탄소 나노 튜브에 의해 안정화 내부 자기 조립 된 지질 입자의 용이 한 제조

요약

We report on a smart application of carbon nanotubes for kinetic stabilization of lipid particles that contain self-assembled nanostructures in their cores. The preparation of lipid particles requires rather low concentrations of carbon nanotubes permitting their use in biomedical applications such as drug delivery.

초록

우리는 탄소 나노 튜브 (CNT)에 의해 안정화 된 지질 나노 입자를 제조하기 용이 한 방법을 제시한다. 벽이 단일 (원시) 및 다층 (관능 화) 탄소 나노 튜브는 피커링 형 중유 (O / W) 에멀젼을 제조하기 위해 안정 화제로서 사용된다. 지질 즉, Dimodan U와 피탄 트리 올 과잉 물에 이연 속성 입방 Pn3m 단계로 자기 조립 유화제로 사용된다. 이 점성이 높은 단계는 기존의 계면 활성제 안정제 또는 탄소 나노 튜브 여기에 완료로의 존재 프로브 초음파를 사용하여 작은 입자로 분열된다. 먼저, 탄소 나노 튜브 (분말 형태)을 최종 에멀젼을 형성하도록 용융 된 지질과 상기 초음파 처리 한 다음 물에 분산된다. 이 과정에서 CNT를 차례로 개월간 안정 입자상 에멀젼을 형성 지질 소적을 둘러싸 추정되는 지질 분자로 코팅하자. CNT 안정화 된 지질 나노 입자의 평균 크기는 서브 마이크론 (R)에입자와 잘 비교 플랜지는, 기존의 계면 활성제를 사용하여 안정화. 순수한 지질 상 (벌크 상태)에 비해 소각 X 선 산란 데이터 CNT 안정화 된 지질 분산액 원래 Pn3m 입방상의 보유를 확인한다. 블루 시프트 및 특성 G 및 라만 분광법으로 탄소 나노 튜브의 관찰 G '밴드의 강도의 저하가 CNT 표면 및 지질 분자 사이의 상호 작용을 특성화. 이러한 결과는 탄소 나노 튜브와 지질 간의 상호 작용은 수용액에서의 상호 안정화를위한 책임이 있음을 시사한다. 안정화를 위해 사용되는 탄소 나노 튜브의 농도가 매우 낮은 지질 분자는 탄소 나노 튜브를 작용 화 할 수있는 바와 같이, 탄소 나노 튜브의 독성 생체 적합성을 크게 개선하면서 크지 않을 것으로 예상된다. 따라서, 본 방법은 m의 배달 nanocarrier 하이브리드 시스템을 개발하기위한, 예를 들면, 다양한 생물 의학 응용에 큰 잠재력을 발견ultiple 병용 요법 또는 polytherapy에서와 같은 기능 분자.

서문

지난 몇 년 동안, 나노 기술, 특히 암 ^1과 악명 높은 질병에 대처하기 위해 의학의 임상 개발 분야의 강력한 도구로 떠오르고있다. 이러한 맥락에서, 광범위하게 같은 약물, 단백질, 핵산, 유전자 진단 이미징 에이전트 ^1-4와 같은 다양한 활성 생체 분자의 전달 수단으로 탐구되는 나노 크기 <1000와 나노 구조. 이 생체 분자 중 하나 나노 입자 내에 캡슐화 또는 나노 입자의 표면에 결합 및 pH와 온도 ^{5, 6} 등의 트리거로 작용 부위에 출시된다. 크기가 매우 작지만, 이러한 나노 입자의 표면적이 큰 활성 생체 분자의 표적 전달을위한 매우 유리한 것으로 증명한다. 입자 크기 및 생체 적합성을 통해 제어 치료 효능, 따라서 나노 입자 ^7,8의 적용을 최적화하기 위해 가장 중요하다.지질 ^9-13, 폴리머 ^{14, 15, 16, 17} 금속과 탄소 나노 튜브 ^{(18, 19)는} 일반적으로 다양한 생물 의학 및 제약 응용 프로그램에 대한 nanocarriers로 사용되어왔다.

