엔지니어링 정원 담금질 Lactonases를 사용하여 병원성 바이오 필름의 안티 악성 중단

요약

Quorum-quenching enzymes are anti-virulent and anti-bacterial options that can mitigate pathogenesis without risk of incurring resistance, by preventing the expression of virulence factors and genes associated with antibiotic resistance and biofilm formation. In this study, we report a method that demonstrates the efficacy of quorum-quenching enzymes in bacterial biofilm disruption.

초록

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The persistence of bacterial infection is often associated with quorum-sensing-mediated biofilm formation. Thus, the disruption of this signaling circuit presents an attractive anti-virulence strategy. Quorum-quenching lactonases have been reported to be effective disrupters of quorum-sensing circuits. However, there have been very few reports of the effective use of these enzymes in disrupting bacterial biofilm formation. This protocol describes a method to disrupt biofilm formation in a clinically relevant A. baumannii S1 strain through the use of an engineered quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is a major human pathogen implicated in serious hospital-acquired infections globally and its virulence is attributed predominantly to its biofilm's tenacity. The engineered lactonase treatment achieved significant A. baumannii S1 biofilm reduction. This study also showed the possibility of using engineered quorum-quenching enzymes in future treatment of biofilm-mediated bacterial diseases. Lastly, the method may be used to evaluate the competency of promising quorum-quenching enzymes.

서문

감염성 질환에 대한 치료 옵션은 항생제 ¹ 광범위한 면역 다제 내성 박테리아에 급격한 증가에 의해 복잡 하였다. 내성 세균 - 매개 감염에서 높은 이환율 및 사망률, 신약 개발 과정을 확대 및 / 또는 치료 옵션을 향상시키기 위해 더 항균 대안을 모색 할 필요가있다. 최근에, 항 병원성 접근법 따라서 저항 메커니즘 ^(2)의 위험을 완화, 비 살균 방법을 통해 독성을 예방 가능성 주어진 관심을 얻고있다.

쿼럼 센싱 박테리아 독성이 신호 현상의 중단에 '마스터 스위치'는 발병 ^3에 대한 유망한 항 독성 방법이다. 세균 집단 임계 밀도에 도달 한 후 독성의 발현은 세포 외 환경에서 정수 분자의 축적을 필요로한다. 로 현럼 분자는 자신의 동족 수용체와 결합하면 독성 인자의 활성화뿐만 아니라 항생제 내성 및 biofilm 형성 ^(4)과 관련된 유전자지도, 세포 내 매트릭스로 다시 확산. 일반적으로, 정족수 감지 중단에 차 대사 경로에 영향을주지 않고 쿼럼 분자와 수용체의 상호 작용을 억제하는 것을 포함한다. 따라서,이 세포 성장에 직접적인 의미가 없습니다. 체력이 저하되지 않기 때문에, 발전 및 치료에 대해 ⁵ 저항을 얻기위한 최소한의 박테리아 선택 압력이 존재한다. 또한, 정수 감지 중단은 항균제으로부터 보호를 제공하고, 면역 반응을 호스팅 생물막 형성의 경우와 같이, 고유 세균성 보호 메커니즘을 방해 할 수있다.

