Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

요약

이 프로토콜은 효율적으로기도에게 상피 세포를 성숙 마우스 배아 줄기 세포 유래 최종 내배엽 지시합니다. 분화 기술은 정의 된 무 혈청 배양 환경에서, 폐 계통 사양을 직접 3 차원 decellularized 폐 지지체를 사용한다.

초록

폐 혈통 차별화는 성장 인자 신호 전달, 세포 - 세포 상호 작용 및 세포 - 기질 상호 작용을 포함하는 복잡한 환경 단서의 통합이 필요합니다. 이 때문에 복잡성, 체외에서 폐 개발의 재현부는 도전 된 폐 상피 세포로 줄기 세포의 분화를 촉진합니다. 이 프로토콜에서, decellularized 폐 비계 줄기 세포 유래기도 상피 세포 폐의 3 차원 환경을 모방하고 생성하기 위해 사용된다. 마우스 배아 줄기 세포는 먼저 decellularized 지지체 상에 시딩 티빈 A를 내배엽 세포와 배아 체 (EB) 배양 방법을 이용하여 내배엽 계통으로 분화 최대 21 일 동안 공기 - 액체 계면에서 배양된다. 이 기술은 추가로 성장 인자를 보충하지 않고 작용기도 상피 세포에 접종 세포 (섬 모세포 클럽 세포 및 기저 세포)의 분화를 촉진한다. 이 문화의 설정이 정의되고, serum-무료, 저렴하고 재현성. 제한된 오염이 문화가 아닌 폐 내배엽 계통에서이 있지만,이 프로토콜은기도 상피 인구를 생성하고, 폐포 상피 세포에 상승을 제공하지 않습니다. 이 프로토콜 생성기도 상피는 폐 기관 형성 기간 동안 질병 모델링이나 낭포 성 섬유증과 같은기도 관련 병리의 약물 발견 플랫폼 세포 - 매트릭스 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

폐 혈통에 만능 세포의 감독 차별화는 미세 ^{1, 2에} 정확한 신호 이벤트에 따라 달라집니다. 이 때문에 프로세스의 동적 특성으로는 시험 관내에서 폐 기관 형성 정확한 이벤트를 모방하는 도전되었다. 최근보고는 폐 분화 ^3-8을 달성하기 위해 이차원 문화 수용성 성장 인자로 보충 단계적 혈통 제한 전략을 이용했다. 단계적인 분화 프로토콜에서 다 능성 세포는 배아 줄기 세포 (ESC) 또는 유도 만능 줄기 세포 여부를 먼저 최종 내배엽 세균 층으로 분화되었다. homeodomain을 포함하는 전사 인자의 발현 NKX2-1 의해 식별 내배엽 세포는이어서, 폐 전구 세포에 후 전방 내배엽 운명에 가압 하였다. 이러한 폐 전구 세포는 더 근위 (기도) 또는 원위부 (폐포) 폐 상피 세포 위스콘신에 차별화 된번째는 성장 인자 보충을 계속했다. 이러한 2 차원 전략 폐 상피 세포를 생성하는 약간의 성공이 있었다 그러나이 불분명 효율 다른 내배엽 계통의 오염 가능성, 3 차원 (3D) 구조의 부족 등 여러 제한이 있고, 일부 경우에 정의 문화 사용 혈청 보충과 함께. decellularized 폐 골격에 능성 또는 분화 세포의 배양은 점점 폐 상피 ^{3,5,6,8,9 구조를} 형성하는 시드 세포의 재생 가능성을 평가하기위한 분석법으로 사용된다. 이러한 보고서 문화는 계속 성장 인자 또는 혈청 보충과 비계에 세포를 파종.

폐 개발 환경 단서에 대한 응답으로 분할, 마이그레이션, 유전자 발현 및 개별 세포의 분화를 포함한다. 세포 외 기질 (ECM)는 구조적지지를 제공 할뿐만 아니라, tissu 지시 당 단백질의 격자 인통합하고 이러한 프로세스 ^{10, 11를} 조절하여 전자 형태 형성. 더 생체 폐 개발 환경을 모방 내배엽 배양 용 천연 플랫폼 폐 ECM 지지체를 사용함으로써 높은 효율과 재현성으로 설정 정의 된 3 차원 배양 세포 유래기도 상피 줄기 세포를 생성했다.

