에탄올에 리그 노 셀룰로즈의 생물에 대한 강력한 펜 토스 발효 효모의 진화를위한 기술

요약

적응 진화와 분리 기술을 설명하고 신속하게 육탄 당과 효소의 오탄당의 혼합 당이 undetoxified 가수 분해물을 당화 및 40g / L의 에탄올을 통해 축적 소비 할 수있는 Scheffersomyces stipitis 변형의 파생 상품 NRRL Y-7124을 얻었다 증명된다.

초록

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

서문

리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 추정 연간 13 억 건조 톤의 에탄올 생산을 지원하고 미국은 30 %의 석유 소비를 줄일 수 있습니다. ¹ 포도당과 자일 로스 풍부한 식물 바이오 매스 가수 분해 수율 설탕 혼합물, 발효 억제제가 필요한 화학적 전처리에 의해 생성되지만 헤미 셀룰로스를 분해 및 효소 공격 셀룰로오스를 노출합니다. 아세트산, 푸르 푸랄, 및 (HMF) hydroxymethylfurfural는 전처리 중에 형성 많은 억제제 중 주요 구성 요소로 생각된다. 전방 목질 에탄올 산업을 이동하기 위해 연구 절차 생존 효율적 필요한 같은 억제 화합물의 존재하에 육탄 당 및 오탄당 당 모두를 사용하는 기능 할 효모의 진화를 허용한다. 이러한 사카 cerevisiae의 전통 산업 효모 균주의 중요한 추가 약점은, 효율적으로 fermen 할 수 없다는 것입니다식물 바이오 매스의 가수 분해물에서 사용할 수있는 자일 로스에서 t.

피 키아 stipitis 형 균주 NRRL Y-7124 (5773 CBS)는 최근 이름을 바꾼 Scheffersomyces의 stipitis는 잘 에탄올에 자일 로스를 발효하는 것으로 알려져 기본 펜 토스 발효 효모이다. ^2,3 여기 추진 된 균주 NRRL Y-7124의 진화가에 문서화되어 있기 때문에 작은 자일리톨 부산물로 40g / L을 초과하는 경제적 복구 에탄올을 축적하는 기본 효모 균주의 가장 큰 잠재력을 가지고있다. ^4,5,6을 최적의 미디어, S.에서 stipitis 균주 NRRL Y-7124은 0.41 ± 0.06 g / g 높은 세포 밀도 문화 (6 g / L 세포)이다. ^{7, 8} 저항의 수율 40 시간 (1.75 g / L / 시간) 70 g /의 L의 에탄올을 생산 발효 억제제 에탄올, 푸르 푸랄 및 HMF에도 ⁹ 및 S.,보고 된 stipitis은 상업적 규모의 에탄올 블라우스 가능한 가장 유망한 기본 펜 토스 발효 효모 중에서 선정되었습니다N 리그 노 셀룰로즈에서. ⁽¹⁰⁾ 우리의 목표는 산업용 애플리케이션에 적합한 균주 NRRL Y-7124의보다 강력한 파생 상품으로 진화를 강제로 다양한 undetoxified 리그 노 셀룰로오스 가수 분해물과 에탄올의 선택 압력을 적용하는 것이 었습니다. 추구 향상된 기능 중 핵심은 농축 된 가수 분해물의 빠른 설탕 흡수 속도,보다 효율적으로 혼합 된 설탕 이용을위한 감소 diauxy, 에탄올 및 억제제의 높은 허용 오차했다. S.의 응용 프로그램 undetoxified 가수 분해물에 stipitis는 overliming 같은 가수 해독 프로세스와 연관된 추가 운영비를 제거하기 위해 연구의 핵심이 있었다.

두 산업 유망 가수 분해물은 진화를 강제로 적용했다 :. (PSGHL)을 당화 암모니아 섬유 확장 전처리 옥수수 여물 가수 분해물 (AFEX CSH)을 효소와 산 - 전처리 지팽이 가수 분해물의 술을 희석 ^{11, 12} AFEX 전처리 기술로 개발되고있다묽은 산 전처리 가장 일반적으로 현재는 낮은 비용 기술을 나타내는 효소 당화위한 바이오 셀룰로오스 노출되도록 실시하면서 발효 억제제의 생산을 최소화한다. PSGHL는 전처리 후 남아있는 셀룰로오스로부터 분리하고 포도당에서 특징적으로 가수 분해 된 헤미셀룰로오스에서 자일 로스 풍부하지만 낮습니다. AFEX의 CSH 및 PSGHL 조성물은 진화 과정을 관리하는 데 이용 된 주요 측면에서 서로 다르다. AFEX CSH PSGHL은 (표 1)에 비해 아미노산 및 암모니아 질소원의 푸란 알데히드 및 아세트산 억제제 낮은하지만 높다. PSGHL는 주된 설탕을 사용할 수있는 자일 로스의 추가 도전을 선물한다. 따라서 PSGHL 특히, 가수 개선 자일 로스 활용 가능 효모의 상업적 사용을 방지 약점을 풍부하게하는 것이 적절하다. 심지어 기본 탄당 발효 효모 사이의 최적 설탕 xylo에 대한 의존도SE는 세포의 성장을 지원하기 위해 수리 더욱 도전 때문에 다양한 이유의 가수가된다 :. 의한 환원 불균형 대사 구조적 무결성 및 중단 셀 대폭 손상 될 영양소 결핍 억제제 ⁹ 질소 보충 특히 형태 아미노산은 발효의 중요한 운영 비용을 나타낼 수있다. 분리 선별 및 순위에 질소 보충의 영향은 지팽이 가수로 탐구했다.

