글 리아 세포의 형질 도입을 증가 망막 예상된다. 예를 들어, 우리가 Dp71의 부재에 그를 보여, ShH10 목표를 구체적으로하지만, 더 효율적으로 뮐러 야생형 마우스 ⁽¹⁶⁾ (그림 2C - F)에 비해이 마우스 라인에서 ILM의 투과성 증가를 나타내는 유리체 강내 주입하여 신경 교세포.

토론

BRB는 혈액과 망막 사이 분자의 교환을 제어한다. 그 내역은 당뇨병 성 망막증 또는 연령 - 관련 황반 변성 (AMD)과 같은 다양한 질병과 연관된다. 우리는 최근에 투과 BRB를 표시하는 디스트로핀 넉 아웃 (knock-out) 마우스에, 망막은 아데노 관련 바이러스 성 벡터 (AAV)에 의해 매개 유전자 전달에 더 관대하게 보여 주었다. 그러나, BRB 투자율 AAV 입자에도 불구하고 안구 내이 모델의 안구 구획에 국한 유...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL6J mice strain	JANVIER LABS		mice
Ketamine 500	Virbac France		anesthetic
Xylazine Rompun 2%	Bayer Healthcare		anesthetic
Neosynephrine 5% Faure	Europhta		dilatant
Mydriaticum 0.5%	Thea		dilatant
Sterdex	Novartis		anti-inflammatory
Cryomatrix embedding resin	Thermo Scientific	6769006
Superfrost Plus Adhesion Slides	Thermo Scientific	10143352	slides
anti-laminin	Sigma	L9393	antibody
anti-rhodopsin clone 4D2	Millipore	MABN15	antibody
anti-glutamine synthetase clone GS-6	Millipore	MAB302	antibody
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein	Dako	334	antibody
PNA Lectin	Invitrogen	L32459	probe
Alexa fluor conjugated secondary antibodies	Invitrogen		antibody
Fluorsave reagent	Calbiochem	345789	mounting medium
QIAmp DNA Micro Kit	QIAGEN	56304
GoTaq DNA polymerase	Promega	M3001
Evans Blue dye	Sigma	E2129	dye
5 µm filter	Millipore
Sodium citrate	Sigma	S1804
Citric acid	Sigma	C1909-2.5KG
Formamide spectrophotometric	Sigma	295876-2L
Fluorescein	Sigma	F2456	dye
Micron III	Phoenix Research Labs		Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas.
Insulin Syringes	Terumo	SS30M3109
Syringe 10 µl Hamilton	Dutscher	74487	Seringue 1701
Needle RN G33, 25 mm, PST 2	Fisher Scientific	11530332	Intravitreal Injection
UltraMicroPump UMP3	World Precision Instruments	UMP3	Versatile injector uses microsyringes to deliver picoliter volumes
UltraMicroPump (UMP3) (one) with SYS-Micro4 Controller	UMP3-1	Digital controller
Binocular magnifier SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0.66 x 5 x LEDs with stand epi and dia / Retinas dissection
Spring scissors straight - 8.5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	Retinas dissection
curved Vanna scissor	15004-08
Pince Dumont 5	11254-20
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Life technologies	4375786	Thermocycler
Ultrasonic cleaner	Laboratory Supplies	G1125P1T
Nanosep 30k omega tubes	VWR
Speedvac	Fisher Scientific	SC 110 A
Spectrofluorometer	TECAN	infinite M1000