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요약

3 차원 (3-D) 환경에서 성장하는 세포는 2-D 환경 (예 : 플라스크 또는 종) 세포 배양에 비해 현저한 개선을 나타낸다. 여기에서 우리는 회전 벽 혈관 (RWV) 생물 반응기에서 제공하는 미세 중력에서 배양 인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 설명합니다.

초록

3 차원 (3-D) 환경에서 성장하는 세포는 다수의 2 차원 환경에서 세포 배양 간격 (예., 플라스크 또는 요리)을 해소 할 가능성이 있기 때문이다. 사실, 널리 접시 또는 플라스크에서 배양 세포 분화 디 그들이 유래 된 조​​직에서의 특화된 기능을 상실하는 경향이 인정된다. (a) 정적 모델 생물을 이용하여 (b) 모델 : 현재 원시 세포 외 기질 (ECM)을 흉내 낸 세포를 지지체로 시딩 3-D 배양 시스템의 두 종류가 주로 존재한다. 제 획기적인 정적 3-D 모델이었다. 이러한 회전 벽 혈관 등의 생물을 이용하여 3-D 모델 (RWV) 생물 반응기는 더 최근의 개발이다. RWV 생물 반응기의 원래 개념은 1990 년대 초에 NASA의 존슨 우주 센터에서 개발 및 저산소, 괴사 코어의 개발로 정적 모델의 한계를 극복 할 것으로 생각된다. RWV의 생물 반응기는 일을 피할 수 있습니다영양분과 산소의 효율적인 확산을 허용 유체 역학을 제공하여 문제가된다. 이 생물 반응 장치 지원 및 폭기 소스 유형에 따라 다릅니다 문화 선박의 두 가지 형식을 회전시키는 역할을 회 전자의 기본 구성 : 공동 축 중앙에 형산, 또는 (1) 느린 켜기 측면 용기 (STLVs) (2 평평한 실리콘 고무 가스 이송 멤브레인을 통해 산소와) 높은 화면 비율 용기 (HARVs). 거품 형성과 그에 따른 혼란을 피하면서이 선박은 효율적인 가스 전송을 할 수 있습니다. 이러한 조건은 모델 배양 용기 중의 중력 (무중력)를 감소 층류 최소 전단력 초래한다. 여기서 우리는 RWV 바이오 리액터에 의해 제공된 소장 상피 세포주 및 일차 인간 림프구 무중력 하에서 배양 된 내피 세포 및 섬유 아세포 이루어지는 인간의 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 기술한다. </ P>

서문

과학자들은 다른 골격 유형 (예., 라미닌, 콜라겐 타입 I 콜라겐 IV 및 피브로넥틴) 및 개선하는 성장 인자의 칵테일을 조사하기 시작했을 때, 3-D 모델을 구축하는 제 침투는 1980 년대 초에보고 세포 간 및 "정적"3-D 모델 1-7의 ECM 상호 작용. 그 이후로,이 모델의 주요 문제는 매체 및 조직 구조 (8) 내에서 영양소의 전송 및 산소 제한하고있다. 혈관의 네트워크 주변에서 일정한 영양분 및 산소의 흐름을 수용하는 생체 환경에서 세포와 대조적으로,이 모델의 정적 특성은 세포로의 효과적인 분산을 방해한다. 예를 들어, 크기가 몇 mm를 초과 체외 정적 모델에서 생성 된 세포 집합체는 변함없이 저산소, 괴사 코어 (9)을 개발할 것입니다. RWV 생물 반응기는이 문제를 피할 수 있습니다영양분과 산소 10-12의 효율적인 확산을 허용 유체 역학을 제공하여. 그러나, 지금까지 RWV 생물 반응기를 사용하여 작업이 하나 또는 두 종류의 세포 13-17의 포함에 한정되었다. 또한, 대신에 기본 조직과 동일한 공간 배향, 이러한 세포는 세포 응집체를 형성했다. 이러한 제한에 대한 가장 큰 이유는 통합 된 방식으로 세포를 통합 할 수있는 발판의 부족이었다. 현재까지 RWV의 생물 반응기에 사용되는 지지체는 주로 합성 마이크로 비즈, 관 실린더 또는 작은 시트 13-15,19-23의, 몇 가지 예외를 제외하고 16 ~ 18으로 구성되어 있습니다. 이러한 조성 및 유연성 조작 할 수없고, 어떤 셀이 그 표면에 부착 된 강성 물질이다. 따라서, 이러한 모델은 통합 된 방식으로 평가하기 위해서는 시스템을 제공 할 가능성은, 다양한 세포와 같은 간질 세포와 같은 구성 요소 (예., 섬유 아세포, 내피 세포 및 면역) 즉이야hould 밀접하게 인간의 조직을 모방하는 발판 내에 분산 될 수있다.

