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요약

이 프로토콜은 촬상 마우스 경부 림프절에 대한 고주파 초음파 (HFUS)의 애플리케이션을 설명한다. 이 기술은 시각화 및 경부 림프절 형태, 양 및 혈류의 정량을 최적화한다. 경부 림프절 조직 학적 평가를위한 림프 조직의 처리의 영상 유도 조직 검사도 설명된다.

초록

고주파 초음파 (HFUS)는 널리 작은 동물 실험 시스템에서 내부 해부학 구조를 이미징하는 비 침습적 방법으로 채용된다. HFUS 30 μm의 작게 구조를 감지하는 능력, 휘도 (B) - 모드에서 설치류 표재성 림프절 시각화를 위해 이용 된 특성을 갖는다. B 모드 영상과 결합 전력 도플러 림프절 및 다른 장기 내의 순환 혈류 측정을 허용한다. HFUS이 마우스 모델 시스템의 여러 림프절 촬상에 이용되었지만, 마우스에서 HFUS 이미징 및 경부 림프절의 특성을 설명하는 상세한 프로토콜은보고되지 않았다. 여기서는 HFUS 감지 및 마우스에서 자궁 경부 림프절을 특성화하도록 구성 될 수 있음을 보여준다. 결합 된 B 모드 및 파워 도플러 영상화 확대는 면역 자궁 노드에 혈류의 증가를 검출하는데 사용될 수있다. 우리는 또한 더 경부 림프절의 미세 바늘 생검을 실시하는 B 모드 영상의 사용을 설명하지DES는 조직 학적 분석을위한 림프 조직을 검색 할 수 있습니다. 마지막으로, 소프트웨어를 이용한 단계 림프절 부피 변화를 계산하고, 화상 재구성 다음 림프절 형태의 변화를 시각적으로 설명한다. 시간이 지남에 따라 시각적으로 경부 림프절 생물학에서의 변화를 모니터링 할 수있는 능력은 구강 병의 전임상 모델에서 마우스 경부 림프절 변형의 비 침습적 모니터링을위한 간단하고 강력한 기술을 제공한다.

서문

간질 조직 유체의 림프 배수는 구강 악안면 영역 1, 2에서 발생하는 감염성 미생물과 암 보급의 주요 방법이다. 경부 림프절의 임상 적 평가는 구강 내에서 발생 질환의 존재 또는 진행을 결정하기 위해 사용되는 일반적인 진단 방법이다. 이것은 구강 질병 진단 (3)에 대한 중요한 해부학 적 부위로서 수집 경부 림프절의 중요성을 강조한다. 몇몇 전문 촬상 방법은 임상 질환 경부 림프절을 식별하기 위해 이용된다. 이것들은 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 및 자기 공명 영상 법 (MR)을 포함한다. 가치가 높은 반면, 이러한 방법 모두 사용하거나 이미징 프로세스를 향상시키기 위해 순환에 광범위한 환자 준비, 고도의 전문 장비 및 / 또는 화학 물질 주입을 필요로한다.

초음파 영상 (초음파, 미국) 메신저하는 데 사용되는 일반적으로 적용되는 기술이다때문에 감염 또는 전이성 참여 4-6로 림프절로 제시 나이 경부 림프절. US 종종 외과 적 절제술 7 종양 스테이징 및 필요성을 결정하는 데 도움을 환자의 림프절 상태의 광범위한 표현을 제공하기 위해 PET-CT 및 MR 이미징과 결합된다. 미국의 비 침습적 특성은 사용의 용이성, 저렴한 비용, 최소한의 환자의 불편과 준비를 포함하여 다른 영상 방식, 이상 고유의 장점이 있습니다. 대부분의 경부 림프절의 표면 피하 위치는 미국의 진단 정확도 (8)을 개선, 증가 정밀 최소 침습 미세 침 흡인 생검을 안내 할 수 있습니다.

상업 고주파 (HF)는 미국 30 μm의 9 내부의 해부학 적 구조에 대한 자세한 해상도를 제공합니다. 22-70 MHz의 범위 트랜스 듀서를 사용 HFUS 용이하게 생체 내 조직의 실시간 영상을 허용하는 실험 쥐 다양한 시스템에 적용되어왔다.; HFUS 일반 및 특수 콘트라스트 강조 agents9의 번호뿐만 아니라, 종래의 휘도 (B) - 모드에서 종양 형성의 시각화하도록 적응되었다. HFUS로 출력 도플러를 사용하여 라이브 10,11 쥐에서 혈관 관류의 종합적인 평가를 허용 마우스 종양 내의 혈액 흐름을 모니터링하는 기능을 제공한다. HFUS 임상 적으로이 기술의 병렬 유틸리티를 보여주는 메인 체강 내의 환부 마우스 림프절를 시각화하는데 사용되었다. 특히 염증 및 전이성 내장 림프절 변경 유방 12,13, 췌장 14, 대장 암 (15) 및 폐 (16) 종양뿐만 아니라, 섬유 histocytomas 17 후천성 수신증 (18)의 세 마우스 모델을 은닉 암 마우스 모델에서 관찰 된 . 이러한 예들은 RO들의 다양한 종양 유발 림프절위한 강력한 조사 도구로서 HFUS의 값을 고화덴트 시스템.