향상된 개인은 S.의 자연적인 유전 적 다양성에 의존 다중 선택 압력을 사용하여 진화 인구 풍부한했다 이 다양한 가수 분해물, 에탄올 또는 UV 방사선에 노출에 의해 유도 stipitis 인구와 돌연변이. 선택 압력은 S.의 진화 과정을 탐구하는 병렬 및 직렬 적용되었다 성장하고 가수 분해물에 효율적으로 발효 할 수 원하는 파생 상품으로 stipitis(그림 1). 점점 도전 가수 분해물의 기능성 인구의 반복 배양이 중 12 % 글루칸 AFEX의 CSH의 희석 시리즈를 사용하거나 다른 PGSHL 20 % 고체로드에서 제조 된 마이크로 플레이트에서 수행 하였다. 연속 배양에서 자일 로스에 에탄올 도전 성장의 응용 프로그램은 더 자일 로스 활용의 억압을 에탄올 적은 감수성을 보여주는 표현형에 대한 풍부하여 AFEX의 CSH 적용 인구를 개선. 후자의 기능은 최근에 포도당 발효 다음 균주 NRRL Y-7124에 의해 펜 토스 이용에 문제가 나타났다. PSGHL ⁸ 농축 다음 가수 분해물 기능을 확대 탐구했다.

S.의 추정 개선 파생 상품 stipitis NRRL Y-7124은 가장 일반적인 개체군에서 콜로니를 선택하는 응력 조건으로 희석 도금하에 농축하여 표적 진화 과정의 각 단계에서 분리 하였다. 차원 상대성능 지수 (RPI가)의 반응 속도가 적용된 다른 가수 분해물 형태와 영양 보충제 평가 하였다 전반적인 성능에 기초하여 변형을 평가하기 위해 사용되었다. 다양한 적응 절차의 성공은 S.의 기능을 향상시킬 수 있지만 리그 노 셀룰로오스 가수 분해물의 stipitis 이전 undetoxified 가수 분해물에 경제적 인 에탄올 생산을 보여주는 균주는 이전에보고되지 않은 문서화되어있다. ^13-17 진화 절차를 사용하여 여기보다 상세하게 시각화 할, Slininger 등. ^(18)는 크게 이상 향상 균주 개발 모 균주 NRRL Y-7124 및 AFEX의 CSH에> 40g / L의 에탄올을 생산하고 적절 질소원 보충 당화 지팽이 분해물 (SGH)를 효소 수있다. 이 새로운 균주는 에탄올 산업 개발 리그 노 셀룰로즈 향후 관심을 추가 유전체학 연구 건물의 과목과 같습니다이전 염기 서열을 변형 NRRL Y-11545의 사람들에. ¹⁹ 균주 개량 연구를 촉진하기위한 전주곡으로 개발하는 동안 발생 유전 적 변화의 역사를 규명 할 그림 1에 도식화 진화의 여러 단계에서 생산 된 최고 균주의 게놈 연구.

프로토콜

1. 분석 실험 장비 및 재료 시작 준비

1. 진화, 분리에 사용 및 순위 절차에 대한 전처리 반응에 18 ~ 20 % 초기 바이오 매스 건조 중량을 사용하여 가수를 준비합니다. Slininger 등. 자세한 방법 2015 ^{18 진화,} 격리 또는 순위에 사용되는 질소 보충 N1 또는 N2와 AFEX CSH, PSGHL 및 SGH 준비를 참조하십시오. 각 가수 분해물 유형의 구성은 표 1을 참조하십시오.
   참고 : 요소, 비타민이없는 아미노산을 포함하여 질소 소스와 : 질소 비율 (N C) 1 몰 탄소 : SGH-N1 = SGH 42에 강화 다음과 같이 SGH의 질소 요새는 정의 SGH-N1 또는 SGH-N2로 지정되었다 정의 출처 카제인, D, L- 트립토판, L- 시스테인, 비타민의 지방산 (예 ~ 몰 질소 N의 15 % 차 아미노기 질소 (PAN) 및인지 ~ N의 85 % 우레아로부터 임); 1 C : SGH-N2 = SGH 37에 강화 N 요소 및 최저 비용 상용 소스 오 등의 대두와 함께F 아미노산 및 비타민 ~ PAN에서 N의 12 % 및 우레아 88 %를 제공한다.
2. 지시에 따라 모 균주의 동결 건조 문화를 획득, Scheffersomyces stipitis NRRL ARS의 문화 컬렉션에서 Y-7124 (5773 CBS) (농업 활용 연구를위한 국립 센터, 피오리아, 일리노이), 및 글리세롤 재고 문화를 준비합니다. 재고의 부모 효모의 문화와 -80 ° C에서 10 % 글리세롤에 그 유도체를 유지한다.
   1. 판 한천 효모 맥아 펩톤 덱 스트로스 (YM)에 킬 글리세롤 주식 (3g / L 효모 추출물, 3g / L 맥아 추출물, 5g / L 펩톤, 10g / L의 포도당, 20g / L의 한천) 및 부화 48 25 ° C. ⁸ 개발 판에서 72 시간 4 ° C에서 주일까지 저장할 수있는 등 전 배양액의 접종을 사용하기 전에.
3. 준비 최적의 중간 (ODM) 이전에 부모 STR에 의해 에탄올에 자일 로스의 최적의 변환을 위해 개발 된 산업 제제 절차 ^(20)와 호환 합성 매체를 정의아인 Scheffersomyces (피 키아)는 NRRL Y-7124. ^7을 사용하여 발효 성능 생물 검정에 대한 모든 precultures과 문화의 정의 매체 또한 에탄올에 대한 도전, 자일 로스 - 공급 연속 문화 발전을 stipitis. ODM 조성물은 표 2 참조 용으로 나열됩니다.
4. 전술 한 바와 ^{같이,도 18} 내지 620 (A _(620))에서 배양 흡광도를 측정하기 위해, 적절한 같이 cuvette- 또는 마이크로 플레이트 판독 분광계를 사용하여 세포의 바이오 매스를 분석한다. 당류, 에탄올, 푸르 푸랄, hydroxymethylfurfural (HMF) 높은 처리량을 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 또는 포도당 로봇 효소 결정 및 자일 로스를 이용한 배양 샘플 아세트산 정량.