여기서 우리는 장 상피 세포주 및 일차 인간 림프구, 내피 세포로 구성된 인간 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델의 개발을 기술하고, 섬유 아세포 (24). 이 세포는 미세 중력 하에서 RWV 생물 반응기 13,25-30에 의해 제공 배양 하였다. 우리의 3-D 모델에서 ECM 많은 별개 이러한 배지 유사한 삼투압 (예., 배양 중에 무시할 확산 감금) 세포 및 다른 중요한 세포 외 기질 단백질을 포함하는 능력과 같은 특성뿐만 아니라, 같은 보유 적절한 강성 생물 반응기 (24)에 사용될 수있다. 생물학적 시스템은 매우 복잡하고, 지난 몇 년간, isolatio 그들을 공부보다는 주변 환경과 세포의 상호 작용의 시험 향해 점막 연구의 초점의 변화가 있었다엔. 특히, 장 세포 생존 및 분화에 영향을 미치는 세포 - 세포 상호 작용의 중요성을 잘 31-34를 설명되어 있습니다. 구체적으로는, 상피 세포 및 그들의 틈새 사이의 통신은 상피 세포의 확장 및 분화 (35)에 큰 영향을 미친다. 실제로, 널리 사용되는 전용 세포 간뿐만 아니라, 세포 간 상호 작용 ECM 3-D 배양 모델에서 상피 세포의 유지와 분화에 중요하다. 이전의 연구는 콜라겐 I 24,36,37, 라미닌 (38) 및 피브로넥틴 (39)는 원래 점막과 유사한 공간 방향을 취득 장내 상피 세포에 영향을 미치는 수단이되기 때문에 그 직감 ECM 단백질을 증명하고있다. 연구자들은 복잡한 세포 및 구조 아키텍처를 다시하려는 경우 따라서, 새로운 기술의 개발은 우리의 3-D 모델 (24)처럼, 그 창자의 표현형의 다양성이 요구되는 모방 할 수그리고 장내 미세 환경의 기능. 이러한 모델은 새로운 경구 용 약물과 백신 후보들의 평가 및 개발에 중요한 수단을 나타낸다.

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프로토콜

윤리 문 : 모든 혈액 표본이 프로토콜 번호 HP-00040025-1에 참여한 자원 봉사자들로부터 수집 하였다. 메릴랜드 임상 시험 심사위원회의 대학은이 프로토콜을 승인하고이 원고에 포함 된 연구를위한 건강한 지원자에서 혈액 표본의 수집을 승인했다. 이 연구의 목적은 자원 봉사자들에게 설명하고, 모든 자원 봉사자는 정보를 준, 혈액 그리기 전에 동의를 체결했다.

주 : 매체 보충 준비를 위해 표 1을 참조하십시오. 3-D 배양 배지의 제조 표 2 참조.

문화 선박 1. 준비

  1. 50 ML-용기의 충전 포트의 뚜껑을 풀고 무균 배지 50 ㎖ (예., RPMI)를 입력합니다. 층류 후드에서 무균 조건 하에서 모든 절차를 수행합니다.
  2. 뚜껑을 교체하고 70 % 에탄올로 어떤 표면에 어떤 유출 매체를 닦아냅니다.
  3. 선박이 incub 허용RT에서 O / N에 적어도 15 분 동안 먹었다.
  4. 배양액을 버리고 3-D 배지 30 ㎖를 추가 충전 포트를 사용한다.
  5. 70 % 에탄올로 어떤 표면에 어떤 유출 매체를 닦아주십시오.