쥐의 폐 ECM의 발판이 생성 된 탈세 포화뿐만 아니라 마우스 ESC 유래 내배엽 세포에 의해 생성 이후에 이러한 지지체에 접종 하였다. CXCR4 & C-KIT 단백질의 이중 표현은기도 (근위 폐) 전구 세포로 식별됩니다 SOX2 및 NKX2-1 식 모두에 긍정적 인 최종 내배엽 세포의 정체성과 세포를 나타냅니다. 확실한 내배엽 세포는 시험 관내에서 기능적인기도 상피 세포를 생성하는 데 최대 3 주가 용 공기 액체 경계면 (ALI)에서 배양 하였다.

이 프로토콜은 defini의 폐 계통의 분화를 촉진조기 NKX2-1 ⁺ / SOX2 ⁺ 초기 근위 폐 전구 세포의 출현으로 관찰 칠일뿐만적인의 내배엽. 하루 14 섬모를 포함 등장 문화 성숙한기도 상피 세포 인구의 21 (TUBB4A ^+), 클럽 (SCGB1A1의 ⁺⁾ 및 기저 (TRP63 ^+, KRT5 ⁺⁾ 기본 마우스기도에 대한 형태 학적 및 기능적 유사성을 가진 세포. 이 프로토콜은 상피 세포를기도 강인 분화를 달성하기위한 3 차원 매트릭스의 미세 환경의 중요성을 보여준다.

프로토콜

동물 실험은 아픈 어린이 연구소 대한 병원의 동물 관리위원회의 지침에 따라 수행 하였다.