2. AFEX CSH에 직렬 전송시 강력한 파생 상품을 풍성

1. 변형 NRRL Y-7124의 예비 배양을 접종한다. 75 ml의 ODM + 150g / L의 자일 로스로 YM 한천에서 전송 세포 O 하에서 성장할 수있는 능력을 유지할smotic 스트레스. 실리콘 스폰지 폐쇄 125 ml의 플라스크에 precultures이 (150 rpm으로, 1 "궤도)을 흔들어 25 ° C에서 24 시간 플러그 품어.
2. 사용을위한 차가운 물에 6~12% 글루칸 AFEX의 CSH의 해동 냉동 분취. 필요한 경우 5의 pH를 조정하고 필터에 희석 시리즈 준비 96 웰 마이크로 이전에 소독.
3. (620 ㎚) ₆₂₀ ≥0.1 초기 흡수 할 수 있도록 잘 당 예비 배양의 몇 마이크로 리터로 접종 한 후, 잘 당 50 μL 및 가수 분해물 희석 당 8 웰과 마이크로 입력합니다. 습도 젖은 종이 타월로 플라스틱 상자에 25 ° C에서 정적으로 24 ~ 48 시간 번호판을 품어.
4. 초기 ₆₂₀ ≥0.1을 달성하기 위해 눈에 띄게 새로운 가수 분해물 희석 시리즈의 각 웰에 _620> 1, 전송 1-5 μL에 성장 곳 가수 분해물 희석 사용.
5. 분광 광도계와 함께 성장 문화에게 마이크로 _{620을 모니터링합니다.} uninoculated 희석 시리즈 버리는제어 및 빈으로 보이는 군. 플레이트 뚜껑은 오염을 방지하기 위해 모니터링 중에 왼쪽 및 판독 따라 조정됩니다.
6. 정기적으로 개선 된 균주의 후속 분리 또는 지속적인 가수 분해물 희석 시리즈를 reinoculating에 사용하기 위해 적응 문화의 글리세롤 주식을 준비합니다. 수영장, 식민지 최고의 가수 분해물 농도의 네 우물 (200 μl를) 주식을 준비합니다. -80 ° C에서 10 % 글리세롤에서 세포를 동결, 크리오 바이알 (cryovial) 20 % 멸균 글리세롤 1 : 1 혼합.
7. 12 % 글루칸 AFEX의 CSH의 성장이 24 시간에서 일관되게 보일 때까지 반복 2.3-2.6 단계를 반복합니다.

AFEX CSH에 농축 한 후 3. 격리 단일 셀은 관대 한 파생 상품

1. YM 한천에 적응 문화 및 사용 줄무늬의 행진 선택 글리세롤 주식은 세 개의 마이크로 웰 (A ₍₆₂₀₎ ~ 0.1 초기)의 각각 3 % 또는 6 % AFEX CSH 글루칸 (pH를 5) 50 μl를 접종한다. 단계 2.3에서와 같이 24 시간 마이크로 플레이트 품어. 풀 복제테는 강한 성장 및 희석 판 YM하거나 6 % 글루칸 AFEX의 CSH 한천로 최고의 가수 분해물 강도에 우물을 식민지. 필터의 1 혼합 따뜻한 멸균 30g / L의 한천 용액을 12 % 글루칸 AFEX의 CSH를 멸균 : 1과 같이 후자를 준비합니다.
2. 글리세롤 재고 문화로 동결 25 ° C에서 24 ~ 48 시간 배양 후 가장 높은 희석 판 보여주는 성장 5 단일 식민지를 선택합니다. 질주 YM 판에 각 식민지. 24 시간을 품어. 멸균 루프, 10 % 글리세롤의 작은 볼륨으로 세포의 개발을 연속 전송 세포를 일시 중단 혼합하고, -80 ° C에서 동결 2-3 크리오 바이알 (cryovial)에 배포 할 수 있습니다.

4. 부모에 비해 AFEX CSH 관대 한 파생 상품의 성능 평가

1. 테스트는 간단한 6 % 글루칸 AFEX CSH 일괄 문화에서 분리합니다.
   1. 48 시간 판에서 전송 세포를 ₆₂₀ = (10)를 사용하여 1 μl를 세포 현탁액을 준비하는 pH가 7 인산 칼륨 완충액 (0.4 밀리미터)에 글리세롤 주식에서 줄무늬각 현탁액 ₆₂₀ = 0.2 초기 50 ㎕의 3 % 글루칸 가수 네 각 웰에 접종한다. 단계 2.3에서와 같이 24 시간 마이크로 플레이트 품어. 멸균 수로 3 : 12 % 글루칸 AFEX의 CSH 1을 희석하여 pH를 5에서 3 % 글루칸 AFEX의 CSH를 준비합니다.
   2. 전송이 24 시간 마이크로 웰은 전체 강도의 50 %에서 사용 pH를 5 12 % 글루칸 AFEX의 CSH의 25 ml의 precultures을 접종합니다. . ~ 25 ° C에서 150 rpm으로 (1 "궤도)을 24 시간 동안 실리콘 스폰지 폐쇄와 50 ㎖ 플라스크에 precultures을 품어 가수 분해물 1 희석하여 글루칸 AFEX의 CSH 반 강도에게 12 %를 준비 : 멸균 물 1.
   3. ₆₂₀ = 0.1 초기와 유사한 25 ml의 성장 문화를 접종 반 강도 가수 분해물 precultures를 사용합니다. (4.1.2) 위와 같이 성장 문화를 품어 매일 (0.2 ㎖) 샘플. 모니터 바이오 매스의 축적 (A _620)와 설탕과 발효 제품 (HPLC)의 농도.
2. 또한, repitch (즉, 수확 및 Reuse) 8 % 글루칸 가수 분해물 배치 문화 테스트를 위해 6 % 글루칸 AFEX의 CSH 성장 효모의 인구, 전술 한 바와 같이. ⁽¹⁸⁾
3. 또한, 전술 한 바와 같이, 12 % 글루칸 가수와 공급에 의해 repitched 6 % 글루칸 AFEX의 CSH 문화의 추가 테스트 인구. ⁽¹⁸⁾
4. 혼합 설탕과 ODM의 배치 문화 균주의 diauxic 지연을 테스트합니다.
   1. YM 글리세롤 줄무늬에서 루프 전달에 의해 실리콘 스폰지 폐쇄와 125 ml의 플라스크에 150g / L의의 자일 로스 75 ML의 ODM의 precultures 접종. 단계 2.1에서와 같이 24 시간을 품어.
   2. ODM은 pH가 6.5에서 75g / L 포도당과 75g / 자일 로스의 L를 포함와 비슷한 75 ml의 시험 문화를 접종 precultures를 사용합니다. 25 ° C, 150 rpm에서 플라스크를 흔들어. 매일 샘플.
   3. 초기 pH를 pH가 6-7 뒤 유지하는 테스트 배양 물에서 6.0 ± 0.2로 설정된 것을 제외하고 선택적으로, 유사한 프로토콜을 사용하여 글루코스 및 크실 로스의 발효 동안 diauxy에서 0~15g / 리터 아세트산의 영향을 테스트전술 한 바와 같이, 아세트산 소비 반지. ¹⁸

