Microtissue 안정화를위한 미세 유체 장치에서 레이어별로 층 콜라겐 증착

요약

The creation of functional microtissues within microfluidic devices requires the stabilization of cell phenotypes by adapting traditional cell culture techniques to the limited spatial dimensions in microdevices. Modification of collagen allows the layer-by-layer deposition of ultrathin collagen assemblies that can stabilize primary cells, such as hepatocytes, as microfluidic tissue models.

초록

Although microfluidics provides exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells within microfluidic devices can be challenging. 3D culture of cells in collagen type I gels helps to stabilize cell morphology and function, which is necessary for creating microfluidic tissue models in microdevices. Translating traditional 3D culture techniques for tissue culture plates to microfluidic devices is often difficult because of the limited channel dimensions. In this method, we describe a technique for modifying native type I collagen to generate polycationic and polyanionic collagen solutions that can be used with layer-by-layer deposition to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These thin collagen layers stabilize cell morphology and function, as shown using primary hepatocytes as an example cell, allowing for the long term culture of microtissues in microfluidic devices.

서문

Although microfluidics allows for the exquisite control of the cellular microenvironment, culturing cells, especially primary cells, within microfluidic devices can be challenging. Many traditional cell culture techniques have been developed to sustain and stabilize cell function when cultured in tissue culture plates, but translating those techniques to microfluidic devices is often difficult.

One such technique is the culture of cells on or sandwiched between collagen gels as a model of the physiological 3D cell environment.¹ Type I collagen is one of the most frequently used proteins for biomaterials applications because of its ubiquity in extracellular matrix, natural abundance, robust cell attachment sites, and biocompatibility.² Many cells benefit from 3D culture with collagen, including cancer cells^3,45, microvascular endothelial cells⁶, and hepatocytes⁷, among others. While the use of collagen gels is easy in open formats, such as tissue culture plates, the limited channel dimensions and enclosed nature of microfluidic devices makes the use of liquids that gel impractical without blocking the entire channel.

To overcome this problem, we combined the layer-by-layer deposition technique⁸ with chemical modifications of native collagen solutions to create ultrathin collagen assemblies on top of cells cultured in microfluidic devices. These layers can stabilize cell morphology and function similar to collagen gels and can be deposited on cells in microfluidic devices without blocking the channels with polymerized matrix. The goal of this method is to modify native collagen to create polycationic and polyanionic collagen solutions and to stabilize cells in microfluidic culture by depositing thin collagen matrix assemblies onto the cells. This technique has been used to stabilize the morphology and function of primary hepatocytes in microfluidic devices.⁹

Although layer-by-layer deposition has previously been reported with natural and synthetic polyelectrolytes¹⁰ to cover hepatocytes in plate culture^11,12 and as a seeding layer for hepatocytes in microfluidic devices^13,14, this method describes the deposition of a pure collagen layer on top of hepatocytes, mimicking the 3D collagen culture techniques. In this protocol, we use hepatocytes as example cells that can be maintained using 3D collagen layers. The many other types of cells that benefit from 3D culture in collagen may similarly benefit from culture after layer-by-layer deposition of an ultrathin collagen matrix assembly.

프로토콜

원주민 수용성 콜라겐 솔루션 1. 준비

1. 준비 또는 내가 1-3 밀리그램 / 등 Piez 등에 의해보고 된 표준 격리 프로토콜을 사용하여 ML. ^(15)에 쥐의 꼬리에서 콜라겐 산성화, 가용성, 유형의 200 mg의 구입
2. 변성 콜라겐 용액의 목적하는 최종 부피를 기준으로 출발 물질의 양을 규모. 약 수용성 천연 콜라겐의 200 mg의에서, 3 ㎎ / ㎖에서 25 ~ 30 메틸화 ㎖의 석신 콜라겐 솔루션 25 ~ 30 ml의 각합니다.