1. 비계 준비

1. 폐의 탈세 포화
   1. CO ₂ 챔버를 사용하여 성체 위 스타 래트를 안락사. 챔버에서 동물을 놓고 분당 챔버 체적 10-30 %의 충전 속도 100 % CO ₂ 노출을 시작합니다.
      1. 무의식에 대한 동물을 관찰; 이 약 2 ~ 3 분 후에 발생합니다. 의식이 기간에 발생하지 않으면, 속도 및 챔버 시일 채우기 확인. 무의식에 이어, 어두운 눈 색깔과 호흡 부족으로 동물을 관찰한다. 모두가 관찰되는 경우, 1 ~ 2 분 동안 CO ₂ 충전을 유지하고 다음 절차를 챔버에서 동물을 제거합니다.
   2. 앞발과 뒷발 다리를 고정하여 표면을 해부에 동물을 고정하고, 70 % 에탄올로 가슴과 복부 영역을 스프레이. 심장과 루 입구흉골을 따라 수직 절개를 이용하여 흉강을 열어 NGS.
   3. 격막을 통해 작은 절개를 만드 먼저 폐 천공의 가능성을 감소, 폐는 수축하게한다. 봉합과 하대 정맥을 결찰 작은 해부 가위 좌심방의 작은 절개를 배치합니다.
   4. 헤파린 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) (HBSS 10 U / ㎖ 헤파린)로 채워진 25 G 바늘 준비된 10 ㎖ 주사기를 사용하여 폐순환 통해 버퍼 밀어 우심실에 바늘을 삽입하여 폐 관류 시작 (2 ㎖ / 분의 속도로). 폐는 흰색 켜고 좌심방에서 흐르는 유체 분명히 실행 때까지이 절차를 계속합니다.
   5. 관류 후, 갑상선 연골 근처 플라스틱 카테터와 기관 및 cannulate을 노출하고 봉합 제자리에 고정합니다.
   6. 설치 레토르트 스탠드와 클램프에 10 ML의 주사기를 고정하여 중력 재관류 시스템. 제거하고 Discard 주사기 플런저. 폐 위 20cm에 주사기 배럴의 최대 충전 포인트를 고정합니다. 주사기의 끝 및 유관 기관에 탈세 포화 용액을 제공하기위한 콕 반대쪽 긴 플라스틱 배관에 양방향 콕을 부착. 주사기에 솔루션을 붓고 솔루션이 부착 된 플라스틱 튜브와 카테터를 입력 할 수 있습니다.
      1. 1 분 동안의 총 폐 용량 (약 12 ml)에 충전하여 폐 세척 유체 폐 밖으로 흐르게 기관에서 플라스틱 카테터를 제거한다. H ₂ O의 20cm 아래에 압력을 유지하기 위해 폐 lavaging 때 주사기 10 개 이상의 ml에 기입하지 마십시오
   7. 인산 완충 식염수 (PBS) 10 린스 하였다 여덟 번 탈세 포화 용액 폐 반복 세척.
   8. 목과 가슴에 구멍이없는기도와 폐를 해부와 동물에서 분리합니다. vibratome 자체에 대한 준비까지 4 ° C에서 차가운 PBS에서 조직을 유지ctioning.
2. 두꺼운 섹션 생성
   1. 2 %의 약 15 ml의 (w / v) 아가로 오스 4 % 및 6 % 정도로 작은 직사각형 블록으로 모든 돌출부를 매립 (w / v) 아가로 오스를 준비한다. 은 전자 레인지로 PBS에 저 융점 아가로 오스 분말을 녹인다. 열 블록에 50 ㎖ 튜브에 아가로 오스를 전송하고 겔화를 방지하기 위해 40 ° C 이상 온도를 유지한다.
   2. 작은 가위를 사용하여 각 로브 (뇌, 중앙, 액세서리, 그리고 꼬리 오른쪽 엽과 좌측 엽)을 분리하기 위해 각 엽성 기관지의 끝에서 decellularized 폐를 해부하다. 특허 초과 PBS를 제거하고, 2 %의 내부에 배치하는 흡수 시트를 사용하여 각각의 건조 엽 (W / V) 아가로 가열 블록에있다.
   3. 페트리 접시에 배치, 아가로 오스의 코팅의 5 분 후 각 로브를 제거하고 표면은 냉각 판에 1 분 동안 겔 할 수 있습니다.
   4. 부드럽게 5 분 후, 다시 4 % (w / v) 아가로 오스로 멋진 로브를 배치하고, 6 % (w / v) 아가로 오스와 함께 한 번 더 코팅을 반복합니다.
   5. 순차적 공동 후각 로​​브는 ating 가장자리에서 주변 조직 아가 적어도 3mm 금속베이스 몰드를 사용하여 6 % (w / v) 아가로 오스 별도로 각 로브를 포함. 오리엔트 각 로브는 실험자 대향 금형의 표면에서의 돌출부의 가장 큰 평평한 에지 위치로 집게를 사용. 이 날은 vibratome 절편에 대한 표본 플레이트에 고정 된 측면 될 것입니다.
   6. 블록 전에 vibratome와 절편에 적어도 30 분 동안 냉각 판에 겔 할 수 있습니다. 4 ° C에서 최대 12 시간 동안 가습 실에 보관 블록은 이전 절편 vibratome합니다.
   7. 설치 차가운 PBS ^(12)와 절편 챔버를 작성하여 vibratome. 주변의 얼음 목욕과 절편에 걸쳐 차가운 온도를 유지한다. 금형에서 블록을 제거하고 조직의 가장자리에서 약 3mm를 유지하면서, 로브를 둘러싼 초과 아가로 오스를 잘라하기 위해 면도날을 사용합니다.
   8. 접착제를 이용하여 시료 판의 중심에 조직을 고정, 및 t에 접시 잠수함그는 절편 챔버를 PBS-가득합니다. 0.2 mm / 초, 1.85 mm, 및 350 ㎛의 : 각각 이하의 속도, 크기 및 두께의 값을 선택하여 vibratome에 경계가 설정 절편.
      참고 : 로브 방향의 종 방향 및 횡 방향 모두 섹션이 허용됩니다.
   9. 제 각각의 로브 완전히. 섹션 완전히 부 시퀀스의 마지막 날에 의해 분리되지 않는 경우 수동 절단 섹션 작은 가위를 사용하여 무료입니다. 부드럽게 발판 섹션을 수집하고 다음 단계까지 얼음에 PBS에 유의하십시오.
      참고 : 생성 된 섹션은 근위 및 원위 폐 지역과 recellularization에 사용할 수있는 두 소스를 모두 포함한다; 그러나, 표면의 대부분은 말초 폐를 포함합니다.
3. 비계 부분의 오염 제거
   1. 마이크로 원심 튜브 (최대 30 섹션 / 튜브)에 PBS에서 350 마이크론 두께의 발판 섹션을 전송하고 클레아로 처리 (PBS에서 90 U / ㎖) (자료의 목록 참조) 12 -에 실온에서 24 시간,회 전자.
   2. 클레아 제 처리 후, 새로운 마이크로 원심 튜브에 집게를 사용하여 회 전자에 실온에서 6 시간 동안 멸균 상태에서 (PBS 200 U / ㎖ 페니실린 스트렙토 마이신과 25 μg의 / ml의 암포 테리 신 B) 항균 용액으로 처리 전송 섹션.
      참고 : 공사장 공중 발판은 사용하기 전에 일주까지 4 °에서 C에 대한 항균 솔루션에 저장할 수 있습니다.
   3. 항균 용액으로 오염 제거 단계에 이어, 멸균 조건에서 두 번 PBS와 발판을 씻어 세포를 파종하기 전에 무료로 차별화 미디어 (SFDM)를 혈청에 전송합니다.