세포의 제조 2

  1. 인간 상피 세포주 (HCT-8) 24,40.
    1. RPMI에서 배양 세포를 100 U / ㎖ 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신, 50 μg의 / ml의 겐타 마이신, 2 mM L- 글루타민이, 1 mM 피루브산 나트륨, 10 mM의 HEPES는 (버퍼 및 10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 FBS로 보충 ) (보충 1). 70 % 컨 플루 언시, 하나의 비율로 분할 셀 : 5이다.
  2. 인간 대장 섬유 아세포 (CCD-18Co 세포) 24,41.
    1. 보충 1 풍부 기저 이글 배지에서 배양 세포 포화 상태에서, 1의 비율로 분할 세포 :. 3.
  3. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 셀 24,42.
    1. 내피 기저 중간 (EBM)에서 배양 세포를 배지 100 μg의 / ㎖ 헤파린, 3 μg의 / ml의 내피 세포 성장 보충 (심전도)가 풍부하고, 1을 보충 70 % 컨 플루 1의 비율로 분할 세포에서 :. 2.
  4. 림프구 / 단핵구
    1. 표준 기술 (43)을 사용하여 밀도 구배 원심 분리에 의해 혈액으로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리.
      1. 간략하게, 10 ml의 피펫을 사용하여 조심스럽게 희석 혈액 30 ㎖를 추가 (1 : 1 혈액 : 인산 완충 식염수 (PBS)) 밀도 원심 분리 배지 10ml를 함유 한 50㎖ 원추형 튜브에. 원심 분리 단계 후, 림프구 및 단핵구는 밀도 원심 분리 매체와 플라즈마 층 사이의 "화이트"레이어에있는 것입니다.
      2. 전송 피펫을 사용하여 백색 층을 수집합니다. 밀도 원심 분리 매체의 수집을 제한하여 과립구 오염을 방지. (43)를 세척 한 후, 유같은 자체 PBMC는 또는 액체 N 2 냉동 보관.
        참고 : PBMC 크게 수지상 세포와 다른 세포 유형의 작은 비율로, 림프구 및 단핵구로 구성되어 있음을 강조하는 것이 중요하다.
  5. 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 표준 배양 조건에서 모든 셀을 성장한다.

