점액 아가로 오스 겔 전기 영동 : 높은 분자량 당 단백질에 대한 웨스턴 블로 팅

요약

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

초록

뮤신, 점막 표면에 선을 긋고 무겁게-당화 단백질, 침입 병원균에 대해 상피 세포를 보호하여 타고난 방어의 핵심 구성 요소로 진화했다. 이러한 거대 분자의 주요 역할은 점막의 윤활을 추진하면서 입자 트래핑과 간격을 촉진하는 것입니다. 단백질 합성 중에 뮤신 극적 이들 분자의 질량 및 크기를 증가 강렬한 O 글리코 실화 및 멀티 머화를 겪는다. 이러한 번역 후 변형이 점액의 점탄성 특성에 대한 중요하다. 이들 분자의 복잡한 생화학 적 및 생물 물리학 적 성질의 결과로서, 뮤신과 협력하여 통상의 단백질의 분석 방법에 의해 극복 될 수없는 많은 문제점을 제공한다. 예를 들어, 높은 분자량 일반 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 통해 이동을 방지 및 접착 성질은 실험 튜브에 접착시킨다. 그러나, 건강 점액의 역할을 조사(예., 점막의 무결성 유지)과 질병 (예., hyperconcentration, mucostasis, 암) 최근에 얻은 관심과 뮤신은 치료 대상으로 연구되고있다. 생산과 점액 거대 분자의 기능의 더 나은 이해는 새로운 제약 접근 방법, 예를 들어, 점액 과립 세포 외 유출 및 / 또는 mucolytic 에이전트의 억제제가 발생할 수 있습니다. 따라서, 일관되고 신뢰할 수있는 프로토콜은 점액 생물학​​은 과학의 발전에 중요한 조사합니다. 여기서는, 아가 로스 겔 전기 영동을 사용하여 점액 고분자 분리 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 전송하고, 점액 특정 항체의 신호뿐만 아니라, 적외 형광 겔 리더를 검출하는 종래의 방법을 설명한다. 이러한 기술은 점액 정량 멀티 머화를 결정하고, 점액에 대한 약리학 적 화합물의 효과를 시험하기 위해 널리 적용 할 수있다.

서문

뮤신은 일반적으로 외부 환경에 노출되는 공동 라인 점막 표면에 의해 생성된다 (예., 호흡, 소화, 생식 책자, 안구 표면) 및 내부 기관 (예, 췌장, 담낭, 젖샘). 이러한 당 단백질의 존재는 표면의 수분을 유지하고 병원체에 대한 물리적 장벽을 형성한다. 점액 생산은 돌이킬 수없는 조직 손상을 일으킬 수 덕트 방해, 세균성 식민지 및 만성 염증으로 이어질 수 있습니다, 점액 hyperconcentration 및 / 또는 비정상적인 점액 속성을 건강 점막하는 것이 필수적이지만. 유사한 이벤트 캐스케이드 여러 질환에서 관찰되는 등., 낭성 섬유증 ^한 만성 중이염 ² 자궁 경부 감염 ^3. 따라서, 건강과 질환에서 점액의 역할을 이해하고 단백질 식별을 위해 루틴 프로토콜을 설정하는 것이 중요하다.

현재까지19 뮤신 유전자 식별 및 1200에 이르기까지 큰 폴리펩티드 사슬을위한 인코딩 된 (예., MUC1) 22,000 (예를 들어, MUC16) 아미노산에. 뮤신 유전자 패밀리는 두 개의 하위 유형으로 나눌 수있다 점액 겔의 점탄성 특성에 대한 세포 시그널링 및 차폐면에 관여하는 막 - 관련 뮤신, 상기 겔 형성 뮤신은 책임. 막 - 관련 뮤신 주로 단량체이며 소수성 막 - 스패닝 도메인을 통해 세포 표면에 부착. 대조적으로, 겔 형성 뮤신 동적 고분자 네트워크의 형성에 필수적인 여러 폰 빌레 브란트 인자 (vWF의) -like 시스테인 풍부 도메인을 갖는다. 큰 글리 칸은 세린과 apomucin에 걸쳐 분산 트레오닌 잔기에 부착된다. 이러한 고밀도 O 결합 올리고당 분자량 ^(4)의 80 %에 기여할 수있다. 뮤신 단량체 접속 인트라 및 분자간 이황화 결합은 뮤신 겔 networ의 무결성을 보장케이. 무거운 글리코 실화 및 멀티 머화 결과, 뮤신은 동물계에서 가장 큰 분자에 있으며, 종래의 SDS-PAGE 폴리 아크릴 아미드 겔 및 표준 단백질 사다리를 사용하여 표준 겔 전기 영동에 의해 분석 될 수 없다. 점액 단량체 MUC16의 경우 2 MDA까지 도달 할 수 있지만 이러한 방법은 250 kDa의보다 낮은 분자량 / 별도의 단백질을 해결. 그러나, 고 분자량 단백질 래더 작은 점액 단량체를 연구하는데 사용될 수있다 (예., MUC1).