5. 에탄올 도전 크 실리 톨 이용을 위해 선택하는 연속 문화를 적용

1. pH가 6.3 ± 0.2에서 60~100g / L의의 자일 로스, 20~50g / L의 에탄올로 연속 배양 공급 매체로 ODM를 준비합니다. ~ 0.5 g을 에탄올 / g 자일 로스의 전위 수율을 가정하여 150 g / 리터 크실 로스의 부분 발효 시뮬레이션 자일 로스 및 에탄올의 조합을 선택하고, 50 내지 70 g / L의 발생 에탄올 가능성을 수용 할 수 있습니다. ⁽⁸⁾
2. 연속 배양 접종을 준비하려면, 에탄올없는 ODM (100g / L의 자일 로스의 75 ml의 48 시간의 YM 판에서 AFEX CSH 허용 식민지 (콜로니 5 유사한 예에서, 그림 1) 루프에 의해 대표를 전송, 125 ml의 플라스크이 경우)이다. 24 시간 동안 25 ° C, 150 rpm으로 (1 "궤도)에 품어. 초기 연속 배양 들고 볼륨의 일치하도록 예비 배양 ODM의 자일 로스 농도를 선택합니다.
3. 와 pH에서 ODM의 연속 문화 잡고 볼륨을 접종 6.3 ± 0.2 갖는 100g / L의 자일 로스 + 20g /의 L의 에탄올 ~ 식민지 5, 그림 1에 AFEX CSH 허용 분리의 예비 배양 농축액의 5 ~ 10 ㎖ (유사 ) 초기 ₆₂₀ ~ 0.5 100 ㎖을 얻었다. 쟈켓 100 ㎖ 스피너 플라스크를 200 rpm으로 교반하고, pH를 멸균 전극의 pH 컨트롤러 및 온도 조절 순환 수조 복 25 ° C에서 배양 유지 체적 (V _R)을 유지한다.
4. 세포 성장으로 인해 에탄올 노출 느려질 수 있기 때문에 초기에, pH가-작동 펌프를 사용하여 투여 량에 공급 매체를 설정합니다. 문화 발효 따라서 추가의 pH 강하를 중지, 5.4 pH를 떨어질 때 100g / L의 자일 로스 및 50g / L의 에탄올로 pH-6.3 ODM를 공급하는 펌프를 설정합니다. 유출 물 펌프가 지속적으로 문화면을 감추고과 100 ㎖의 볼륨을 유지한다. 따라서, 에탄올 농도는 계속 신진 대사와 먹이로 상승한다.
5. 유출 측정하고 전술 한 바와 같이, 가능한 세포 농도, 제품 및 기판의 분석을 위해 지속적인 문화에서 매일 48 ~ 72 시간을 샘플 (1-2 ml)에 그립니다. ¹⁸ 가능한 세포 농도를 찾으려면에서 샘플의 일련 1시 10분 희석을 버퍼 (4.1.1 참조) 및 확산 판 YM 한천로 희석은 (1.2.1 참조). 폐기물 수집 속도 (Q)에 기초하여, S.의 예에서, 희석 비율 (D) (Q / _{R V)를} 계산하고, stipitis, 그것은 0에서 0.01 시간에 변화 ^-1.
6. 농축에 그 당시 가장 널리 강력한 식민지를 나타내는, 30-100 식민지를 형성 버퍼 샘플 희석의 가능성 판에서 분리 정기적으로 글리세롤 주식을 저장합니다. 10 % 글리세롤 ~ 5 ml의와 홍수 판은 중복 크리오 바이알 (cryovial)의 준비를 할 수 있습니다. 유지 보수 또는 유예의 경우, 연속 배양을 중지하고 대부분의 전류 (저항) 글리세롤 재고 (들)를 사용하여 필요에 따라 다시 시작합니다.
7. 대부분의 행진 글리세롤 재고 (들)을 다시 시작하려면YM 한천에 강한 집단과는 상기 배양 에탄올없는 ODM의 사전 문화 루프에 의해 24 ~ 48 시간 세포를 전송합니다. 예비 배양 효모의 농축 물을 사용하는 ₆₂₀ 0.5 초기에 ODM의 볼륨을 들고 100 ㎖를 접종하고, 공급 매체의 흐름이 다시 시작되기 전에 문화가 배치 식 고정 단계로 성장 할 수 있습니다.
8. 문화> 25g /의 L 에탄올의 존재 자일 로스에 지속적> 0.01 시간 ^-1에서 성장할 수 있다면, 저에 (30~50g / L에 이르기까지 ODM + 60g / L의 자일 로스 + 에탄올) 연속 배양 공급을 시작 희석 비율 ~ 0.01 시간 ^-1 볼륨 (처음 ODM + 60g / L의의 자일 로스 + 20g / L의 에탄올)을 들고 100 ㎖에. 시간이 지남에, 50g / L을 향해 피드의 에탄올을 올립니다. 글리세롤 주식에 고급 인구를 캡처합니다.
   주 : 저 희석 비율을 유지하는 것이 가능하고, 산소지지 발효를 줄이기 위해 충분히 높은 세포 농도의 형성을 허용한다.
9. 선택적 irradiat 자외선 (UV)을 적용이온 월 연속 문화를 reinoculate하는 데 사용되는 재고 인구를 글리세롤합니다.
   1. 60g / L의 자일 로스, 단일 무균 플라스크에 모든 주식을 풀 (precultures에서와 같이) ODM 10ml에 글리세롤 재고 줄무늬에서 재현 탁 식민지. 단지 6 ㎖ / 플레이트 4-5 페트리 접시의 바닥을 다루 ~ 5 × 10 ⁸ 실행 가능한 세포 / ml에서 풀링 된 세포 현탁액을 적용합니다. 표준 일회용 페트리 접시의 6 ml의 범위를 얻기 표면 장력을 극복하기 위해 15 ml에 분배 한 다음 9 ml를 제거하십시오.
   2. 생물 안전 캐비닛의 광원으로부터 UV 각각 열린 문화 판을 노출. 바람직한 킬 율> 90 %를 얻기 위해 UV 노출 시간 또는 간격을 조정한다. 여기서, 광원으로부터 약 56cm에서 45 분 동안 노출.
   3. 전 조사 후 접시에 세포 현탁액을 희석. 예상 죽일 속도 콜로니 형성 단위를 기준으로. S. 들어 예를 stipitis, 킬 (kill) 속도는 ~ 97 %였다.
   4. 박편 COV로 UV 노광 배양 (24-30 ml)로 전송50 ㎖ 플라스크를 겹으로하고, 생존 세포의 작은 비율 ~ 1 × ⁸ 가능한 S.에 다시 채울 수 있도록 25 ° C에서 24 시간 동안 150 rpm으로 배양 세포 / ml를 stipitis. 배양은 배양 동안 포토 재 활성화를 방지하여, 호일 커버 돌연변이를 보존한다.
   5. ~ 1 × 10 ⁷ 가능한 세포 / ml의 연속 문화를 접종하기 위해 다시 채워 돌연변이 문화를 사용합니다. 선택 과정을 계속 에탄올 농축 ODM + 60g / L 자일 로스 매체 피드를 다시 시작합니다.