또한, 지질 자기 조립 나노 구조를 기반으로 nanocarrier 응용 프로그램은 식품 및 화장품 산업 ^{(20, 21)를} 포함하여 많은 다른 분야에서 다양한 의미를 가지고있다. 예를 들어, 디저트 ^(24)에, 예를 들면 식품 안정제, 단백질 결정화 ^22, 생체 분자 ^(23)의 분리에 사용 된, 이러한 영양소, 맛과 향기 ^25-31 활성 분자의 전달에있다. 자기 조립 지질 나노 구조는 제어 및 타겟팅 방식 ^32-38에 생물 분자를 방출 할 수있는 능력을 가지고 있지 그러나 또한 화학적 및 효소 적 분해 ^{(39, 40)에서} 상기 기능성 분자를 보호 할 수있다. 평면 유체 이중층은 대부분의 통신은 있지만물의 존재 하에서 양친 매성 지질 분자에 의해 형성된 나노 구조체, 예컨대 육각형과 같은 다른 입방 구조는 일반적 ^{20,41,42 관찰된다.} 형성된 나노 구조물의 종류 지질 '모양 분자 구조 물 지질 조성뿐만 아니라, 온도 및 압력에서 ⁴³ 등을 채용 물리 화학적 조건에 의존한다. 비평 지질 나노 구조물의 적용, 특히 그 위상의 차 때문에 높은 점도 불균일 도메인 일관성 제한된다. 이러한 문제는 수 중유 (O / W) 마이크론 또는 서브 마이크론 크기의 지질 입자를 포함하는 에멀젼을 형성하기 위해 과량의 물에서 지질 나노 분산에 의해 극복된다. 분산 입자 내부 원래 지질 자기 조립 구조를 유지하면서 이러한 방식으로, 낮은 점도의 적합한 제품을 제조 할 수있다. ISAsomes ⁴⁴ 약칭이 내부 자기 조립 입자의 형성 ( 예를 들면, 입방 상 육각형 단계에서 hexosomes)로부터 cubosomes 흔히 고 에너지 입력 단계와 계면 활성제 나 고분자 등의 안정제의 첨가의 조합을 필요로한다. 이러한 방향의 최근 연구는 실리카 나노 입자 ^(46), 적절히 피커링 ⁵¹ Ramsden-피커링 에멀젼 ⁵² 되나 상기 에멀젼의 안정화를위한 ^47-49 점토 및 탄소 나노 튜브 ^(50)을 포함하는 다양한 고체 입자 ^(45)의 적용을 예시한다.

최근, 카본 등의 단층 카본 나노 튜브 (단일 벽 탄소 나노 튜브)와 같은 나노 구조를 기반으로 다중 벽 탄소 나노 튜브 (다중 벽 탄소 나노 튜브) 및 풀러린 ^{(53, 54)은} 새로운 생체 재료로서 주목을 받고있다. 주요 관심사는 독성 ^55-58, 물 불용성 ⁵⁹ 따라서 자신의 생체 적합성 ^(56)이다. 이러한 문제를 해결하기위한 효과적인 방법은 표면 함수지질 비 독성 및 생체 분자를 사용 세계화가. 물의 존재하에 지질 지질 친수성 헤드 기 ^{(60, 61)는} 물에 용해성 또는 분산을 돕는 반면, 탄소 나노 튜브의 표면이 소수성, 극성 수성 매질로부터 보호되는 방법으로 탄소 나노 튜브와 상호 작용한다. 지질 따라서 그들의 장식 적으로 탄소 나노 튜브의 생체 내 독성을 감소시켜야 세포 소기관뿐만 아니라 음식 재료의 적분 성분이다. 탄소 나노 튜브 ^{(18, 19)} 및 지질 나노 ^9-13에 독립적 기반의 바이오 메디컬 응용 프로그램은 광범위한 개발하지만 두 속성을 결합하는 응용 프로그램은 아직 잘 탐험되지 않습니다.