다양한 기술 뮤신 크기, 형태 및 상호 작용을 연구하기 위해 적용될 수있다. 전통적으로, 뮤신의 생화학 적 특성은 크기 배제 크로마토 그래피 및 면역이어서 변성 버퍼 밀도 (isopycnic) 밀도 구배 원심 분리를 통해 분리 점액에 의해 달성된다 (예., 슬롯 블롯) ^5. 동적 및 / 또는 멀티 앵글 빛 산란 뮤신 풍부한 샘플 올리고머 상태에 대한 정보를 제공 ^{1. 또한, 면역 및 투과 전자 현미경과 결합 된 레이트 - 띠 원심 일반적 뮤신 (6)의 고분자 입체 구조를 결정하는 데 사용된다. 질량 분석은, 뮤신을 정량화 단백질 분해 절단을 검출 올리고당 조성물 -1,7,8,8-을 분석하기 위해 사용된다. 이러한 기술들은 시간이 소요 종종 큰 양 및 / 또는 샘플의 높은 농도를 필요로 비싸다. 이 방법은 본 명세서에 기재된 예., 전기 영동에 의해 분리 점액 재현 저비용이고 상대 뮤신 정량을 제공하고, 중합체 조립체를 조사 높은 처리량의 연구에 사용될 수있다. 그러나이 분석은 드문 점액 사용할 수 없습니다 높은 친 화성이 높은 특이성 점액 항체가 필요합니다 (예., MUC19) 또는 특정 종 (예., 돼지, 흰 족제비).}

아가로 웨스턴 블 롯팅은 집중하고 함께 점액 풍부한 샘플의 다양한 해결하기 적합50 μg의 / ㎖ (예., 셀 세척) 5 ㎎ / ㎖로 (예., 객담)에 이르기까지 TIONS. 이 분석은 1990 년대에 도입 된 단지 몇 개의 전문 실험실 ^{9, 10에서} 수행되었다. 우선,이 기술은 인간의 호흡기 분비물 ^11,12 뮤신 단량체의 개체군을 식별 돕고 골지체 ¹³ 다이머 멀티 머화 하였다 소포체의 이량 체 형성 구성 술잔 세포 올리고머 프로세스를 확인했다. 최근 쥐의 점액에 대한 클론 항체의 생성은 점액을 제거하기위한 테스트 약리 화합물을 작은 동물 모델에 대한 연구 (예., 부족, βENaC, OVA-도전 마우스 모델 점액을) 촉진 및 임상 연구에 연구의 새로운 분야를 개방 폐 ^14-17. 생물학 및 신규 생성 점액에 대한 관심이 증가의 결과로서, 더 구체적 점액 항체, 우리는를 설명 hereiN 방법론은 아가 로스 겔 전기 영동하고 니트로 셀룰로스 두 색 적외 형광 검출에 의해 진공 반송 뮤신을 분리한다.