6. 글리세롤 주식 인구를 평가하고 에탄올의 존재에 개선 크 실리 톨 발효와 함께 그 식별

1. 킬 에탄올의 존재하에 자일 로스, 최고의 성장 및 발효 화면의 첫 번째 단계로서 YM 한천 글리세롤 스톡 문화를 선택했다.
2. 각각의 진화 인구 이동하는 150g / L 포도당과 ODM에 75 ML의 precultures에 한천 줄무늬에서 상영, 125 ml의 플라스크 (96)에 부화한다이전 시간 테스트 문화에 대한 접종으로 사용할 수 있습니다. 큰 포도당 성장 인구는 자일 로스 활용을위한 효소의 유도가 필요합니다.
   1. 60g / L의 자일 로스 + 30~45g / L의 에탄올 ODM 40의 _{620 초기,} 25 ° C에서 품어, 30 ml의 세포를 일시 중지, 각각의 문화를 수확, 유도을 테스트하려면, 150 RPM (1 "궤도) 실리콘 스폰지 폐쇄와 50 ㎖ 플라스크에. HPLC 분석에 의해 자일 로스 흡수를 모니터링하기 위해 매일 두 번 샘플을 그립니다.
3. Slininger에 기재된 바와 같이 선택적으로, 등., ^18, 에탄올의 존재하에 자일 로스의 증가를 평가 125 ㎖의 플라스크에 150g / L의 자일 로스와 ODM 75 ml의 루프 전달 각 진화 인구 precultures을 준비하고, 96 부화 25 ° C, 150 rpm으로 (1 "궤도)에서 시간. 125 ml의 플라스크에 ODM + 60g의 /의 L 자일 로스 + 30~45g / L의 에탄올 25 ㎖에 0.1의 낮은 초기 _620에 시험 문화를 접종한다. 품어을 25 ° C에서 플라스크, 300 rpm으로, 1 "궤도 및 샘플.

(7)에게. 에탄올이 존재하는 경우 PSGHL에 크 실리 톨을 활용하여 단일 세포 콜로니를 분리

1. 6 단계의 결과를 바탕으로,에 성장과 에탄올의 존재 자일 로스를 발효하는 뛰어난 능력을 보여주는 글리세롤 재고 인구를 선택합니다. 줄무늬 판에 다음을 사용합니다. 줄무늬 판은 그 후 세포 현탁액은 ₆₂₀ = 0.5로 96 깊은 웰 플레이트에서 precultures을 접종하는 데 사용되는 ₆₂₀ = (5)의 밀도, 버퍼링 된 세포 현탁액을 준비하는 데 사용됩니다. ODM + 50g / L의 자일 로스 (아무 에탄올)과 1 : PSGHL에 1 ml의 precultures 1 혼합 접종. 빈 우물 96 웰, 배출 낮은 증발 깊은 웰 플레이트는 25 ° C에서 48 시간, 400 rpm으로, 1 "궤도에 대해 설명합니다. 별도의 다른 글리세롤 재고 인구에 precultures을 품어.
2. 1 PSGHL : 20 ODM + 50g /의 L의 자일 로스, 30, 또는 허용 식민지를 풍부하게 40g / L의 에탄올 각 예비 배양를 사용 십육 1 ml의 문화가 ₍₆₂₀₎ ~ 0.5 (1)에서 초기에 복제 접종. 농축 cultu을 품어precultures 유사 입술.
3. 각각 다른 글리세롤 주식에 대한 가장 높은 에탄올 농도가 성장과 자일 로스 사용을 허용와 문화 우물을 수확. 글리세롤에 보존하기 위해 널리 단일 콜로니를 얻기 위해 YM 한천 각 세포주 플레이트. 글리세롤 재고 준비에 대한 YM 한천 플레이트에 세포 라인과 행진 각 당 열 식민지를 선택합니다.