2. 콜라겐 메틸화

1. 빙냉 멸균 물을 0.5 mL의 밀리그램 /의 농도 네이티브, 산성화 (PH 2-3) 콜라겐 용액을 100 mg의 희석 및 겔화를 방지하기 위해 상기 용액에 얼음을 보관.
2. 1 N NaOH를 몇 방울 9-10 콜라겐 용액의 pH를 조정하고, 30 분 동안 실온에서 교반한다. 흐린 될 해결책의 원인이 콜라겐 석출물을 관찰한다.
3. 25 분 동안 3,000 × g에서 침전 된 콜라겐 솔루션을 스핀 다운. 분명, 젤 같은 침전물은 튜브의 바닥에서 볼 수 있어야합니다. 대기음이 제대로 뜨는 유체 폐기하십시오.
4. 0.1 N HCl을 메탄올 200ml에 침전 된 콜라겐을 재현 탁하고, 메틸화 반응은 4 일 동안 실온에서 교반하면서 발생할 수 있도록. 콜라겐은 용해되지 않지만 솔루션은 흐린 것 아주 작은 볼 수 조각으로 깨지한다.
5. 메틸화 후, 원심 분리기 25 분간 3,000 × g에서 용액은 콜라겐 메틸화 펠렛. 대기음이와 산성화 메탄올 뜨는 폐기하십시오.
6. 반복적 피펫으로 약 3 ㎎ / ㎖의 농도를 제공 멸균 PBS 25 ㎖에 메틸화 콜라겐을 녹이고 60 μm의 셀 스트레이너를 통해 용액을 필터. 1 N의 NaOH를 20 μL 씩 7.3-7.4를 사용하여 용액의 pH를 조정한다.
7. the concentratio 평가상업적 래트 콜라겐 ELISA 키트 또는 하이드 록시 프롤린 분석 키트를 사용하여 용액의 N. 3 밀리그램 / 멸균 PBS와 용액에 대한 해결책을 희석.
8. 신중 병 바닥에 클로로포름 3 ㎖를 적층, 스크류 캡 유리 병에 전송하여 메틸화 된 콜라겐 용액을 소독 병은 4 ℃에서 O / N을 설정 한 다음, 무균 적으로 분리하고 저장하도록 허용 메틸화 콜라겐 상부층.
9. 한 달 이내 사용을위한 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다.

3. 콜라겐 Succinylation

1. 빙냉 멸균 물을 0.5 mL의 밀리그램 /의 농도 네이티브, 산성화 (PH 2-3) 콜라겐 용액의 다른 100 mg의 희석 및 겔화를 방지하기 위해 상기 용액에 얼음을 보관.
2. 1 N NaOH를 몇 방울 9-10 콜라겐 용액의 pH를 조정하고, 30 분 동안 실온에서 교반한다. 콜라겐은 흐린되기 위해 용액을 일으키는 석출한다.
3. SUC 40 mg의 해산(콜라겐 용액 부피의 1/20 ^번째)을 아세톤 10ml에 cinic 무수물 (콜라겐 밀리그램 당 0.4 mg)을 얻었다. 천천히 (약 0.5 ml의 단위) 지속적으로 pH를 모니터링하면서 교반 콜라겐 솔루션이 혼합물을 추가합니다. pH가 9.0에 근접함에 1 N NaOH를 1 ~ 2 방울을 첨가하여 pH를 9.0 위를 유지한다.
4. 아세톤 숙신산 무수물 모두를 추가 한 후 120 분 동안 실온에서 계속 교반 하였다. 석신 콜라겐이 용해으로 명확하게하는 솔루션을 관찰한다. 정기적으로는 9.0 이상으로 유지하기 위해 pH를 확인합니다.
5. 1 N HCl을 20 μL 씩 증분하여 상기 용액의 pH를 4.0으로 조정한다. 석신 콜라겐 침전으로, 다시 흐린 솔루션을 관찰한다.
6. succinylation 후, 원심 분리기 25 분 3,000 × g에서 솔루션은 석신 콜라겐 펠렛합니다. 기음은 미 반응 숙신산 무수물로 산성화 뜨는 폐기하십시오.
7. 숙시 콜라겐을 녹여멸균 PBS 25 ㎖, 60 μm의 셀 스트레이너를 통해 용액을 피펫 팅을 반복하여, ㎖ / 약 3의 Mg 농도를 제공하고, 필터. 1 N의 NaOH를 20 μL 씩 7.3-7.4를 사용하여 용액의 pH를 조정한다.
8. 상업적 래트 콜라겐 ELISA 키트 또는 하이드 록시 프롤린 분석 키트를 사용하여 용액의 농도를 평가한다. 3 밀리그램 / 멸균 PBS와 용액에 대한 해결책을 희석.
9. 신중 병 바닥에 클로로포름 3 ㎖를 적층, 스크류 캡 유리 병에 전사함으로써 석신 콜라겐 용액을 소독 병을 4 ℃에서 O / N을 설정 한 다음, 무균 적으로 제거하고 저장하도록 허용 the 석신 콜라겐입니다 상단 층.
10. 한 달 이내 사용을위한 4 ° C에서 솔루션을 저장합니다.