세균 감염 19, 20 및 두경부 편평 상피 세포 암의 여러 모델 (HNSCC)는 21, 22은 임상 환경에서 이들 질환을 연구하기 위해 개발되었다. 인간과는 대조적으로, 마우스는 구강 조직 (하악, 하악 턱밑과 피상적 인 이하선 23)에서 림프 조사 세 경부 림프절을 포함합니다. 최근에는 HNSCC 24 발암 물질 - 유도 마우스 모델에서 림프절 볼륨 및 혈류의 변화를 모니터링,이 림프절의 위치 및 형태를 매핑 HFUS의 사용을보고 하였다. 여기서는, 식별 촬상 살아있는 마우스에서 자궁 경부 림프절을 분석 HFUS의 사용에 대한 상세한 프로토콜을 제공한다. 이 프로토콜은 또한 t 위에 경부 림프절 함량 변화 및 ​​병리 조직 학적 모니터링을 허용하는, 확대 된 마우스 경부 림프절 화상 - 유도 미세 생검을 실시 HFUS 사용의 실행 가능성을 보여같은 동물에 IME. 이 프로토콜은 모든 마우스에서 침습성 구강 질환 얻어진 경부 림프절 병증의 상세한 연구를 위해 허용하기에 용이하게 적응할 수있다.

프로토콜

이 프로토콜에서 보여준 모든 동물 절차를 검토하고 프로토콜 11-0412 및 14-0514 아래에있는 웨스트 버지니아 대학 동물 관리 및 사용위원회의 승인과 관리 및 사용에 대한 NIH 가이드에 설명 된 원칙과 절차에 따라 진행되고있다 동물의.

1. 동물 준비

  1. 1.5 L / 분으로 100 %의 산소와 혼합 3 % 이소 플루오 란을 사용하여 유도 챔버에 단일 마우스를 마취. 40 ° C로 예열과 37-42 ° C의 (그림 2A) 사이에 유지 이미징 플랫폼에서 앙와위에서 유도 챔버와 장소에서 동물을 제거합니다. 발가락 핀치에 응답의 부족으로 마취를 확인합니다.
  2. 마취 시스템에 연결 원추형 두부 내에서 마우스 주둥이를 놓습니다. 정상 상태의 진정 (1.5 L / 분 100 % 산소와 혼합 1.5 % 이소 플루오 란)을 유지하기 위해 마취를 적용합니다.
  3. dryin 방지하기 위해 눈 윤활제를 각각의 눈을 적용G. 전극에 전극 젤을 적용하고 해당 전극에 네 발을 각각 확보하기 위해 테이프를 사용합니다. 전극 패드는 심장 박동과 호흡 속도 모니터링을 허용하는 이미징 시스템에 동물의 ECG를 전송할 것이다. 윤활 체온의 연속 모니터링을 위해 직장 온도 프로브를 삽입한다. 정상 마우스의 체온은 36.9 ° C이다. 1-2 ° C의 변화는 마취 동안 정상입니다.
  4. 마우스의 목에서 털을 제거하는 제모 크림을 사용합니다. 머리와 초과 제모 크림을 제거하기 위해 물에 적신 거즈로 목 영역을 씻어. 선택적으로, 나머지 체모 (그림 2B)을 제거하는 제모 크림의 추가 응용 프로그램을 사용합니다.

마우스 경부 림프절 2. 식별 및 이미지 인식 HFUS 사용

  1. , 시작 모피없는 목 영역 가온 초음파 겔의 층을 적용한다. 최적의 이미지 젤의 자유 응용 프로그램을 사용하여품질 (그림 2C). 초음파 이미징을 방해 할 수의인가 겔, 기포를 도입하는 피.
  2. 이미징 플랫폼 그래서 마우스가 약간 상승 머리 위치 20 ~ 30 °를 조정합니다. 이 위치는 마우스에 대한 최적의 호흡 속도를 보장하는 데 도움이됩니다. 장착 시스템에 횡 방향으로 40 MHz의 트랜스 듀서를 놓고 변환기 스캔 헤드의 전면이 초음파 젤 (그림 2C)에 침지 될 때까지 조심스럽게 내립니다.
    참고 : 과도한 호흡 곤란을 일으킬 수 있으므로, 마우스 목에 과도한 압력을 넣지해야합니다. 촬상 변환기와 마우스 사이 겔 완충액을하는 또, 유용하다.