2. 내배엽 세포 준비

1. 확실한 내배엽 유도
   1. 2I 조건 ^(13)를 사용하여 피더 무료, 혈청 무료 문화에서 마우스 ESC 라인을 유지한다. 트립신에 의해 부착 만능 문화에서 세포를 제거하여 내배엽 유도를 시작합니다.
   2. 20000의 밀도 SFDM 종자 세포를 재현 탁미디어의 변화없이 세포를 3 일 동안 낮은 부착 플레이트 / ㎖는 EB 형성을 허용합니다.
   3. 사흘 부드럽게 10 ㎖ 피펫을 사용하여 50 ㎖로 원뿔형 튜브를 사채를 전송하고 실온에서 3 분 동안 바닥에 수집 할 수 있도록 한 후.
   4. 조심스럽게 대기음 미디어와 추가 신선한 SFDM 미디어 50 NG / ㎖ 티빈 A. 보충
   5. 다시 1에서 낮은 부착 판 위에 종자 세포 : 세 가지 추가 일간 2 밀도와 문화가 결정적인 내배엽 분화를 달성했다.
2. 확실한 내배엽 농축
   1. 하루 6 사채를 수집 트립신 해리와 결합 된 형광 항체 ^(14)를 사용하여 C-KIT와 CXCR4 발현에 대한 레이블을 붙입니다.
   2. 두 마커의 발현을 형광 - 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 정렬 표지 된 세포를 풍부한 최종 내배엽 인구 ^(15)를 얻었다.

3. R​​ecellularization 설치

1. 공기 - 액체 계면문화 설치
   1. 멸균 집게를 사용 소수성 부동 막 (8 μm의 기공 크기)에 SFDM 각 decellularized 발판 섹션 (단계 1.2.9)를 전송합니다. 비계를 확인 섹션 막에 균일하게 확산됩니다.
   2. 각각 SFDM의 1 또는 0.5 ml의에 우물을 작성하여 6 또는 12 웰 플레이트를 준비합니다. 부드럽게 공기 - 액체 배양 설정을 작성, 멤브레인 미디어의 상단에 떠 있도록 우물에 막을 배치합니다.
2. 3D 비계의 시드
   1. 최종 내배엽 마커 (단계 2.2.2)에 대한 다음 FACS는 혈구를 사용하여 정렬 세포를 계산 SFDM에서 5 분,에 resuspend 400 XG에 스핀 다운. 약 100,000 세포 / 10 μL / 골격을 함유하는 부피를 얻기 위해 세포를 재현 탁.
   2. 직접 단계 3.1.2에서 각각의 준비 섹션에 피펫, 세포의 10 μl를 발판을 recellularize합니다.
   3. 문화의 모든 48 시간을 SFDM 미디어를 교체합니다. 약간의 경사에 접시를 들고가 기존의 미디어를 대기음문화를 방해 방지 할 수 있습니다. 천천히 떠있는 막으로 가라 앉는 것을 방지하기 위해 잘의 측면을 따라 문화에 신선한 SFDM를 추가합니다.
   4. 성숙한기도 상피 세포에 접종 세포의 분화를 달성하기까지 21 일 동안 공기 - 액체 문화를 유지한다.
      주 : Recellularized 절 세포 배양 물 ⁽¹⁶⁾ 중 임의의 시점에서 조직 면역 염색법 (IF) 현미경을 위해 처리 될 수있다.