이 작품에서 우리는 지질의 두 가지 유형 및 다중 벽 탄소 나노 튜브는 하이드 록실 및 카르 복실 그룹으로 작용 반면 단일 벽 탄소 나노 튜브는 자연 그대로의 형태로되어있는 탄소 나노 튜브의 세 가지 유형을 사용합니다. 우리는 그의 분산액을 제조하는 탄소 나노 튜브의 매우 낮은 농도를 사용했다안정성은 여러 가지 요인 예를 들어, 지질의 종류, CNT의 유형, CNT 사용에뿐만 아니라 전력 및 기간 등 사용되는 초음파 매개 변수에 대한 지질의 비율에 따라 달라집니다. 이 비디오 프로토콜은 역학적으로 다양한 CNT-안정제를 사용하여 지질 나노 입자를 안정화하는 방법의 기술적 인 세부 사항을 제공합니다.

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프로토콜

주의 :이 작업에 사용 된 탄소 나노 튜브는 대량 대응에 비해 추가적인 위험을 가질 수있는 나노 입자 형태이다. 흑연의 흡입, 천연 및 합성 모두, 석탄 노동자의 진폐증과 유사한 진폐증 ^{(62)가 발생할} 수 있습니다. 또한, 탄소 나노 튜브 ^63-68의 흡입과 관련된 급성 및 만성 독성 탄소 기반 나노 구조의 독성과 기존 연구의 일부에 관한 우려가 제안되고있다. 따라서, 미세 CNT 분말의 흡입을 피하고 신중을 처리합니다. 흡입 한 경우 신선한 공기가있는 곳으로 이동합니다. 호흡이 곤란하면, 순수한 산소를 대신 사용하고 진찰을 받으십시오. 탄소 나노 튜브의 솔루션 / 분산 제형은 오히려 처리 할 안전합니다.

주의 : 지질이 연구에 사용 된 계면 활성제는 식품 등급 재료 및 일반적으로 이렇게 위험하지 않은,하지만 그들은 매우 가연성 또한 눈 및 피부를 자극하고있다. 따라서, 이러한 욕실의 사용으로 모든 적절한 안전 관행을 사용하십시오공학에있어 컨트롤 (흄 후드) 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지, 폐쇄 발가락 신발) 처리 또는 준비 나노 입자 샘플. 피부 나 눈, 적어도 15 분 즉시 다량의 물로 피부 나 눈에 접촉 한 경우. 필요한 경우 의사의 진단을받을 것.

지질 / 물 대량 페이즈 1. 준비

주의 : 4 ° C에서 냉장고에 지질을 저장합니다. 순수 학년 지질는 냉장고에 보관해야합니다 (-20 ° C). 전체 재고 및 취급의 편의의 오염을 방지하기 위해 작은 유리 바이알로 나누어지는. 탄소 나노 튜브 및 계면 활성제를 포함하는 다른 화학 물질은 실온에서 저장하지만 직사광선을 유지 할 수 있습니다.