그것은 지구에 미생물의 99 %가 일 이내 거주 미생물에 중요한 생존의 장점을 부여, 복잡한 바이오 필름 같은 행렬에 존재하는 것으로 추정된다ESE 구조 ^6. 더욱 중요한 것은,이 고착 영역의 형성은 가장 지속적인 만성 병원 내 감염 ^(7)의 원인이다. Acinetobacter baumannii의 글로벌 병원 내 감염과 연관되어 있고 그 독성이 크게 정수 감지에 기인 주요 인간 병원체 중 하나 인 - 매개 biofilm 형성 ^8. 정원 담금질 효소는 그람 음성균 ^(9)에 의해 생성되는 N 아실 호모 세린 락톤 (AHLs)로 공지 된 화합물의 그룹을 대상으로하여 정수 - 매개 신호 전달을 방해에서 성공적으로 사용되어왔다. 여러 연구는 또한 생물막 ^10,11 독성 인자의 발현 및 세포 수의 감소를 통해 박테리아 발병을 차단하는이 효소의 용도에 확대. 불행하게도, 세균성 병원체에 의한 바이오 필름 형성에 대한 쿼럼 담금질 효소의 효과적인 사용의 만져서 알 수있는 데모의 부족이 남아있다. 그만큼다시 A를 방해, 쿼럼 억제제 (AHL 유사체), 대신 쿼럼 담금질 효소를 사용하려고왔다 baumannii의 생물막 형성 ^(12). 작은 분자 억제제를 사용하는이 방법은 유효한 방법이지만, 병진 용도에서의 생체 이용률을 유지하는 것은 도전이 될 수 있습니다. 효소는 치료 효과에 대한 생의학 장치의 표면에 고정화 향해 더 의무만큼 반대로, 촉매 정수 담금질 효소의 사용은 생체 이용률 문제를 회피 할 수있다.

여기, 우리는 크리스탈 바이올렛 염색 및 공 초점 레이저 주사 현미경 (CLSM)를 사용하여, Geobacillus의 kaustophilus (GKL) 세균 바이오 필름 ​​형성에 ^13에서 설계 쿼럼 담금질 lactonases의 효과에 대한 평가에 대해 설명합니다. 이 연구는 임상 적으로 A의 생물막 중단되는 최초의 성공적인 데모입니다 쿼럼 담금질 효소를 사용하여 baumannii의 S1 변형. 방법 설명본 연구에서 병원성 그람 음성 세균에 대한 후속 치료 개발 노력에 다른 쿼럼 담금질 효소의 효능을 평가하는 데 유용합니다.

프로토콜

A의 biofilm 형성 1. 크리스탈 바이올렛 정량 baumannii가 S1

1. A의 5 ml의 문화를 성장 원성 국물에 baumannii가 S1 (LB) 16 시간 동안 진탕 배양기 (220 RPM)에서 30 ° C에서 (트립 톤 10g / L, 효모 추출물 5g / L).
2. A의 문화를 조정 원하는 OD 0.8 ₆₀₀ baumannii의 (S1). 96 웰 플레이트를 사용하여, 박테리아 배양 접종 : GKL 정제 효소 (40 ㎎ / ㎖) 10 ㎕를 함유 신선한 LB으로 (1 내지 100 희석); 새로운 문화의 최종 부피는 100 μL입니다.
3. 뿐만 아니라 제어 문화를 준비; 이 모든 효소가 포함되지 않습니다. 복제의 수를 수득 된 것과 유사한 조건을 반복한다.
4. 뚜껑 판을 덮고 밀봉 (10) L 플라스틱 용기에 넣습니다. 부드럽게 매체를 제거하기 전에 3 시간 동안 30 ℃에서 플레이트를 배양한다.
5. 잘 신선한 LB 배지의 또 다른 100 μl를 추가하고 30 ℃에서 21 시간 동안 접시를 품어.
6. 배양의 두 번째 기간 후, 부드럽게 모든 용지를 제거합니다. 200 μL 멸균 수와 플랑크톤 박테리아 세포를 씻으십시오. 세탁시 세포에 최소한의 방해가 있는지 확인합니다.
7. 각 웰에 1 % 크리스탈 바이올렛 용액 100 μl를 추가하고 실온에서 15 분 동안 품어. 200 μL 멸균 수로 잘 세척하여 크리스탈 바이올렛 솔루션을 제거합니다. 두 번 이상 세척을 반복합니다.
8. 각 웰에 33 % 아세트산 100 μl를 추가하고 부드러운 동요와 15 분 동안 품어; 이는 염료를 용해한다.
9. 600 nm에서의 크리스탈 바이올렛의 흡광도를 측정함으로써 바이오 필름 형성의 양을 정량. 크리스탈 바이올렛의 양은 형성된 바이오 필름의 양에 비례한다.