콜라겐 수정 4. 검증

1. 1, 기본 메틸화 및 석신 콜라겐 솔루션의 각 1 ㎖의 샘플을 준비하고 진한 희석수소 이온 적정 멸균 순수 ml의 0.1 밀리그램 /의 entration. 또한 적어도 4 시간마다 10 kDa의 컷오프 membraneusing 3 솔루션의 변화를 통해 물에 대한 투석에 의해 버퍼 적어도 1000 배 희석.
2. 수산화 나트륨과 염산 소량의 7.3 용액의 pH를 조절합니다. 네이티브 메틸화 및 숙시 콜라겐 솔루션 적정 곡선을 만들 Tanford ^(16)에 의해 설명 된 바와 같이 임의의 기준으로 pH가 7.3을 사용하여, 각각의 샘플에 수소 이온 적정을 수행한다.
3. 산의 볼륨이 결합 된 H ⁺ 분자 당 이온의 수 대 추가 당 pH의 변화를 그린다. 높은 산도 "아미노"범위 중성점 향해 석신 콜라겐 시프트 (아민 기의 손실)를 표시해야하고, 낮은 pH "카르복시"범위는 메틸화 콜라겐 좌측 시프트 (카르복실기의 손실을 표시해야 ) 및 석신 콜라겐 우측 시프트 (카르복실기의 이득S), 천연 콜라겐에 비해.
4. 표준 프로토콜 ^17,18 다음, 2,4,6- 트리니트로 산 (TNBA)를 사용하여 비색법에 의해 대체 succinylation 네이티브 콜라겐 아미노기의 %를 결정함으로써 succinylation 반응의 효능을 평가한다.

미세 유체 장치 및 셀 시드 5. 제작

1. 표준 방법 ^(9)를 사용하여 미세 유체 장치를 제조. 100 ㎛, 높이 0.4 ~ 1.5 mm 폭, 세포 성장을위한 긴 채널 1~10mm로 미세 세포 배양 챔버를 만들 포토 리소그래피를 사용하여 정의 실리콘에 SU-8 마스터에서 PDMS의 복제 성형을 사용합니다.
2. 장치와 슬라이드 유리의 표면을 산화시키기 위해 플라즈마 세정기를 사용하고 본드 함께 누른다. 적어도 30 분 동안 UV 광에 노출하여 장치를 멸균 한 후, 멸균 PBS 중 50 μg의 / ml의 피브로넥틴을 가진 챔버를 채우고 45 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
3. 표현형 또는 분화 상태의 안정화를위한 콜라겐 젤을 필요로 같은 차 쥐 또는 인간의 간세포와 같은 세포와 장치를 시드. 우리는 장치 당 14 × 10 ⁶ 세포 / ml에 접종 갓 격리 기본 쥐의 간세포 ^7,19 또는 시판 냉동 보관 차 인간 간세포의 20 μl를 사용합니다.
4. 세포가 4-6 시간 동안 부착하고 부착되지 않은 세포를 씻어 내고 성장 매체와 도금 매체를 대체 할 수 있습니다. 확산 전체 셀을 보장하고 세포의 합류 단층을 만들 O / N을 품어.

6. 레이어로 레이어 콜라겐 증착

1. 층류 조직 배양 후드에서, 각각의 디바이스 당 용액 10 애플리케이션 메틸화 및 석신 콜라겐 용액의 충분한 양뿐만 아니라 미디어의 몇 MLS 준비. 얼음에 솔루션을 유지합니다. 우리는 장치 레이어 당 콜라겐의 20 μL (10 ~ 15 배의 전체 장치 볼륨)를 사용합니다.
2. 있다메틸화 (폴리 양이온) 솔루션 ginning 후 20 메틸화의 μL와 함께 장치를 세척 대체 각 응용 프로그램 사이에 1 분을 기다리고, 콜라겐 솔루션을 숙시. 장치를 약 20 분 소요됩니다 솔루션 당 10 회, 총 플래시합니다. 세포가없는 미디어 아르 시간의 양을 최소화하기 위해 신속하게 작동한다.
3. 천천히 그 크기에 따라 입구 / 출구에 축적 콜라겐을 준수하십시오. 유체 흐름에 대한 저항성 증가가 미디어 한두번 장치를 세척 한 경우 축성을 계속한다.
4. 모든 층을 적용한 후, 새로운 미디어로 두 번 장치를 씻어 인큐베이터로 돌아갑니다. 세포 유형에 따라, 그러한 간세포의 향상된 편광 같은 세포 외 기질 - 유도 된 형태 적 변화는, 몇 시간 내에 볼 수 있어야한다.
5. 콜라겐 매트릭스의 존재를 확인하기 위해 표준 ^방법을 사용하여 ⁽⁹⁾ 투과형 전자 현미경 장치를 준비 대표배양 된 세포의 상단에 조립.