콜라겐 임베디드 세포의 3. 준비

  1. 인서트의 개수를 결정하는 것은 실험 조건의 수에 기초하여 필요가 셋업된다. 6 잘 판의 우물에 삽입 적절한 수를 놓습니다.
  2. HUVEC 및 섬유 아 세포의 현탁액을 준비합니다 :
    1. PBS 두 번 플라스크를 씻고 0.05 % 트립신 테트라 에틸렌 (트립신 - EDTA)와 트립신, 0.25 % (1 배)를 사용하여 세포를 분리. 세포 배양 면적의 전체를 커버하기에 충분한 트립신 용액을 첨가. 분리는 일반적으로 15 분에 5 내에서 발생
    2. 수집둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) -30 % FBS 배지 30 ㎖를 함유하는 50 ㎖ 튜브에서 분리 된 세포.
    3. 10 분 동안 500 XG에 튜브를 원심 분리기.
    4. DMEM-30 % FBS 배지 30 ㎖로 세포를 재현 탁.
    5. 트리 판 블루 염색 20 μL에 재현 탁 된 세포를 20 ㎕의 희석하여 생존 세포의 수를 계산. 세포 혼합물과 혈구를 넣습니다. 유력한 PBMC를 분명 흰색 될 것입니다; 생존 할 PBMC는 염료를 획득하고 파란색이 될 것입니다.
      1. 8 × 107 셀 ML - - (5)의 농도로 DMEM-30 % FBS 배지에서 각 세포 유형을 재현 탁 1.
  3. 세포 함유 콜라겐 젤을 준비
    참고 : 각 선박이 세포 함유 콜라겐 겔 ~ 5 ㎖의 준비가 필요합니다.
    1. 한 50㎖ 원추형 튜브를 50㎍ / ml의 겐타 마이신, 2 mM L- 글루타민 및 10 % 열 - inactivat 보충 한 X DMEM 배지를 첨가하여 콜라겐 혼합물을 제조에드 FBS 플러스 3 ㎎ / ㎖ 소 콜라겐 I, 10 μg의 / ㎖ 라미닌, 40 μg의 / ㎖ 콜라겐 IV, 10 μg의 / ㎖ 피브로넥틴, 2 μg의 / ㎖ 헤파린 황산 프로테오글리칸 15 mM의 수산화 나트륨 (생리적 산도에 도달하기 위해).
    2. 상기 튜브를 닫고, 혼합물을 완전히 균질화 될 때까지 수회 반전시켜 혼합한다. 거품 형성을 피할 것.
      중요 : 겔화를 방지하기 위해 얼음에 혼합 보관하십시오.
      1. 중요한 단계 : 혼합물을 산성 외관 (노란 색)을 전개하면, 혼합물을 중화 멸균 1 N NaOH를 몇 방울을 추가한다.
    3. 각각 농축 된 콜라겐 혼합물 (전술)에 2.0 × 106 세포 / ml - 1.2 1.5 - 1.0 밀도 농축 HUVEC 및 섬유 아세포를 추가한다. 튜브를 닫고, 혼합물을 완전히 균질화 될 때까지 수회 반전시켜 혼합한다. 거품 형성을 피할 것. 중요 : 겔화를 방지하기 위해 얼음에 혼합 보관하십시오.
    4. 셀 함유 콜라겐의 5 ml의 - 4 추가각 삽입에 젤, 이전에 6 잘 플레이트에로드하고, 1 시간 동안 거의 또는 전혀 운동과 후드에서 겔화하는 것을 허용했다.
    5. 2 개의 추가 시간 - 1 시간 후, 1 37 ° C, 5 % CO 2 배양기로 6 웰 플레이트를 전송할 수 있습니다.
    6. 후드에 6 웰 플레이트를 반환하고, 멸균 집게의 도움으로 무균 차단 메스 막을 막에서 세포 함유 겔을 분리 삽입에서. 작은 사각형으로 분리 된 겔 (~ 5 × 5mm)를 잘라.
    7. 충진 포트를 사용하여 50 mL의 HARV에 소세포 함유 사각형을 추가한다.
  4. HCT-8 상피 세포의 현탁액을 준비합니다 :
    1. PBS 두 번 플라스크를 세척하고 트​​립신 - EDTA 처리와 트립신, 0.25 % (1 배)를 사용하여 세포를 분리. 세포 배양 면적의 전체를 커버하기에 충분한 트립신 용액을 첨가. 분리는 일반적으로 10 ~ 15 분 이내에 발생합니다.
    2. DMEM-30 % FBS 배지 30 ㎖에서 분리 세포를 수집.
    3. Centrif10 분 동안 500 XG에 튜브를 함유 UGE DMEM-30 % FBS 배지.
    4. DMEM-30 % FBS 배지 30 ㎖로 세포를 재현 탁.
    5. 3.2.5에 기술 된 바와 같이 생존 세포의 총 수를 계산.
    6. 10 7 세포 ml의 농도로 DMEM-30 % FBS 배지에서 HCT-8 상피 세포를 재현 탁 - 1.
    7. 충진 포트를 사용하여 50 mL의 HARV로 농축 HCT-8 상피 세포에 1 ml의 추가.
  5. 선박이 거의 가득 찰 때까지 충진 포트를 사용하여 (~ 20 ml)에 추가로 3-D 배양 배지를 추가한다.
  6. 뚜껑을 교체하고 70 % 에탄올로 충전 포트의 입술을 닦아냅니다.
  7. RWV 각 주사기 포트 주사기 넣 장소 3 함유하는 5 ㎖ 주사기 - (4) 하나의 포트에서의 3-D 배양 배지 ㎖의 다른 포트에 5 ㎖ 빈 주사기.
  8. 매체의 거의 같은 볼륨이 다른 주사기 포트를 통해 주입하는 동안 빈 주사기로 당겨 눈에 보이는 거품을 제거합니다.
  9. VES 배치SELS 생물 반응기에서, 전원을 켜고 분당 약 13 ~ 14 회전에 속도를 설정합니다.
    주 : 긴급 단계 : 회전 속도하여 혈관 벽과의 접촉을 피하고, 상기 용기 내에 선회 세포를 유지하기 위해 실험 중에 몇 번 조정될 필요가있다.
  10. RWV 생물 반응기에서 제공하는 37 ° C, 미세 중력에서 5 % CO 2에서 배양 세포.
  11. 새로운 3-D 배양 배지에 약 30 mL로 대체하여 4 일 - 매 3 변경 배지.
  12. 사일 (± 1 일) 후, 생물 반응기에서 혈관을 제거하고 혈관 (× 10 7 / 용기 (2))에 림프구 / 단핵 세포를 추가합니다.
  13. 추가 오일 (± 1 일), 37 ° C, 5 % CO 2에서 다시 생물 반응기의 용기를 놓습니다.
  14. 추가 오일 (문화의 날 9) 한 후, 선박 (2 × 10 7 / 용기)에 림프구 / 단핵구를 추가하고 최대 12 개의 추가 일 동안 문화를 계속합니다.
  15. 새로운 3-D 배양 배지에 약 30 mL로 대체하여 4 일 - 매 3 변경 배지.