8. 또한 AFEX CSH에 관해서는, PSGHL에 직렬 전송시 강력한 진화 균주를 풍성

1. NRRL Y-7124 (부모)의 사전 문화를 준비 AFEX CSH 허용은 분리 발전, 지속적인 문화는 에탄올의 존재 자일 로스를 사용하는 향상된 능력을 가진 인구 진화. AFEX CSH 가수 분해물 적응 프로세스 (2.1 단계) 전술 한 바와 같이 글리세롤 재고 줄무늬에서 루프에 의해 ODM + 150g / L 자일 로스의 75 ml에 접종한다.
2. 증가하는 농도를 제공하는 일련 물로 희석 PSGHL. 각을 사용하여 세 개의 세포주를 각 96 웰 마이크로 플레이트를 준비PSGHL 희석은 50 μL와 8 우물을 채우기 위해. ₆₂₀ ~ 0.1-0.5 최초 희석 시리즈의 각 50 μL 마이크로 문화를 접종하는 예비 배양을 사용합니다.
   1. 배양 Δtime 당 ΔA ₆₂₀ 안정적 14-D의 평균 비율로 전체 강도 분해물 성장할 수있을 때까지 상기 (단계 2) 상술 된 AFEX CSH 가수 적응과 동일한 방법을 사용 PSGHL의 강도를 증가시키는 효모의 발전 계속 시리얼 전송이 추가 사개월 계속된다.

또는 에탄올에 도전하지 않고 PSGHL 그라디언트를 사용하여 9 격리 단일 세포 콜로니

1. 단일 셀 YM 한천에 희석 도금에 의해 전체 강도 PSGHL 최종 적응 판에서 직접 분리 얻습니다. 이전에 (단계 3.2)에 설명 된대로 글리세롤 주식을 준비하기 위해 YM 판에 세 개의 세포주 및 바 행진의 각 열 많은 식민지를 선택합니다.
2. 선택적으로의 이전 시점을 탐색세 개의 세포주의 저장 글리세롤 주식에서 분리하여 진화 과정.
   1. 글리세롤 재고 줄무늬에서 루프하여 각 세포주에 대한 예비 배양을 접종하고 30 ml의 ODM + 50g / L의 자일 로스에 24 시간 (50 ㎖ 플라스크, 25 ° C, 150 rpm으로)을 품어.
   2. 초기 ₆₂₀ ~ 0.2 마이크로 웰의 50 % PSGHL의 50 μl를 접종하고 정적으로 48 시간 배양하여 가수 분해물의 성장에 precultures에서 도전 세포.
   3. (전달 ~ 접시 당 300-400 생세포) 0-50% 강도 분해물 징 PSGHL 그라데이션 아가 플레이트 상에 각각 농후 배양 0.1 ㎖에 분산하고, 경사 가능한 최고 분해물 농도 영역으로부터 세포주 당 10 단일 콜로니를 골라 . ²¹ 킬 단계 3.2에서와 같이 글리세롤 재고의 준비를 위해 YM에 식민지를 들었다.
   4. 대신 구배 아가 플레이트를 접종, 9.2.3 단계에 대한 대안으로서, ₆₂₀ ~ 0.2 최초 96 웰 마이크로 플레이트의 웰에 접종 갔지웰을 10 ~ 40g / L, 50 % 농도의 에탄올과 100에서 가수 농도 범위를 포함하도록 재 설계된다. 이 경우, 단계 2.3에서와 달리 마이크로 플레이트를 72-96 시간을 개발하고. 희석 도금을 통해 성장을 보이고 가혹한 가수 분해물 - 에탄올 조합의 우물에서 열 단일 콜로니를 분리하고, 단계 3.2에서와 같이 글리세롤 주식을 준비합니다.