림프절의 B 모드 이미징 및 감지 :

  1. 밝기 (B-) 다음과 같은 매개 변수에 대한 모드 설정을 조정, HFUS 수집 소프트웨어를 제어하는​​ 컴퓨터를 사용하여 다음, 깊이 10.00 22dB 게인MM은 14.08 mm 폭.
    참고 :이 설정은 시작 지점을 제안하고, 다른 응용 프로그램 사이에서 최적의 영상 획득을위한 약간의 조정이 필요할 수 있습니다. 주위의 고 에코 필드 내에서 피부 표면에 가까운 타원형 저 에코 구조 정상 자궁 경부 림프절을 관찰한다. 병에 걸린 림프절의 모양은 모델에 따라 다를 수 있습니다. 체계적으로 이미지가 목 지역 내의 모든 림프절 다음 단계를 사용하려면 :
    1. 흉부 지역으로 방식이 꼬리 지느러미에 뇌에 목을 스캔하고 Y 축를 사용합니다. 이미지를 중앙에 X 축를 사용합니다.
    2. 주요 랜드 마크 확인 : 구강, 혀, 그리고 갑상선 (도 3A, B와 C를 각각); 가로 마우스 경부의 복부 표면을 조정하는 목의 양측에도 B 모드 영상에 보이게, 이미징 플랫폼 기울. 경사의 양은 각 마우스의 생리에 따라 달라집니다.
  2. 목 통하여 림프절 및 관련 경계표를 매핑하기 위해, 갑상선에 구강 / 혀 영역에서 전체 목부 영역의 3 차원 검사를 실시한다.
    1. 혀 / 구강 영역 (그림 3A)를 찾습니다과 Y 규모에 숫자 위치를 확인합니다.
    2. 갑상선 (그림 3C)를 찾습니다과 Y 규모에 숫자 위치를 확인합니다.
    3. 이미지화 경부 지역 mm의 전체 길이를 결정하기 위해 (2.4.1) 및 (2.4.2)에서 얻어진 값 사이의 차이를 계산한다.
    4. 결정된 전체 길이의 중간 지점에 변환기를 중앙에 Y 노브를 사용합니다.
    5. 를 눌러 "3D". 총 길이를 입력합니다. 3D 스텝 사이즈를 들어, 목 전체 영역에 대해 이미지 시리즈 스택을 얻기 위해 0.076 mm을 사용한다.
  3. 스캐닝이 완료되면, 다음 4 인상, 목의 오른쪽 또는 왼쪽을 선택하고 관심있는 개인 림프절에 변환기 중앙마우스 오프 0 MHz의 변환기. 40 MHz의 변환기를 제거하고 높은 해상도의 이미지를 얻을 수 (또한 가로 위치)에서 50 MHz의 Microscan의 변환기로 교체합니다. 마우스 목에 초음파 젤을 보충하고, 초음파 젤로 50 MHz의 변환기를 낮 춥니 다.

3D 파워 도플러 영상

  1. 행동 3D는 엉덩이의 볼륨과 개별 경부 림프절 다음의 혈관에 출력 도플러로 검색 :
    1. 다음의 전원 모드 설정을 전원 Dopper을 획득하고 조정하는 시스템 키보드에있는 전원 버튼을 누릅니다 : PRF 4 kHz에서, 도플러는 34dB 이득, 2D 이득 30dB, 깊이 5.00 mm, 폭 4.73 mm로. 참고 : 이전과 마찬가지로, 이러한 설정은 제안의 시작 지점이며, 다양한 모델에 최적의 영상 획득을 위해 필요에 따라 수정 될 수있다.
    2. 관심있는 림프절의 두개골 가장 포인트를 찾아 Y 스케일의 위치를​​ 확인합니다.
    3. 같은 노드와 노트의 가장 꼬리 지점을 찾습니다Y 스케일의 위치.
    4. 림프절의 전체 길이를 결정하는 거리 차이를 계산한다 (단계 2.4.3 참조).
    5. Y 스케일의 위치를​​ 사용하여, 결정된 전체 길이의 중간 점에 변환기를 중심입니다.
    6. 를 눌러 "3D"총 림프절 길이를 입력합니다. 스텝 크기 0.051 mm를 사용합니다.
      참고 : 가슴 부위에 트랜스 듀서의 근접성으로 인해, 50 MHz의 변환기로 인해 정상적인 호흡 운동 검출에 불안정한 도플러 이미지의 원인이 될 수 있습니다. 이것은 "생리 학적"탭에서 제공 "호흡 게이팅"옵션을 사용하여 제거 될 수있다.
    7. 파워 도플러 분석 및 이미지를 획득하는 "3D 스캔"을 선택 할 수있는 영역을 지정하는 노란색 상자에 선택한 림프절을 둘러싸고 있습니다. 마우스 오프 변환기를 올리고 목의 반대편으로 이동. 마우스 위에 트랜스 듀서를 내리고 IMA에 위에서 설명한 단계를 반복목의 측면에 GE의 림프절.
  2. 이후의 분석을위한 이미지 세트를 저장합니다.