프로토콜

1. 점액 젤 웨스턴 블로 팅에 대한 버퍼를 준비합니다

1. 50 배 TAE (트리스 - 아세테이트 - EDTA) 버퍼 1 리터를 준비합니다.
   1. 증류수 (DH ₂ O) 700 ml의 트리스베이스 (0.4 M) 242 g, 빙초산의 57.1 g (무게 액체) (0.2 M) 및 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (50 밀리미터)의 14.61 g을 추가합니다.
   2. 8.0으로 산도를 조정하고 DH ₂ O. 1이 리터 볼륨을 만들
2. 10 배 로딩 버퍼 10 ㎖를 준비합니다.
   1. 1X TAE 버퍼 5 ㎖를 준비합니다. 이를 위해, 글리세롤 (50 %) 5 ㎖, 브로 모 페놀 블루 (0.25 %), 25 mg의 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) (1 %), 100 mg의 추가.
3. 20 배 나트륨 염 구연산 (SSC) 버퍼 2 리터를 준비합니다.
   1. DH ₂ O의 1.5 리터에서 염화나트륨 (3 M)의 350.6 g 및 트리 소듐 시트 레이트 (나 ₃ C ₆ H ₅ O ₇₎ (0.3 M)의 176.4 g을 추가합니다. 7.0으로 산도를 조정하고 DH ₂ O와 2 리터 볼륨을 만들
4. 1X TAE-0.1 % SDS 버퍼 1 리터를 준비합니다.
   1. DH ₂ O의 980 ml의 50 배 TAE의 20 ML을 추가 0.1 % SDS-TAE 솔루션을 만들기 위해 SDS의 1g을 추가합니다.

2. TAE-SDS 아가 로스 젤 준비

1. (. 즉, 150 ㎖) - 7mm 두께의 젤 충분한 볼륨을 부어 전자 레인지 삼각 플라스크에 1X TAE-0.1 % SDS 버퍼는 5를 확인합니다. 0.8 % (1.2 g) 아가로 오스 분말을 추가합니다.
2. (- 3 분 보통 1) 아가까지 간헐적으로 선회 30 초 간격으로 전자 플라스크를 완전히 용해시킨다. 이 과정에서 뜨거운 손 패드를 사용합니다. 소용돌이 치는 동안 폭발적인 비등주의하십시오.
3. 10 분 - 아가로 오스 솔루션은 5 냉각 할 수 있습니다. 참고 : 플라스크의 바닥이 5 초 동안 손바닥에 남아있을 수 있습니다 때 아가로 오스 용액을 주입 할 준비가 될 것입니다.
4. 테이프로 가장자리를 밀봉 위치에 빗 잘 배치하여 전기 주조 트레이 (10 × 15cm)를 준비합니다.
5. t 천천히 아가로 오스 솔루션을 부어그 기포의 형성을 방지하는 트레이를 캐스팅. 피펫 팁을 사용하여 거품을 제거합니다. 냉각 완전히 고체화하는 젤 기다립니다. 응고되면 흡입하여 우물을 붕괴 방지하고 트레이의 가장자리에서 테이프를 제거하기 위해 천천히 빗를 제거합니다.
6. 겔 상자에 아가 로스 젤을 놓고 젤이 완전히 덮여 때까지 1X TAE-0.1 % SDS 버퍼와 전기 장치를 입력합니다.

3. 샘플로드 및 전기 영동 분리

참고 : 우리의 실험실에서, 우리는 일반적으로 기관지 세척액 포함 마우스와 인간 모두에서 샘플을 사용하여 인간 기관지 상피 세포 (HBE), 인간의 타액과 객담 샘플에서 세포 세척액 (BALF 두 종). 시료 수집시 6 M 우레아로 변성 또는 단백질 분해 효소 저해제 칵테일을 첨가하여 시간 (6 시간)의 짧은 시간 동안 저장 될 수있다.