초등 화면 10. 두 영양소 조건에서 PSGHL에 공연을 비교하고 순위에 의해 열등한 분리 된 균주를 제거

1. 컨트롤이 여섯 정상 균주를 선택하도록 서른의 화면으로 PSGHL 성능의 높은 처리량 깊은 우물 판 화면을 적용 다섯 세트는 NRRL Y-7124 부모와 (그림 1 진화의 예 식민지 5와 유사) AFEX CSH 허용 분리와 함께 분리 각 세트 (20 %)은 차 심사 레벨 (12 단계)에 전달합니다.
2. 물론 당 1 ml의 작성 및 Wi 덮여 깊은 웰 플레이트에서 화면을 수행검은 색 실리콘 낮은 증발 씰 번째 스테인레스 스틸 뚜껑. 인큐베이터 / 통의 보드에 모든 판을 고정하고 25 ° C, 400 rpm으로 (1 "쉐이커 궤도)에서 운영하고 있습니다. 디자인은 모든 깊은 우물 열린 우물에 의해 다른 균주의 분리를 허용하는 패턴을 작성 접시.
3. 배양에서 시작하려면 (30)로부터 제조 된 글리세롤 줄무늬에서 세포의 비드를 선택하는 것은 상기와 같이 얻어진 균주 ODM + 50g / L의 자일 로스의 우물을 복제하고 48 시간을 배양하기 (단계 3, 7, 9).
4. ODM + 10g / L 포도당 + 50g / L의 자일 로스와 1 : 균주를 preculturing에 대한 도전 매체로서, PSGHL 1을 혼합하여 50 % PSGHL을 준비합니다. (30)에서 분리 된 두 개의 제어 계통, 16 균주의 각 당이 우물 2 판을 스크리닝 다른 균주 사이에 빈 우물을 떠나 채워집니다.
5. 도전 문화, 전송의 경우, 분리 된 각이 50 % PSGHL 도전 문화 우물의 각 ODM의 사전 문화의 50 μL 볼륨 (A ₆₂₀ ~ 10)과는 initi를 얻기 위해 제어알 ₆₂₀ ~ 0.5 72 시간을 배양한다.
6. 심사는 분리에 대해 서로 다른 영양 풍요 로움의 두 개의 테스트 미디어를 사용하여 60 % PSGHL + ODM 영양분을; 75 % PSGHL + ODM + YM 영양소합니다. ODM은 50g / L 설탕 (단계 1.3)와 함께 사용하기위한 표준으로 강도의 절반 (설탕 제외) ODM의 영양소를 추가합니다. 지정된 바와 같이, 3g / L의 효모 추출물, 3g / L 맥아 추출물, 5g / L 펩톤의 표준 강도의 절반 (설탕 제외) YM 영양소를 추가합니다.
7. 이 테스트 매체의 각각에 대해 오 깊은 우물에서 ₆₂₀ ~ 0.5 초기 1,000 μl를 접종 72 시간 50 % PSGHL 도전 사전 문화의 50 μl를 전송하여 시험 문화를 접종.
8. 각 매일 격리 샘플. 에탄올, 글루코스 고 처리량 분석 크실 로스 용 상청액을 수득하는 미세 원심 분리 튜브에서 원심 분리 (5,533 × g으로 15 분)에 웰의 내용물을 피펫. 분광 광도계와 _620에서 96 웰 마이크로 플레이트 (200 μL / 웰)와 같은 바이오 매스를 측정한다.
9. (30)의 각 세트는 내olates (S. stipitis NRRL Y-7124 5 세트 균주를 발전) 단계 아래 (11)에 설명 된대로 상대 성능 지수 (RPI)를 계산하고 에탄올 수율 (공급 초기 설탕 당 누적 최대 에탄올)에 따라 각 변형 순위를 사용하여 테스트 자일 로스 흡수 속도 모두 테스트 미디어 (초기 96 시간 당 소비 자일 로스 농도).

11. 순위는 상대 성능 지수 (RPI)를 사용하여 기본 PSGHL 화면에서 격리 된 것

1. 차 심사 후, 화면에 두 개의 서로 다른 실험 당 영양소 제제, 즉, 60 % PSGHL 75 % PSGHL와 PSGHL에 격리하는 (30)는 다섯 가지 실험을 각각 분리 평가하기 위해 차원의 상대 성능 지수 (RPI)를 계산한다.
2. F = (XX의 _평균) / S : 주어진 실험에서 시험 균주의 그룹 내에서 분리 성능을 순위에 사용하기 위해 통계 매개 변수 F를 계산합니다. 여기서, X는 성능 파라미터는 수율이다 (Y)X의 _평균과의 각각의 평균 및 표준 편차 동안 X 모두가 주어진 실험 내에서 분리 관찰 또는 레이트 (R)는, 각각의 분리에 대해 관찰했다. 정규 분포를 들어, -2
3. 각 실험에서 분리를 들어, 4분의 100 × 속도에 따라 상대적으로 성능, RPI _R이 = (2 + F _R)을 계산하고, 유사 수율에 따라 상대 수익률을 계산, RPI _Y는 = (2 + F _Y) × 4분의 100 . RPI의 값 (가장 높은 최저) ~ 0에서 100 퍼센트의 범위. 각각의 주어진 가수 분해물 실험에서 분리를 위해 다음과 같이 RPI 평균을 계산 : 수율 및 속도 기여는이 응용 프로그램에 동일한 가중치를 부여 RPI의 _평균 = (RPI _Y + RPI _R) / 2.
   중요성이 동일하지 않은 것으로 간주되는 경우에는 일반적으로 그주의, 수율 및 속도 매개 변수를 가중 될 수있다.
4. _전체 테스트 가수 분해물의 N 유형에서 RPI를 계산 : RPI를 _전체 = Σ _{I = 1 N} [(RPI RPI _Y + _R) / _{2]의 I} / N. 각각 30 균주 2 제어의 실험 장치에서 분리 고려하십시오. ~ 150 단일 식민지의 차 순위 동안 자일 로스 풍부한하는 PSGHL 적응 균주, _전체 화면에 적용이 PSGHL 제제에 걸쳐 요금과 수율에 대해 계산 된 RPI 즉, 60 % PSGHL 75 % PSGHL, 여기서 n = 2.
5. _전체 각 실험에서 RPI를 바탕으로, 보조 화면으로 전달하는 균주의 최고 비율을 선택합니다. 이 예에서, 균주의 상부 20 % (즉, 150 (30)가 테스트)를 통과하도록 선택된다.

보조 화면 12. 최고 기능 강력한 균주를 나타 내기 위해 여러 완료 가수 분해물 (> 100g의 /의 L 혼합 설탕)에 최고 기본 화면 공연을 비교