3. 자궁 경부 림프절 생검

  1. 조직 검사에 대해 원하는 림프 노드를 선택하고 50 MHz의 트랜스 듀서와 HFUS 영상을 유지한다. 마우스 목의 각 측면에서 가장 큰 볼 경부 림프절을 선택했다. 림프절 확대는 전형적으로 염증 반응을 나타내며, 따라서 이러한 노드들은 생검을위한 이상적인 후보이다.
    참고 : 우리는 자궁 경부 노드보다 작은 10mm 3에 조직 검사를 실시하는 것은 매우 어렵다 발견했다.
  2. 주사기 홀더에 부착 된 27 G, 0.5 인치 바늘로 1 ML의 주사기를 배치하여 조직 검사 용 바늘과 주사기를 준비합니다. 바늘을 마우스 목 (그림 4A)에 90 ° 방향을 바늘 홀더를 조정합니다.
  3. 바늘의 수준 마우스 전체 플랫폼을 승강하여 준비한다. 3D 모터를 제거하고 키 platf로 전환하여이를 달성ORM, 또는 제공 짧은 플랫폼에서 적당한 높이의 단단한 물체를 배치하여. 이 목적을 위해 플라스틱 미세 원심 분리 튜브 랙을 사용한다. 필요한 경우, 바늘 장치 반대 목의 측면에 위치한 노드 생검하기 위하여 플랫폼 180도 회전한다.
  4. 다음 "최대 및 확장 버퍼"를 선택하여, "환경 설정"을 선택하여 획득 설정을 조정합니다. 8.00 mm와 9.73 mm의 폭의 깊이로 시야를 확대. 화면 키 전화 사용 봉침을 켭니다. 봉침 화면에 바늘의 경로를 예측하고 생검에 대한 올바른 위치에 관심 림프절을 일렬로 사용자를 허용 할 것이다.
  5. 림프절은 중간 또는 약간 화면 (그림 4B)에서 센터의 왼쪽에있는 림프절을 중심으로보기에 지속적으로 남아 있는지 확인합니다. 절차의 전체 시네 루프를 얻으려면, 생체 검사를 시작하기 전에 시스템 키보드에 미리 트리거를 눌러.
  6. 바늘 끝이보기와 접촉 피부 (그림 4B)에 올 때까지 바늘 홀더를 조정합니다. 빠른 피부에 구멍을 밀어, 회사와 바늘을 전진. 팁 또한 캡슐 (그림 4C)을 천공하고, 수질 (그림 4D) 내 보일 때까지 바늘을 사전에 계속.
  7. 바늘이 제대로 노드 내에 위치되면, 부드럽게 생검 (그림 4D와 4E)를 수행하기 위해 다시 200 ~ 300 μL 무사 (武士)의 주사기 플런저를 잡아 당깁니다. 그 생검 재료는 일반적으로 주사기 내에서 표시되지 않습니다.
  8. 부드럽게 마우스 목에서 바늘을 제거합니다. 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에 주사기 내용물 추방. 튜브에 바늘을 떠나, 주사기에서 바늘을 제거합니다. 동일한 주사기 (콘텐츠 소스로부터 분리 된 분취으로부터) 미디어 생검 1 ㎖를 수집 번째의 바늘을 유지시키면서 주사기 바늘을 다시 부착전자 튜브.
    1. 튜브에 조직 검사 미디어를 추방하여 조직 검사 미디어 주사기와 바늘을 씻어.
      참고 : 바늘 생검 후 어느 시점에 연결되어있는 동안 플런저를 다시 잡아 당기지 마십시오. 이는 작은 샘플 크기 생검 재료를 손실 할 위험을 감소시킨다.
  9. 조직 학적 방법 (그림 4 층)에 의해 림프절의 내용을 확인하고 적절한 추가 방법 (조직 화학 등 유동 세포 계측법)에 의해 분석한다.
  10. 조직 검사가 완료되면 마취를 끄고 직장 온도 프로브를 제거합니다. 거즈와 마우스에서 초과 초음파 젤을 제거하고 각각의 발에서 테이프를 제거합니다.
  11. 이미징 플랫폼에서 마우스를 제거하고 케이지로 돌아갑니다. 생검 사이트에서 최소한의 출혈이 발생할 수 있지만, 이것은 개입없이 중지합니다. 전체 활동이 재개 될 때까지 복구하는 동안 마우스를 모니터합니다.