1. 샘플 3 (각각의 샘플에 로딩 염료를 10 % 첨가하여, 즉. 로딩 샘플 준비, 30 μL염료의 μL). 위아래로 피펫 팅에 의해 샘플을 균질화. 간단히 방울을 수집하기 위해 5,0​​00 rpm으로 튜브를 스핀 다운.
2. 조심스럽게 우물에 샘플의 동일한 볼륨을로드합니다.
   1. 사전 젖은 팁 및 / 또는 점성이 높은 샘플의 로딩을 용이하게하기 위해 긍정적 인 변위 피펫을 사용합니다. 천천히 흡인 (80) - 샘플 염료 용액의 90 % (즉, 27-30 μL)를 피펫 거품을 방지 할 수 있습니다.
   2. 천천히 우물의 바닥에로드하고 점진적으로 상향 피펫 팁을 이동합니다. 피펫 팁에 부착 된 상태를 유지 샘플의 경우, 45 ° 각도로 분배 똑바로 잘 이상 연장 또는 부드럽게 실 같은 점액을 깰 잘의 측면을 사용합니다. 우물을 너무 많이 넣지 마십시오.
3. 전기 영동 발전기에 겔 상자에서 전극을 연결합니다. 전극이 제대로 연결되어 있는지 확인 (예., 발전기의 양의 출력에 연결 적색 리드)에 부정적인 허용은 긍정적 인 방향으로 실행하는 뮤신 청구 전극.
4. 두 행 사이의 중복을 방지하기 위해 이중 빗 겔 75 분 - 하나의 빗 겔 90 분, 또는 60 80 볼트에서 젤을 실행합니다.
5. 발전기의 전원을 끄고 전원에서 전극을 분리합니다.
6. 조심스럽게 겔 장소에 남아 있도록 주조 트레이의 양쪽에 한 손으로 겔 상자에서 젤을 제거합니다.

4. 효율적인 점액 전송을 위해 아가로 오스 젤 감소

1. 조심스럽게 유리 용기에 겔 평면 배치. TAE-SDS 버퍼의 흔적을 제거하기 위해 DH ₂ O와 젤을 씻어.
2. DH ₂ O. 800 ㎖ 중에 20 배 SSC 200 ㎖를 첨가하여 4X SSC 완충액 1 리터 준비 4X SSC 완충액 200 ㎖로 신선한 DTT 309 ㎎을 첨가하여 10 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT) 4X SSC 용액 200 mL로.
3. DTT-4 배 SSC 버퍼와 커버 젤을 만끽 해보세요. 조심스럽게 20 분 (분당 10 회전)에 대한 바위. DTT없는 4 배 SSC 버퍼와 젤을 씻어.

"> 5. 니트로 셀룰로오스 막에 블로터 조립 및 샘플 전송을 진공 청소기

1. 전송을 위해 진공 흡착을 준비합니다.
   1. 조심스럽게 겔 (예., 10 × 15cm)보다 약간 더 넓은 차원에서 니트로 셀룰로오스 막 잘라.
   2. DH ₂ O 젖은 다공성 매트 및 흡착 부드러운 사이드 업 놓습니다.
   3. DTT없는 4 배 SSC 버퍼 젖은 니트로 셀룰로오스 막과 다공성 매트의 중앙에 배치합니다.
   4. 정확하게 니트로 셀룰로오스 막과 정렬 가스켓의 개구부를 남겨두고 고무 개스킷 다공성 매트 커버. 다공성 매트가 계속 표시되는 경우, 신중하게 틈 가스켓과 막 사이에 남아 보장하기 위해 멤브레인을 조정합니다.
2. 조심스럽게 막 위에 아가로 오스 겔을 배치합니다. 가스켓에 단단히 밀착 겔의 우물이 전송을위한 막에 위치 겔 형태를 확인합니다.
   1. 막과 젤 사이에 기포의 형성을 피할 것. 을 최소화하도록거품의 형성은 4 배 SSC의 몇 방울은 막에 버퍼 및 형성 거품을 플러시 위에서 아래로 젤을 밀어 물총. 단백질이 즉시 지워 시작할 것 같이 막에 젤을 이동하지 마십시오.
3. 조심스럽게 배 SSC 버퍼와 젤을 커버한다.
4. 흡입에 의해 점액 전송을 시작합니다.
   1. 50 밀리바 - 40 진공 ON 흡착 및 설정 압력을 켭니다. 이 건조 겔을 방지하기 위해 10 분 - 겔상의 모든 5 4X SSC 완충액 몇 방울을 추가한다. 90 분 동안 실행 전송. 옵션 : 완료되면, 방향에 대한 연필로 우물을 표시합니다.
5. 겔 폐기 멤브레인의 가장자리에 플라스틱 핀셋을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막 검색.