결과

이 프로토콜에 설명 된 바와 같이, 최종 내배엽의 강력한 차별화 상피 세포가 decellularized 폐 비계 부분에 씨앗을 품고 세포의 확장 된 문화를 사용하여 달성 될 수기도 성숙한합니다. decellularized 지지체는 (1) 숙주 세포가 완전히 제거되도록하는 것을 특징으로한다, (2) 세포 외 매트릭스 단백질 분화 지지체를 사용하기 전에 보존하는 것이 권장된다. 도 1a에 도?...

토론

여기에 설명 된 프로토콜은 다른 보충제와 차별화를 직접 천연 폐 비계를 사용하여 성숙한 ESC 유래기도 상피 세포를 생성합니다. 이 문화의 설정은, 무 혈청, 저렴하고 재현성 정의된다. 기본 차별화 미디어의 어떠한 성장 인자 보충이 필요하지 않습니다. 줄기 세포 유래 폐 상피 세포를 생성 이전에 발행 된 방법은 혈통 제한 ^{3,4,8,18,19을} 촉진하는 성장 인자 보충과 2 차원의 전략을 사용하...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Perfusion solution	Sigma	H0777	10 U/ml heparin
Perfusion solution	Gibco	14170112	dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-)
Decellularization solution	BioShop	CHA003	8 mM CHAPS
Decellularization solution	Sigma	E9884	25 mM EDTA
Decellularization solution	BioShop	SOD002	1 M NaCl
Decellularization solution	Gibco	14190-144	dissolved in PBS
Benzonase nuclease	Novagen	70664-3	90 U/ml Benzonase nuclease
Benzonase nuclease	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Antimicrobial solution	Gibco	15140	200 U/ml penicillin streptomycin
Antimicrobial solution	Gibco	15290	25 μg/ml amphotericin B
Antimicrobial solution	Gibco	14190-144	diluted in PBS
Trypsinization	Gibco	12605-028	TrypLE
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	IMDM 2440-053, F12 11765-054	3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	12587-010	B27 supplement (50x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	17502-048	N2 supplement (100x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	15260-037	0.05% (Fraction V) bovine serum albumin
Serum free differentiation media (SFDM)	Gibco	35050-061	200 mM Glutamax
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	M6145	4 μM monothioglycerol
Serum free differentiation media (SFDM)	Sigma	A4403	0.05 mg/ml ascobic acid
Endoderm induction	R&D	338-AC/CF	Activin A
Antibodies
CDH1	BD Biosciences	610181	Mouse, non-conjugated, 1:100
C-KIT	BD Biosciences	558163	Rat, PE-Cy7, 1:100
CXCR4	BD Biosciences	558644	Rat, APC, 1:100
KRT5	Abcam	ab24647	Rabbit, non-conjugated, 1:1,000
NKX2-1	Abcam	ab76013	Rabbit, non-conjugated, 1:200
Laminin	Novus Biologicals	NB300-144	Rabbit, non-conjugated, 1:200
SCGB1A1	Santa Cruz	sc-9772	Goat, non-conjugated, 1:1,000
SOX2	R&D Systems	AF2018	Goat, non-conjugated, 1:400
TRP63	Santa Cruz	sc-8431	Mouse, non-conjugated, 1:200
TUBB4A	BioGenex	MU178-UC	Mouse, non-conjugated, 1:500
Goat IgG	Invitrogen	A-11055	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-21202	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG	Invitrogen	A-31571	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-21206	Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Rabbit IgG	Invitrogen	A-31573	Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Other Materials
Low adherent plates	Nunc	Z721050	Low cell binding plates,  6 wells
Air-liquid interface membranes	Whatman	110614	Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size
Vibratome	Leica	VT1200S	Leica Vibratome
Tissue Adhesive	Ted Pella	10033	Pelco tissue adhesive