4. 이미지 경부 림프절의 분석

    초음파 소프트웨어에서 분석을 위해 이미지를 선택하고 "이미지 처리 '탭으로 이동합니다. "3D로 Load"를 선택합니다.
  1. "단일 창을 표시"버튼을 클릭, 왼쪽 상단 모서리에 "3D 복원 영상"을 선택합니다. 원하는 경우 이미지를 확대하는 줌 기능을 사용합니다. "디스플레이 레이아웃"토글 전용 뷰에서 전원 도플러 오버레이를 제거 B- 모드에서 이미지를 볼 수 있습니다. 이렇게하면, 후속하는 3-D 분석에서 림프절의 가장자리를 볼 수있다. 림프절의 시작을 찾습니다 이미지 시리즈를 통해 이동합니다.
  2. 림프절을 외접하려면 "3D 설정"탭으로 이동합니다. 다음, '시작'버튼 옆에 "병렬", "볼륨"을 선택합니다.
  3. 스크롤하여 개별 이미지 내에서 관심 영역 주변의 윤곽을 그립니다. 전체 림프절을 포함 이미지가 표시 될 때까지 계속합니다. "완료"를 선택분석을 완료합니다.
  4. 이미지의 하단에, 3D 볼륨과 혈관 %가 자동으로 표시됩니다.
    주 : 3D 용적 림프절 부피에 대응하고, 퍼센트 혈관 전력 도플러 혈류 양성 림프절의 비율을 나타낸다.
  5. "디스플레이 레이아웃"토글 B- 모드 영상에 오버레이로 출력 도플러 영상을 볼 수 있습니다. 표면보기에 관심있는 볼륨 영역의 순보기를 관찰합니다. 추가 사용에 대한 영화 (.AVI)로 태그 이미지 파일 (TIF) 형식 또는 3D 스캔의 이미지를 내 보냅니다.

결과

이미징 및 생검 절차 전체적인 개략도는도 1에 도시된다. 절차의 주요 단계는 이미징을위한 마우스의 적절한 제제, 경부 림프절 증, 정확한 준비 및 생검의 도통, 및 B의 분석을 포함 - 모드 및 도플러 이미지 볼륨 및 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 각 선택된 노드 내의 혈류의 양을 측정 하였다.

마우스 경부 림프절 HFUS 이미징 적용하고 영상주기 (도 2a)에 걸쳐 적절한 마취뿐만 아니라 전체 목부 영역 (도 2b)를 덮는 머리의 완전한 제거를 유지하는 요구한다. 면도 한 부위에 초음파 젤의 자유 응용 프로그램은 절차 (그림 2C) 동안 명확한 HFUS 신호를 보장합니다.

목 부위의 HFUS 영상은 특성 초음파 이미지를 생성 자궁 해부학의 시각화에 의해 도움을 받는다. 그림3은 B 모드 (도 3d) 및 파워 도플러 모드 (도 3e)의 주요 기관의 예 (도 3A-C), 경부 림프절을 나타낸다.

마취 된 쥐에서 실시간 HFUS 영상은 임상에서 수행되는 것과 유사한 자궁 노드의 유도 세침 생검 수 있습니다. 제어용 마이크로 인젝터 장치에 생검 바늘 및 장착 수거 주사기의 배치는도 4a에 도시된다. 이후 B- 모드 초음파 이미지는 조직 검사 (그림 4D) 동안 이상적인 이전에 조직 검사 (그림 4B)에 바늘 배치, 경부 림프절 (그림 4C)에 바늘 끝 항목, 바늘의 위치를 보여줍니다. 확대 이미지는 림프절 (그림 4E)의 수질 내에서 바늘 끝을 보여줍니다. cytospin 의해 생검 부품의 처리가 성공적으로 림프절을 검증 풍부한 림프 세포 클러스터와 연관된 결합 조직을 보여준다조직 검사 (그림 4 층).