1. 즉 지질을 유지 Dimodan U (DU) 및 결로 현상을 방지하기 위해 병 / 병 뚜껑을 개봉하기 전에 15 ~ 20 분 동안 RT에서 피탄 트리 올 (PT).
   (참고 : DU는 96 % 모노 글리세 라이드 및 증류를 포함하는 글리세 라이드이고나머지는 디 글리세 라이드 및 유리 지방산이다. 뒤의 두 가지 주요 모노 글리세 라이드 성분은 놀레 (62 %)과 올레산 (25 %)입니다. 따라서 DU의 소수성 부분은 주로 다음과 정확한 조성있는 C18 체인 (91 %)을 포함, C18 : 2 (61.9 %), C18 : 1 (24.9 %), 및 C18 : 0 (4.2 %), C18는 18C-체인 및 콜론 다음 수를 나타내는 C = C 결합의 수를 나타냅니다. PT는 3,7,11,15 테트라 메틸 -1,2,3- hexadecanetriol 광학 이성질체의 혼합물이다. 그것은 에스테르 작용기를 포함하지만, 트라이 하이드 록시 헤드 그룹 매우 분기 phytanyl 꼬리로 구성하지 않습니다. DU와 PT 모두는 안정화 지질 입자 ^{13, 45)의} 코어의 경우와 여분의 수분의 존재하에 입방 상을 형성한다.
2. 온수 욕조 또는 60 ° C 이상으로 유지 비이커 함유 물 튜브 바꾸어 지질 용융 (교반기 가열 : 230 V, 50 Hz에서 630 W 또는 유사한 비이커에 물을 가열하는데 사용되는).
3. 대안 열교환 튜브 히터 블록을 사용하여. 온도 구배 및 후속 지질 분해를 방지하기 위하여, 핫 플레이트 상에 직접 튜브를 함유하는 지질을 가열하지 않는다.
4. 라텍스 전구 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여, (코니 스냅 캡 1.5 mL를) 미리 칭량 microcentrifuge 관에서 용융 리피드 500 밀리그램을 단다.
5. 상기 마이크로 원심 튜브에 초순수 500 ㎖ (물의 비저항 = 18.2 MΩ · cm)을 추가한다.
6. 작은 (주문 제작) 주걱을 사용하여 15 분 동안 수동으로 구성 요소를 섞는다. 플라이어를 사용하여 주사기 바늘 (0.9 mm X 40mm 캐 뉼러 길이)의 날카로운 끝을 평평하게하여 이러한 주걱을 확인합니다.
7. 원심 2,000 × g으로의 속도에서 10 분 동안 지질 / 물 혼합물을 포함한다. 다음 다시 24 시간 동안 평형을 10 분 동안 혼합물을 수동으로 교반한다. 샘플을 특성화하기 전에 5 분을 교반 한 다음 실온에서 그들을 둡니다.
8. 튜브 전체에 걸쳐 평형 지질상의 형성을 위해 약 10 냉동 - 해동 사이클을 수행 INTE rmittently 상기 정의 된 바와 같은 원심 분리 단계를 수행한다. 두 DU 및 PT 형태 고점도 벌크 지질 상 어려운 수동 (도 1)을 처리 할 수있다.
   참고 한 벌크 지질 상에 나노 구조 동작 (격자 형 자기 조립 치수) 분산 입자의 비교하고자 및 / 또는 확인을 대조군으로 사용한다면 상기 프로토콜 (섹션 1)에만 필요 원래 나노 구조의 유지.

다른 CNT-안정제, 즉 SWCNT를 사용하여 높은 에너지 입력 (초음파) 등을 사용하여 점성이 높은 지질 단계에서 유체 일관성 O / W 입자 유화 그림 1. 준비 MWCNT-OH, MWCNT-COOH (참조에서 재생 그림 [50] ) 화학의 왕립 학회의 허가와 함께._upload / 53489 / 53489fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

지질 입자 안정화 계면 활성제 2. 준비

1. 물 (w / w) 계면 활성제 (플루로 닉 F127) 솔루션을 0.2 %를 준비합니다.
   1. (자기 교반 막대를 사용하여 자성 판에) 20 ~ 30 분 정도 교반 한 100 mL의 초순수에 계면 활성제 (백색 솜털 분말) 200 mg을 용해. 플루로 닉 F127은 비이 온성 계면 활성제이며, 일반적으로 에멀젼 안정 화제로서 사용된다. 이 PEO ₉₉ -PPO -PEO _{67 99} 트리 블록 공중 합체이며, 따라서, 물에 용해하는 시간이 오래 걸린다.
2. 유리 바이알에 (박 지어 요소 캡, 20 ㎖ 장착 섬광 소다 석회)을 (파스퇴르 유리 피펫을 사용하여) 용융 DU 또는 PT 500 mg을 추가합니다.
3. 0.2 % F127 용액 9.5 g을 추가합니다.
4. 프로브 초음파 기계에서 단단히 레토르트에 유리 병이 턱 스탠드 클램프 (레토르트가 함께 한 설정이 초음파에 의해 발생 된 진동을 견딜 수 있도록, 클램프베이스로드, 고무 (3) 턱 bosshead)를 스탠드.
5. 셀 초음파 처리기에 연결된 고체 티탄 합금 프로브 (직경 13mm X 139mm 길이)를 삽입한다. 의 측면과 하단은 프로브에 접촉되지 않도록 유리 병의 높이와 위치를 조정합니다. 탐침과 유리 바이알의 저부 사이 0.5 cm의 거리가 양호한 결과를 준다.
6. 전력 (최대) 35 %에서 1 초의 지연 시간에 의해 매개되는 1 초 펄스 모드에서 펄스를 10 분 동안 혼합물을 초음파 처리. 유리 병으로 인해 초음파 처리시 발생하는 열에 매우 뜨거워집니다. 따라서, 클램프를 이륙하기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다.
7. 최소 24 시간 전에 추가 사용에 대한 RT에서 우유 형성 분산을 저장합니다. 이 상분리에 대해 안정성을 확보하는 것이다.
   참고 : 종이 타월로, 아세톤으로 건조를 청소하기 전에 프로브를 사용 후, 다음 초순수로 헹구어한 번 더 그것을 건조 거라고.