조직학 4. 수확은 3-D 문화

  1. 10 % 포르말린 버퍼 10 ㎖를 포함하는 여섯 잘 플레이트로 전송 피펫 수확의 도움을 지금라는 각각의 작은 젤 조각, "건설,"와. 실온에서 3 시간 동안 떠나거나 12 - 4 ℃에서 16 시간.
  2. 라벨링 각 카세트에 생검 폼 패드의 두 부분을 추가함으로써, 조직 처리 및 매립 카세트를 준비한다.
  3. 10 % 포르말린 버퍼에 카세트를 담가.
  4. 집게의 도움으로 두 폼 패드 사이의 고정 구조를 배치합니다.
  5. 10 % 포르말린 버퍼에 카세트를 담가.
  6. , 내장 절편, 44를 염색에 대한 표준 절차를 진행합니다.

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결과

이전에, 우리는 장 상피 세포주 및 일차 인간 림프구 무중력 상태 (24) (도 1)에서 배양 내피 세포 및 섬유 아세포 이루어진 인간 장 점막의 다세포 3 차원의 Organotypic 모델을 설계했다. 섬유 아 세포와 내피 세포는 내가 추가 장내 지하 막 단백질 45 (예., 라미닌, 콜라겐 IV, 피브로넥틴 및 헤파린 황산 프로테오글리칸) 풍부 행렬 콜라겐...

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토론

이 논문에서는 일차 인간 림프구, 섬유 모세포, 및 내피 세포뿐만 아니라 소장 상피 세포주를 포함한 24 배수 종류의 세포로 구성된 인간 장 점막의 생체 공학 모델의 개발을 기술한다. 이 3-D 모델에서 세포는 미세 중력 상태 (24)에서 콜라겐이 풍부한 세포 외 기질 내에서 배양된다.

전술 한 바와 같이,이 모델의 주요 기능은 다음과 같다 : (i) 상피 ...

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공개

The authors declare that a US Non-Provisional Patent Application has been filed in the U.S.Patent and Trademark Office (Number: 13/360,539).

감사의 말

This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor SyntheconRCCs-4DQFor up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
Disposable 50 ml-vesselSyntheconD-405Box with 4 vessels
HCT-8 epithelial cells ATCCCCL-244
CCD-18Co Fibroblasts ATCCCRL-1459
Human Umbilical Vein Endothelial CellsATCCCRL-1730HUVEC
Fibroblast Growth Factor-Basic SigmaF0291bFGF
Stem Cell Factor SigmaS7901SCF
Hepatocyte Growth Factor SigmaH1404HGF
Endothelin 3SigmaE9137
LamininSigmaL2020Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Vascular Endothelial Growth Factor SigmaV7259VEGF
Leukemia Inhibitory Factor Santa Cruzsc-4377(LIF
AdenineSigmaA2786
InsulinSigmaI-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine SigmaT-6397T3
Cholera ToxinSigmaC-8052
FibronectinBD354008Isolated from human plasma
apo-TransferrinSigmaT-1147
HeparinSigmaH3149
Heparan sulfate  proteoglycanSigmaH4777Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Collagen IVSigmaC5533Isolated from human placenta
Heat-inactivated fetal bovine serum Invitrogen10437-028
D-MEM, powderInvitrogen12800-017
10% formalin–PBS Fisher ScientificSF100-4
Bovine type I collagen InvitrogenA1064401
Trypsin-EDTA Fisher ScientificMT25-052-CI
Sodium pyruvateInvitrogen11360-070
Gentamicin Invitrogen15750-060
Penicillin/streptomincin Invitrogen15140-122
L-GlutamineInvitrogen25030-081
HepesInvitrogen15630-080
Ham's F-12Invitrogen11765-054
Basal Medium EagleInvitrogen21010-046BME
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Endothelial Basal MediumLonzaCC-3156EBM-2
Endothelial cell growth supplementMillipore02-102ECGS

참고문헌

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