상세한 정보는 림프절 아키텍처, 볼륨 및 혈관 흐름 관한 얻을 수 있도록 이미지 HFUS 전산 기반 분석을 허용한다. 파워 도플러 모드 및 3D 체적 측정 퍼센트 혈류 (PV)을 사용하는 것은 전체 노드들에게 (도 5a)을 포위 이미지 시리즈에서 계산 될 수있다. 또한, 3 차원 화상 전체 림프절 지형 (도 5B)을 드러내는 가상 림프절 재구성을 허용한다.

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그림 1. 마우스에서 진단 HFUS 경부 림프절 촬상하는 단계의 개요 개략적가 주요 단계를 포함한다 : 1 HFUS 이미징 마우스를 준비하고 세 마우스 경부 림프절을 함유하는 목 부위의 40 및 50 MHz의 해상도의 화상을 얻는 . 2 : 경부 림프절 및 후속 조직 학적 분석의 미세 바늘 영상 유도 생검 재료를 생검. 3 : 컴퓨터 지원 이미지 분석 및 혈관 흐름의 각각 림프절 부피 백분율 (%)을 결정하기 위해 B 모드 및 도플러에서 얻은 림프절 이미지의 3D 재구성.

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그림 2. 경부 림프절 생검을위한 평가 및 생체 마이크로 이미징 시스템은 고해상도의 개요 (A) HFUS 시스템 경부 림프절 촬상 위해 준비 마취 된 마우스를 나타낸다. 또한 표시는 마이크로 인젝터 (MI) 및 3D-모터 스테이지 (3D MS) 부속 장비이다. (나) 목의 영역에서 제거 머리 HFUS 영상을 준비 마취 마우스의보기를 닫습니다. (다) 목에 장소에 50 메가 헤르츠 변환기와 같은 마우스. 목 영역 이미징을 용이하게하기 위해 사용되는 여분의 초음파 겔 참고.

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그림 3 : B- 모드 및 파워 도플러의 대표 HFUS 자궁 해부학 이미지. (A, B) 비강에 가장 가까운 시각에 의해 촬상 구강 (BC) 및 설부 (T)를 도시 구강 B 모드 이미지. 목 양쪽에 발견 세 경부 림프절은 (M, 하악 표지; SM, 턱밑; SP 표재성 귀밑샘)가 (B)에 도시 된 바와 같이, 단일의 결상면에 저 에코 구조의 그룹으로 나타난다. (C) 고체, 에코 나비 모양의 구조로 표시, 상부 흉부 지역의 시각으로 갑상선 (목). (AC)는 40 MHz의 변환기로 시각화 하였다 스케일 바 = 1mm. (D, E) 정상 (D)의 대표 이미지와 B- 모드 및 파워 도플러 (빨간색)으로 확대 (E) 경부 림프절. 점선은 개별 림프절 개요. 스케일 바 = 0.5 mm이다.

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도 4 : 경부 림프절 생검 셋업, 이미징 및 생검 재료 cytospin 분석 (A) 마우스 목 근처 미세 주사기와 바늘 배치를 나타내는 이미징 플랫폼.. 다양한 마이크로 원심 튜브 랙 (오렌지 블록)은 여전히​​ 약간의 3D 모터 스테이지에 대한 공간을 허용하면서 적절한 바늘 배치를 가능 플랫폼을 높이기 위해 사용된다. 이러한 형태는 각각의 마우스에 대한 모터 스테이지 제거 소요되는 시간을 최소화한다. (B - D) 전체 목 HFUS 이미지는 50 MHz의 변환기를 사용하여 자궁 경부 림프절 생검의 비디오에서 가져온. (B)에 앞서 생검 목의 측면에 위치하는 바늘을 도시 HFUS B 모드 영상을. 바늘 끝은 바늘 궤도를 나타 내기 위해 영상 중에 중첩 봉침의 위치 (녹색 점선) 아래의 고 에코 구조입니다. 림프 노드의 중심에이미지. 스케일 바 = 1mm. 림프절로 (C) 바늘 항목. 경부 림프절의 (D) 생검. (E) 경부 림프절의 확대 된 조직 검사. 스케일 바 = 0.5 mm이다. 성공적인 조직 검사를 확인 대표 생검 림프 물질 (F) Cytospin 분석. 스케일 바 = 100 μm의.