물에서 순수한 탄소 나노 튜브의 분산 3. 준비

1. 두 개의 비커에서 색 검은 색 둘 MWCNT-OH 및 MWCNT-COOH 가루 4 ㎎,에 무게.
2. 각 비커에 500 ML의 초순수를 추가합니다. 전력 (최대) 40 %에서 연속 펄스 모드에서 2 분 동안 초음파 처리 혼합물을 초음파 프로브를 사용. MWCNT 분산의 결과 농도는 8 μg의 / ㎖ (원액)입니다.
3. 6.25, 5, 4, 2 μg의가 / ㎖ MWCNT 분산을 달성하기 초순수 적당량으로 MWCNT 원액을 희석.
4. 전술 한 바와 같이 이러한 분산 (3.2 참조) 초음파 처리.
5. 마찬가지로, 6 μg의 / ㎖ SWCNT의 분산 (원액)를 만들기 위해 500ml의 초순수에 분말 SWCNT의 3 밀리그램 (색상 블랙)을 분산.
6. SWCNT 원액을 희석 (3.2 참조) 전술 한 바와 같이, 0.5, 0.4, 0.3125, 0.2 μg의 / ㎖ SWCNT의 분산 외장 물감을 구하도록 초음파 처리rsions.
   참고 : 모든 분산은 약 30 분 동안 분명 그 후 탄소 나노 튜브는 하단에 정착하기 시작합니다.

CNT-안정화 된 나노 구조 지질 입자 4. 준비 (그림 1)

1. 유리 병에 용융 DU 500 mg의 무게가 나간다.
2. 유리 병에 6 μg의 / ㎖의 SWCNT의 분산의 9.5 ML을 추가합니다.
3. 순수 CNT 분산액 (3.2 참조)를 만드는 데 사용 된 것과 동일한 파라미터를 이용하여 CNT-DU 혼합물을 초음파 처리. RT로 냉각되면, 보존 내부적으로 자기 조립 나노 구조를 가진 탄소 나노 튜브 안정화 지질 입자는 준비가 될 것입니다.
4. 유사한 방식으로, 0.4 μg의 / ㎖ 및 0.2 μg의 / ㎖ SWCNT 분산액을 이용하여 지질 입자를 준비한다.
5. MWCNT-OH 및 MWCNT-COOH를 사용하지만 서로 다른 농도, CNT, 즉 8, 4, 2 μg의 / ㎖를 사용하여 지질 입자를 만들기 위해 프로토콜 4.4에 4.1을 따릅니다.
6. 마찬가지로, 4 μg의 / ㎖ MWCNT-OH와 MWCNT를 사용하여 세 가지 CNT-PT 분산을 준비-COOH뿐만 아니라 0.4 μg의 / ㎖의 SWCNT. CNT-PT 분산이 적은 전력 (최대 35 %)하지만 연속 펄스 모드에서 긴 시간 (15 분)가 필요합니다. RT에 분산 쿨하고 특성화하기 전에 24 시간 동안 그들을 둡니다.
   주 : 초음파 매개 변수 (DU 여기 PT에 관해서는) 다른 조성에 대해 서로 다른 지질 다를 수 있습니다; 이들은 잘 분산 안정화를 달성하기 위해 최적화 될 필요가있다.

5. CNT 안정화 된 지질 분산액의 안정성을 모니터링

1. 육안 관찰에 의한 분산의 안정성을 모니터 : 분산이 불안정 할 경우 확인하거나 덩어리가 분산 형성 한 경우.
2. 정기적으로 (디지털 카메라) 사진을 찍어. 예를 들어, 요구 사항에 따라 한 달에 마지막으로 한 번 다음 일주일 동안 매일 다음 2 주 동안 일주일에 한 번 다음, 첫 주에 매일 분산의 사진을 촬영합니다.