1. 6 %에 질소, SGH-N1과 SGH-N2 (구성의 두 가지 수준으로 개정 글루칸 AFEX의 CSH 및 SGH를 최고 PSGHL 공연을 비교최종 순위 표 1)에서와 같이들. PSGHL의 기본 깊은 우물 판 화면에서 최상위했던 30 균주를 화면 식민지 5, 그림 1 예와 유사하고, 두 컨트롤 (모 균주 NRRL Y-7124과 AFEX CSH 허용 분리 ((10, 11 단계) ).
2. 이전 1 ML의 ODM + 50g / L의 자일 로스의 깊은 우물을 복제하고 깊은 웰 플레이트 시스템 (단계 10.2)에서 48 시간을 배양 글리세롤 줄무늬에서 세포의 비드를 선택하여 배양에서 시작. 그런 다음) ~ 10에서 _620을 얻기 위해 72 시간 동안 깊은 웰 플레이트 시스템에서 50 % SGH 도전 문화에 ODM의 precultures의 50 μl를 전송하고 품어. 무설탕 ODM + 50g / L의 자일 로스 (PH 5.6)으로 1 : SGH 1을 혼합하여 50 % SGH을 준비합니다.
3. 균주의 각각에 대해 초기 테스트 문화 ~ 2.0 _(620)을 수득 도전 문화의 세 우물에서 세포 펠렛 (15 분, 2711 XG)와 SGH-N1 또는 SGH-N2의 16 ml를 나누어 접종. 25 & #에서 테스트 문화를 품다176;. C 실리콘 스폰지 폐쇄 25 ml의 플라스크에, 180 rpm으로 (1 "궤도) 매일 샘플 플라스크는 PSGHL 화면에 따라 분석 할 수 있습니다.
4. 마찬가지로, 스크린 단계 12.2 및 12.3로 분리되지만 도전 배지 테스트 배양액 제조에 사용하기위한 pH를 5.2에서 6 % 글루칸 AFEX의 CSH 이번에 대체 SGH-N1 및 SGH-N2. 충분한 질소 개정하지 않고 있기 때문에 물을 1 : 50 % 강도의 도전 문화를 들면, 1 희석 6 % AFEX의 CSH를 사용합니다.
5. 반복 결과를 중복 12.1-12.4 단계를 반복합니다.

13. 순위 _전체 다중 완료 가수 분해물의 비율 사용에 RPI를 사용하여 보조 화면의 균주 연주 (Performance)

1. 분리의 상위 20 %를 각각 평가하기 위해 상대 성능 지수 (RPI)를 계산한다 (30 ~ 150)의 개 효소의 보조 화면에서 테스트 한 기본 화면에서 영양 풍부한 변화의 가수 분해물 제제를 당화.
2. 점수 각세 효소 당화 예비 분해물 제형 수행 크실 로스 흡수율 에탄올 수율에 기초하여, 보조 스크린 시험으로 분리시켜 AFEX CSH (I = 1, 2), SGH-N1 (I = 3, 4) 및 SGH 포함 중복 실행 -N2 (I = 5와 6).
3. 각각의 분리에 대한 _전반적인 RPI를 계산하고, 또한 우수한 균주의 목록 키질이 순위 매개 변수를 적용 = Σ _{I = 1, n은} [(RPI _Y + RPI _R) / 2] _I / N, 여기서 n = 6 _전체 RPI를 .
   참고 : Slininger 등의 절차에 따라 플라스크 문화 SGH-N2의 가수 분해물이 우수한 균주의 반응 속도를 보여준다 ^18.

결과

S.의 stipitis은 AFEX의 CSH, PSGHL 및 에탄올 도전 자일 로스 - 공급 연속 문화를 포함 세 가지 선택 문화의 조합을 사용하여 진화 하였다. 그림 1 균주와 함께 수행 진화 실험의 개략도 중 하나를 가장 효과적으로 수행하는 것으로 보여 전체적으로 또는 가장 효과적으로 테스트 가수 분해물 중 하나. 표 3은 이러한 우수한 균주의 NRRL에 수탁 번호를 나타내고, 각각의 균주?...

토론

몇 가지 단계가 발전 처리의 성공에 매우 중요했다. 첫째, 성공적인 응용 프로그램에 필요한 원하는 표현형으로 인구의 진화를 구동하기 위해 적절한 선택 압력을 선택하는 것이 중요합니다. 다음 선택적 응력은 S. 위해 선택되었다 개발 stipitis 원하는 표현형 농축을 안내하도록 적절한 시간에 적용 : 12 % (아세트산 푸란 알데히드 및 다른 억제제 낮은 수준의 존재 하에서 성장하고 다...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-)	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase	Novozymes	No product number	www.novozymes.com, 1-919-494-3000
Toasted Nutrisoy Flour	Archer Daniels Midland Co. (ADM)	63160	ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Surfactant)	Sigma-Aldrich	P1300	Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay Casamino Acids	Becton Dickinson and Company	228830	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan	Sigma-Aldrich	T3300	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto Agar	Becton Dickinson and Company	214010	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt Extract	Becton Dickinson and Company	218630	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Yeast Extract	Becton Dickinson and Company	212750	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Peptone Type IV from soybean	Fluka	P0521-500g	multiple suppliers: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% powder	Sigma-Aldrich	A8626	CAS 73-24-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS	Fisher Chemical	D16-500	CAS 50-99-7. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, assay >99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6. Could use other brands. Multiple suppliers: e.g., Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-well, flat bottom plates	Becton Dickinson Falcon	351172	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 Wiper	Kimberly-Clark		towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers e.g., Thermo-Fisher, uline, Daigger
Corning graduated pyrex flask, 125 ml, narrow opening (stopper #5)	Corning Life Science Glass	4980-125	multiple suppliers: e.g., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation	New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)	M1335-0016	multiple suppliers: e.g., Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used.
Duetz Cover clamp for 4 deep well MTP plates	Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System sandwich cover for 96 deep well plates	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System silicone seal (0.8 mm black low evap) for 96 deep well plate cover	Applikon Biotechnology	V0W1040027	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover	Applikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
96 well, 2 ml square well pyramid bottom plates, natural popypropylene	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125 ml flasks	Bellco	1924-00032	Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27
Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100 ml working volume. This design no longer manufactured.	Bellco	1968-00100 (original Cat. No.)	Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75 mm in outer diam and 200 mm in height. There are four side ports at ~45° angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22 mm inner diameters on ports).
Mathis Labomat IR Dryer Oven	MathisAg	Typ-Nbr BFA12 215307	Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
Dual Channel Biochemistry Analyzer	YSI Life Sciences	2900D-UP	www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format
PowerWave XS Microplate Spectrophotometer	Bio-Tek Instruments, Inc	MQX200R	www.biotek.com