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도 5 :. 3D 경부 림프절 영상의 컴퓨터 분석 림프절의 (A)는 샷 대표 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다. 노드는 파란색으로 외접된다 분석 결과는 3D 볼륨 및 표시된대로 %의 혈관 (PV)를 보여줍니다. (B)의 3 차원 분석 후 동일한 노드의 표면보기 이미지입니다. 취해진 측정에 기초하여 림프절의 전체 볼륨을 렌더링한다.

토론

설명 프로토콜 시각화 및 비 침습성 HFUS 이미징을 사용 뮤린 경부 림프절 시츄 평가 허용한다. B 모드 및 파워 도플러 이미지의 사용은 경부 림프절 형태는, 볼륨 및 림프절 혈류 임상 경부 환자 노드의 특성화에 사용되는 것과 유사한 전임상 마우스 모델 시스템의 실험적인 분석을 제공한다 시각화. 미세 생검을 통해 cervial 림프절을 모니터링 할 수있는 능력은 또한 면역 세포 변경 및 마우스에서 구강 질환 유발 lymphadenopathies 중에 외래 세포 유형 또는 박테리아의 존재를 검출하기위한 유용한 기술을 제공한다. 사용 HFUS과 관련된 저가의 용이성 동물 모델의 다양한 경부 림프절 상태의 신속한 선별을 허용한다.

이 프로토콜의 중요한 단계 HFUS 이미지의 경부 림프절의 초기 성공적으로 식별합니다. 우리의 시설은 HFUS 트란의 구색을 가지고우리는 가장 높은 품질의 이미지를 얻기 위해 이들을 사용한 않도록 sducers를 설명. 우리가 설명 트랜스 듀서를 사용할 수없는 경우에는, 다른 센서를 이용하여 촬상을 적용하는 것이 가능하다. 이를 위해, 충분한 화상을 얻을 이미지 깊이와 폭을 조정하는 필요한 모든 것이다. 이러한 이미지의 해상도가 변경 될 수 있지만, 여전히 HFUS을 사용하여 고품질의 화상을 얻을 수 있어야한다. 구강 및 갑상선의 이미징 랜드 마크는 크게 림프절이 지역화 된 적절한 지역에 사용자를 배향에 도움이됩니다. 피부 표면에 가까운 특성 타원형, 저 에코 특성과 표면의 위치는 적절한 목 영역 내 경부 림프절 확증 신속한 식별을 허용한다. 세 개의 노드가 하나의 영상 평면 (그림 3B)에서 볼 수 있지만, 일반적으로 하나 또는 두 개의 노드는 영상 중 캡처됩니다. 변환기 위치의 약간의 조정이 찢어하도록 수행 될 수있다ER 다른 이미징 목의 편면에 모든 노드의 시각화를 허용 보이는 비행기.

우리가 경부 림프절을 식별하기위한 신뢰성있는 기술을 설명하는 결과가되었지만, 이미징 및 생검 기술에 특정한 제한이있다. 심지어 약간의 압력 변환기 헤드를 통하여 피부에 적용될 때 마우스 경부 림프절의 표면 성질은 과도한 이동성을 부여한다. 이는, 랜드 마크의 이미지가 식별 될 때까지 천천히 마우스 목 초음파 겔화 변환기 헤드를 적용함으로써 상쇄 될 수있다. 림프 노드의 이동성은 높은 해상도 (50 메가 헤르츠) 범위에서 트랜스 듀서를 사용하여 특히, 미세 바늘 생검을 복잡하게 할 수 있습니다. 생검 림프절 중심 이미지는 전형적으로 피부와 상부 캡슐을 천공하는 데 필요한 생검 바늘의 힘 시야 밖으로 밀려. 이는, 니들 진입 방향을 향하여 림프절의 중심에서 벗어난 위치에 의해 해결 될 수있다림프절을위한 공간을 제공하기는하지만 여전히 걸쳐 가압 생검시 시야 내에서 유지된다. 우리의 경험, 림프절>에서 10mm 3 생검 매우 어려운, 자주 바늘 발전하는 동안 바늘에 의해 추진보다는 침투된다. 따라서, 생검 최선 10mm 3 경추 영역 내에 충분한 노드 타겟 크기 및 안정성을 확보> 크기가 림프절을 위해 예약된다. 또한, 조직 검사 재료는 큰 세포 수 (예, 유동 세포 계측법) 필요한 절차에 대한 충분한 세포 수를 포함 할 수 없습니다.