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결과

다음 결과 분산액) 안정성, 지질 입자 b) 크기 분포, 자기 조립 및 D의 C) 타입) 탄소 나노 튜브의 지질 코팅 증거를 나타낸다. 분산의 안정성 (그림 2) 자동 초점과 LED 플래시와 5 MP 카메라를 사용하여 측정 하였다.

도 2는 안정적인 에멀션 만 특정 영...

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토론

지질 입자의 안정화
세 개의 다른 탄소 나노 튜브는 지질 분산액을 안정화하기 위해 사용된다; 두은 다층 및 -OH 및 -COOH 그룹을 사용하여 작용 화하고, 하나의 벽과 (원시) 비 - 작용 싱글. MWCNT-COOH : (지름 × 길이)는 다음과 같이 탄소 나노 튜브의 크기 변화 9.5 nm의 X 1.5 μm의; MWCNT-OH : 8-15 나노 미터 × 50 μm의; SWCNT : X 1-3 μm의 1-2 나노 미터. 탄소 나노 튜브 분말은 초 초음파 프로브에...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimodan U	Danisco	15312	Store at 4 °C. Non-hazardous. Irritant to eyes and skin.
Phytantriol (> 95%, GC)	TCI Europe N.V.	P1674	Store at 4 °C. Non-hazardous. Irritant to eyes and skin.
Single walled Carbon Nanotubes (90%)	Nanostructured & Amorphous Materials, Inc.	1246YJS	Store at room temperature. Away from direct light. Irritating to eyes, skin and respiratory system.
Multi-walled carboxylic acid functionalized Carbon Nanotubes (> 80% Caron basis, > 8% carboxylic acid functionalized)	Sigma-Aldrich Co. LLC	755125	Store at room temperature. Away from direct light. Causes serious eye irritation. May cause respiratory irritation.
Graphitized Multi-walled hydroxy functionalized Carbon Nanotubes (99.9%)	Nanostructured & Amorphous Materials, Inc. (NanoAmor)	1224YJF	Store at room temperature. Away from direct light. Irritating to eyes, skin and respiratory system.
Pluronic F127	Sigma-Aldrich Co. LLC	P2443	BioReagent, suitable for cell culture. Not a hazardous substance or mixture. Store at room temperature.
Acetone (99.5%)	Fisher Scientific	10134100	Highly flammable liquid. Causes serious eye irritation. May cause drowsiness or dizziness.
Jars with loose, enfolding lids (375 ml)	VWR International Ltd	216-3308
Beaker, 1,000 ml	Fisher Scientific	12942161	heavy duty, low form, with spout and graduations
Pasteur glass pipette (150 mm length) with latex bulb	Fisher Scientific	10006021
Microcentrifuge tube conical snap cap 1.5 ml	Fisher Scientific	11558232
Spatula	Fisher Scientific	11352204
Heating magnetic stirrer	Fisher Scientific	11715704
Magnetic stirrer bars (cylindrical, opaque PTFE, 30 mm x 7 mm (l x diameter))	Fisher Scientific	10011792
Needle (0.9 mm x 40 mm cannula length)	Terumo UK Ltd	MN-2038MQ
Retort Stand Set - With stand, clamp, base, rod, rubber 3 jaw and bosshead	Camlab Ltd, UK	1177157
Millipore water equipment	Barnstead Nanopure, Thermoscientific, USA
Progen Genfuge 24D Digital Microcentrifuge	Progen Scientific	C-2400
Probe ultra-sonicator, with 13 mm	SONICS, Vibracell,  USA
5 MP camera with auto-focus and LED flash	Samsung Galaxy Fame Mobile camera
Raman Spectrometer	Horiba Jobin-Yvon LabRAM HR800 spectrometer
Mastersizer 3000	Malvern Instruments Ltd, Malvern, United Kingdom
Small angle X-ray scattering (SAXS)	SAXSpace camera (Anton Paar, Graz, Austria), X-ray generating equipment (ISO-DEBYEFLEX3003, GE Inspection Technologies GmbH), closed water circuit (Chilly 35, HYFRA, Germany).