A. 2. 공 초점 레이저 주사 현미경 baumannii가 S1 바이오 필름

1. A의 5 ml의 문화를 성장 16 시간 동안 진탕 배양기 (220 RPM)에서 30 ° C에서 LB에서 baumannii의 (S1).
2. 광고A의 바로 문화 원하는 OD 0.8 ₆₀₀ baumannii의 (S1). 35mm 유리 바닥 μ-접시를 사용하면, 세균 배양 접종 : 정제 GKL 효소 (40 ㎎ / ㎖)의 30 μl를 포함하는 신선한 LB에 (1 100 희석); 새로운 문화의 최종 부피는 1 ml의입니다.
3. 뚜껑 μ-접시를 덮고 밀봉 (10) L 플라스틱 용기에 넣습니다. 부드럽게 용지를 제거하기 전에 3 시간 동안 30 ° C에서 μ-접시를 품어. 1 ML의 총 부피에 데려 정제 GKL 효소와 신선한 매체의 30 μl를 추가합니다. 30 ° C에서 또 다른 21 시간 동안 품어.
4. 단계를 반복 2.3 및 30 ℃에서 또 다른 24 시간의 μ-접시를 품어. 그런 다음, 부드럽게 용지를 제거합니다.
5. μ-접시에 행크의 균형 소금 용액 (HBSS)에 용해 5 μg의 / ㎖ 알렉스 FLUO 488 - 복합 밀 배아 응집소 (WGA)의 500 μl를 추가하고 30 분 동안 37 ℃에서 배양; 이렇게 형성된 바이오 필름을 염색한다. T 염색 액을 제거하고 세척그는 μ-요리 HBSS 2 ㎖과 함께합니다. 세척 단계를 한 번 더 반복한다.
6. 3.7 % 포름 알데히드 HBSS에 용해시키고, 30 분 동안 37 ℃에서 배양의 500 μl를 추가; 이 μ-요리 상 생물막을 수정합니다. HBSS 2 ㎖로 한 번 μ-접시를 세척 한 후 완전히 솔루션을 제거합니다. μ 디시 생물막 고정 전에 CLSM 촬상 4 ℃에서 어둠 속에서 저장 될 수있다.
7. CLSM 이미징 및 분석을 위해, 스택 당 0.21 μm의 간격으로 이미지 당 97 스택을 생성하기 위해 63 배 배율을 사용합니다.

결과

야생형 GKL 및 개선 GKL 이중 돌연변이 (E101G / R230C를) 크리스탈 바이올렛 정량 실험에서는 두 정수 담금질 효소 생물막 형성에 방해 가능성을 보여주기 위해 사용되었다. 두 효소 lactonase 대해 활성을 보여주기 위해 도시 한 3- 하이드 록시 데카 노일-L 호모 세린 락톤 _(3-OH-10 C -HSL), A.에 의해 사용되는 주요 정수 분자 baumannii가 (S1) ^(14). 생물막 중?...

토론

실험의 두 세트에서, A. baumannii의 S1은 박테리아 ^(15)에 의해 형성된 바이오 필름의 양을 줄일 수있다 높은 염 농도의 NaCl없이 LB 배지에서 배양 하였다. 이러한 인공물의 존재는 생물막의 형성 량뿐만 아니라 다른 처리 조건에 걸쳐 정수 담금질 효소의 영향을 과소 있었다. 촉매 비활성 효소의 사용은 효소 격리의 가능한 효과를 제거하기 위해 음성 대조군 중요하다. 비활성 효소 쿼럼...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	BD	211705
Yeast Extract	BD	212750
96-well plate	Costar	3596
Crystal Violet	Sigma-Aldrich	C6158
Acetic Acid	Lab-Scan	PLA00654X	Caution: Flammable
μ-Dish	Ibidi	80136
Alex Fluo 488-conjugated WGA	Invitrogen	W11261
Hank’s balanced salt solution	Invitrogen	141475095
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Caution: Corrosive
Synergy HT Microplate Reader	BioTek
1X-81 Inverted Fluorescence Microscope	Olympus