HFUS 성공적 동소 HNSCC 25 종양이 시각화 사용되고, 구강 종양의 24 마우스에서 자궁 노드 전이를 모니터 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 초음파 외에도, 생물 발광 영상은 살아있는 쥐에서 동소 26,27 구강 종양 형성 및 경부 림프절 전이를 시각화하는데 사용되었다. altern로극상 접근법은, 생물 발광 이미징 직접 동일한 동물에서 시간이 지남에 따라 종양 진행 및 전이 부담을 정량화 할 수있는에 HFUS 위에 뚜렷한 장점을 갖는다. 명백하게 유용하지만, 생물 발광 이미징 림프절 형태, 절점 볼륨이나 혈류를 포함하여 가시화 HFUS 파라미터의 많은 측정 할 수 없다. 생물 발광 영상은 세침 조직 검사에 대한 적응을위한 적합이 기술을 렌더링 이미지 동안 마우스를 유지하기 위해 전문 어두운 상자를 필요로한다.

또한, 생물 발광 이미징 안정적 또는 루시퍼 라제 발현을 제한 유도 조직 특이 적 유전자 시스템 면역 마우스에서 루시퍼 라제 형질 종양 세포 소성을 이종 가지 경우에 의해서만 사용이 기술을 허용 루시퍼 라제 효소를 발현 종양 세포의 생산을 필요 종양 조직 기원의 특정 시공간 방법. 대조적으로, U는 HFUS 될 수뿐만 아니라 완전한 면역 시스템 (28, 29)와 마우스에서 발암 물질에 의한 구강 종양 모델에서 경부 림프절을 영상화 할 수있는 것으로,이 모델의 생물 발광 이미지와 함께 나오지. HFUS 종양 세포는 루시퍼 라제의 단독 영상 기법 중 하나 이상 경부 림프절의 더욱 완전한 그림을 제공 할 수있는 표현 구강암, 생물 발광과 시스템 HFUS 영상으로부터 얻을 수있다 조합 정보의 대부분 마우스 모델에 더욱 적응 될 수도있다.

이 기술은 동물 단기 마취 역상의 위치로 유지 될 수 염증성 림프절 초래할 구강 질환의 대부분의 모델에서 사용될 수 있도록 실시간으로 마우스 경부 림프절을 식별하고 검색 할 수있는 능력은 허용한다. 림프절 전이 또는 세균 감염과 살아있는 동물의 림프절 형태에 수반되는 충격의 검출은 전통적인 방법에 비해 상당한 이점을 제공한다림프절 조직 학적 처리 죽은 동물로부터 제거 할 필요있다. 미세 생검과 결합 HFUS는 구강 질환의 최신 마우스 모델에서 질병의 진행을 모니터링하기위한 개선 된 방법을 제공하는 병원에서 실시되는 것과 유사한 경​​부 림프절의 루틴 병리학 분석을 수행하기위한 수단을 허용한다.

공개

이 기사에 대한 출판 비용은 비주얼 소닉스가 후원한다.

감사의 말

이 작품은 웨스트 버지니아 대학의 메리 Babb 랜돌프 암 센터에서 도로시 디 래드 포드 성기 사이즈 기금에 의해 지원되었다. 웨스트 버지니아 대학의 동물 모델 및 영상 시설 (AMIF) 및 현미경 이미징 시설 (MIF)의 사용 (메리 Babb 랜돌프 암 센터와 NIH 보조금 P20의 RR16440에 의해 지원, P30의 RR032138 / GM103488 및 S10 RR026378은) 감사 인정 받고 있습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0VisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaVS-11945
Power Dopper Mode and 3D ModeVisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaVS-11952; VS-11484
Vevo compact anesthesia systemVisualSonics, Toronto, Ontario, Canada
Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injectionsVisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaSA-11983
Thermasonic Gel WarmerVisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaOptional
Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz - 55 MHz)VisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaVS-11960Referred to as 40 MHz Transducer
Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz - 70 MHz)VisualSonics, Toronto, Ontario, CanadaVS-12026Referred to as 50 MHz Transducer
Ophthalmic OintmentPatterson Veterinary07-888-1663
Electrode gelParker Laboratories174-1525
TapeMedical Arts Press174-153000
Depilatory CreamCarter Products
Cotton swabsGeneral Supply
GauzeFisher Scientific22-037-907
WaterGeneral Supply
Lubricating gelParker Laboratories57-05
Ultrasound gelParker Laboratories01-50
Microcentrifuge tube rackGeneral SupplyUsed to raise mouse platform for optimal biopsy position
27 G ½ inch needle with 1 ml syringeFisher Scientific14-826-87
ThinPrep PreservCyt SolutionHologic70097-002Refered to as biopsy media
Microcentrifuge tubesGeneral Supply
Thinprep 2000 processorCytyc, Marlborough, MABlue Filter
Olympus AX70 Provis MicroscopeOlympus, Center Valley, PA

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