6. 막 차단 및 탐지

1. 1X 인산 완충 식염수 (PBS)로 즉시 막을 씻어. 멤브레인은 건조하게하지 마십시오.
2. 소유주에 버퍼와 장소를 차단 3 % 우유 PBS의 50 ㎖로 막 빠져1 시간 동안 실온에서 cker. 배양 후, 블로킹 버퍼를 폐기합니다.
3. 1 % 우유 PBS 차 항체 용액에서 막 빠져. 밤새 4 ℃에서 로커에 차 항체 용액 막을 인큐베이션. 배양 후, 차 항체 용액을 버린다. 블로킹 완충액을 항체 용액 2,000 비율 : 1에 일차 항체를 희석. 주 : 마우스 유래 시료를 위해, 우리는 222 UNC 토끼 항 MUC5B 및 염소 항 - 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용한다. 인간에서 발생하는 샘플을 위해, 우리는 H300 방지 MUC5B 및 45M1 안티 MUC5AC 차 항체를 사용합니다.
4. 로커에 10 분 동안 PBS로 세척 막 3 회.
5. 1 % 우유 PBS 차 항체 용액에서 막 빠져. (. 예를 들어, 700 및 항 - 토끼 항 염소 680)를 차단 완충액에 항체 용액 7500 비 로커에 실온에서 1 시간 동안 배양한다 : 1의 이차 항체를 희석. 불투명 공동으로 배양하여 빛으로부터 보호의 ntainer. 1 시간 후 이차 항체 솔루션을 폐기하십시오.
6. 5 분 동안 PBS로 세척 막 3 회. 소금을 제거하기 위해 DH ₂ O와 멤브레인을 씻어.
7. 제조업체의 지시에 따라 적외선 형광 시스템에서 멤브레인을 읽는다.

결과

우리는 쥐의 폐 (그림 1)에서 폐포 세척액에서 아가로 오스 겔 전기 영동 다음과 같은 점액 표현의 대표적인 결과를 보여줍니다. 이 예에서는 TG-MUC5AC 마우스 모델의 IL-13 처리 다음 뮤신 생산 상향 조절을 보여 아가 로스 겔을 사용 하였다. 웨스턴 블롯 합체 또는 단량체 밴드 신호 강도 (도 2)의 정량 분석에 사용할 수있는 점액 식의 시각적 표현을 ...

토론

이 비디오에 설명 웨스턴 블로 팅 점액의 프로토콜은 단백질 검출을위한 정기적 인 기술, 즉., 면역과, 분리 및 DNA 큰 거대 분자를 전송하는 분자 생물학에서 사용되는 종래의 기술을 결합한다. 동일한 기술은 고 분자량 히알루 론산 ^(18)의 고장과 같은 복잡한 글리코 사 미노 글리 칸의 생물학을 연구하기 위해 적용될 수있다. 이 방법은 분석의 넓은 범위에서 사용할 수 있지만, 성공...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris Base	Sigma	T6060-1kg	1 kg
Glacial Acetic Acid	Sigma	ARK2183-1L	1 L
EDTA	Sigma	EDS-100g	100 g
Glycerol	Fisher	BP229-1	1 L
Bromophenol Blue	Sigma	114391-5g	5 g
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)	Sigma	L6026-50g	50 g
20x SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer	Promega	V4261	1 L
NaCl	Fisher	S271-1	1 kg
Trisodium Citrate (Na3C6H5O7)	Sigma	W302600-1kg	1 kg
10 mM DTT (dithiothreitol)	Sigma	D0632	25 g
Milk Powder	Saco		Instant non-fat dry milk
Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Gibco lifetechnologies	14200-025	500 ml
Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples)	Rockland antibodies and assays	600-101-215	1 mg
UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples)	UNC
H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples)	Santa Cruz	sc-20119	200 μg
45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples)	Abcam	ab3649	100 μg
Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye	LI-COR Biosciences	926-32213	0.5 mg
Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye	LI-COR Biosciences	926-68022	0.5 mg
Electrophoresis Gel Box and Casting Tray	Owl Seperation Systems
Power Supply Box	Biorad	Model 200/20
Membrane Blotting Paper	Amersham	10600016
Whatman Paper and Nitrocellulose membrane	GE	10 439 196
Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230 v	Expotech USA	230600-2
Odyssey Infrared Fluorescence System	LI-COR Biosciences