세포 표현형 및 기능 7. 안정화

1. 화상 세포 유형에 대한 표준 방법을 사용하여 세포 형태, 생존 및 극성. 간세포를 들어, 콜라겐 침착의 효과를 입증하기위한 정점 편광 위상 현미경에 대한 생존 LIVE / DEAD 염색 및 CMFDA 염료를 사용 14일 위에 이미지를 수집한다.
2. 세포 형태에 대해, 린스 PBS 20 μL의, 화상, 위상차 현미경을 사용하여 장치를 주입하기 위해 PBS 20 μL 피펫으로하여 입구를 통해 장치를 세척.
3. 라이브 / 죽은 얼룩 들어, 린스 제조업체의 지침에 따라 제조 DAPI와 라이브 / 죽은 염색 용액 20 μl를 주입하는 PBS의 20 μL에 피펫으로 입구를 통해 장치를 세척, 37 ℃에서 30 분 동안 품어, 린스 다시 디바이스 (20)의 PBS μL, 화상 형광 현미경을 사용하여 장치.
4. 담즙 날리 들어culi 염색은 제조자의 지시에 따라, 37 ° C에서 30 분 동안 배양하여 제조 DAPI와 2 μM C​​MFDA 염색 용액 20 μL를, 린스 주입하는 PBS 20 μL로 피펫으로 유입구를 통해 장치를 세척하여 장치를 다시 린스 20 μL의 PBS 및 이미지 형광 현미경을 사용하여 장치.
5. 소비 된 매체를 수집하고 세포의 기능을 결정하기 위해 배양 기간 동안 적절한 시점에서 세포 대사의 제품을 측정한다. 간세포를 들어, 소비 된 배지에서 알부민 및 우레아의 양을 측정한다.
6. 이러한 평가 효소 활동 수준, 항체 염색, 또는 RNA 분석과 같은 세포 자체에 엔드 포인트 기능 분석을 수행합니다. 간세포를 들어, 유도 및 시토크롬 P450 효소 활동이나 위상 공액 II 효소 글루타티온 S 트랜스퍼를 측정한다.

결과

네이티브 콜라겐 층별 증착에 사용하기위한 폴리 양이온과 폴리 음이온 콜라겐 용액을 만들 메틸화 및 succinylation를 사용하여 수정 될 수있다. Succinylation가 숙시 닐기로 네이티브 콜라겐의 ε 아미노 그룹을 수정하고 메틸화는 메틸기 (도 1a)와 네이티브 콜라겐 카르복실기를 수정한다. 콜라겐 단백질 아미노산 측쇄에 이러한 변형은 용액의 pH에​​ 대한 적정 곡선을 변경. 메틸화는 ?...

토론

얇은 순수 콜라겐 어셈블리 변성 콜라겐의 층별 증착을 이용하여 충전 재료 또는 세포 표면 상에 증착 될 수있다. 이 연구의 결과는 메틸화 네이티브 콜라겐 succinylation 세포 (도 2) 상에 얇은 콜라겐 매트릭스 어셈블리를 증착하기 위해 레이어 - 바이 - 레이어 기술로 사용될 수있다 (도 1) 또는 다른 충전 폴리 양이온과 폴리 음이온 콜라겐 용액을 생성 함을 입증 재료 표면...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
collagen type I, rat tail	Life Technologies	A1048301	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	Sigma-Aldrich	C3867-1VL	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	EMD Millipore	08-115	option for concentrated rat tail collagen
collagen type I, rat tail	R%D Systems	3440-100-01	option for concentrated rat tail collagen
succinic anhydride	Sigma-Aldrich	239690-50G	succinylation reagent
anhydrous methanol	Sigma-Aldrich	322415-100ML	methylation reagent
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881-500G	pH precipitation reagent
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331-500ML	pH precipitation reagent
rat collagen type I ELISA	Chondrex	6013	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Sigma-Aldrich	MAK008-1KT	option for detecting collagen content
hydroxyproline assay kit	Quickzyme Biosciences	QZBtotcol1	option for detecting collagen content