암 세포 침윤 및 위성 종양 형성을 탐색하는 문화 분석 세 가지 차원

요약

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

초록

단일 층에서 포유 동물 세포 배양 널리 다양한 생리 학적 및 분자 과정을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나 성장 세포를 연구하는이 방법은 종종 원치 않는 아티팩트를 생성합니다. 따라서, 주로 세포 외 기질 성분을 사용하여 3 차원 (3D) 환경에서 세포 배양이 때문에 생체 조직 또는 기관에서 고유로 그 유사성 흥미로운 대안으로 나타났다. 우리는 피브린 겔 이루어지는 의사 차 macrospherical 종양 및 (ⅱ) 주연 무 세포 격실 콜라겐 겔 연기에 포함 된 암 세포를 함유하는 중앙 구획 개의 구획, 즉 (i)를 이용하여 3 차원 세포 배양 시스템을 개발 즉, 센터에서 사용되는 다른 세포 외 매트릭스 성분이있는 암세포 마이그레이션 (내습 전면) 및 / 또는 보조 위성을 나타내는 종양 microspherical 종양을 형성 할 수있다. 주변 구획 위성 종양의 형성은이 현저 차원 배양 시스템의 차별화 네이티브 종양 세포의 공지 공격성 ​​또는 전이성 기원 상관. 이 세포 배양 방법은 암 세포의 침윤과 운동성, 세포 외 기질의 상호 작용 및 항암 약물의 특성을 평가하는 방법으로 평가하는 것으로 간주 될 수있다.

서문

암 세포 침공 / 마이그레이션 및 후속 전이 설립의 기본 및 생물 의학 특성을 조사하는 강렬한 연구 ^{1, 2의} 주제이다. 전이 암의 최종 단계이며, 임상 관리하기 어려운 남아있다. 세포 및 분자 수준에서의 전이에 대한 이해는보다 효율적인 치료 ^(3)의 개발을 가능하게한다.

전이성 세포의 여러 특성은 자신의 stemness 및 마이그레이션 내에서 기본 종양 ⁵ 침공 전이 상태 (예를 들면, 상피 - 중간 엽 전이를) 획득 가능성을 포함하여 시험 관내 ⁴ 탐험 할 수 있습니다. 그것은 거의 혈액 / 림프 순환의 기여를 배제하기 때문에, 내습 / 전이 과정의 시험 관내 평가는 도전하고있다. 콜라겐 젤에 종양 조각을 삽입의 Organotypic 문화는 기존에 가지고교활한 암의 공격성을 모니터링하는 데 사용되었다. 종양의 복잡도가 보존되어 있지만 (예를 들면, 비 - 암성 세포의 존재), 종양 절편 샘플링 변동 제한된 확산 매체에 노출 및 기질 세포 ^(6)의 과도한 성장한다. 대안적인 방법은 3 차원 셀 환경을 모방 세포 외 기질 (ECM)의 구성 요소 내에서의 암세포 성장에있다. 콜라겐 겔 및 / 또는 기저막 유래 매트릭스 유방암 세포주의 증식 차원 세포 배양의 가장 특징으로하는 실시 예 사이이다. 특정 3 차원 세포 배양 환경을 사용하여 표준 조건 하에서 성장 유방암 세포에 대해 관찰 된 무질서 조립체 유방 꽈리 및 관상 구조 ^7-10의 자연 형성에 역전 될 수있다. 또한, 선암종 암세포 유래의 다세포 종양 타원체의 형성은 (서로 다른 기술을 이용하여 군집예를 들면, 현재 가장 일반적으로 사용되는 3 차원 세포 배양 분석법 ^{11-13을 구성하는)} 매립 한천, 타원체, 플로팅 방울 매달려. 그러나 이러한 분석은 구 상체를 형성 할 수있는 암 세포주의 제한된 세트에 의해 이러한 조건에서 세포를 연구 할 수 짧은 기간에 의해 제한된다.

이러한 시각화 방법에서, 우리는 본 명세서에서 관심있는 암세포 대안 기저막 유래 매트릭스로 피복 될 수있는 의사 원발 종양의 체외 형성을 허용하기 위해 콜라겐 겔에 포함 된 정교한 3D 세포 배양 분석을 소개한다. 형성되면, 가상 기본 종양 후 암세포 두 매트릭스 구획과의 계면을 통과 할 수있는 무 세포 기질 (본 경우 피브린 겔)에 끼워진다 (도 1 참조). 흥미롭게 공격적인 암세포와 함께 의사 원발 종양 유래 이차 종양 같은 구조가 나타나지섬유소 젤. 이러한 3 차원 배양 시스템은 예를 들어, 항암제, 유전자 발현 및 세포 - 세포 및 / 또는 세포 ECM 상호 ^14-16 조사하는 필요한 유연성을 제공한다.

그림 1 :.. 방법의 개요 암 연구를위한 모델로 3D 세포 배양 시스템을 생성하는 방법의 도식 요약 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

참고 : 동물과 인간의 암 세포가 구입하거나 친절하게 우리에게 제공 되었기 때문에 없음 윤리 고려.

1. 만들기 콜라겐 플러그 (의사 차 종양)

1. 콜라겐 분산을 준비합니다. 이전에 ^{17 일} 또는 구입을보고 나도 추출하여 멸균 할 수 있습니다 쥐의 꼬리 힘줄 (RTT)에서 콜라겐 입력합니다. (; 다섯 2 분 실행 고속 설정) 균일 한 혼합을위한 동결 건조 된 RTT 콜라겐 (0.02 N 아세트산에 3.25-3.50 ㎎ / ㎖) 블렌더를 사용하여 분산.
2. 수확 (트립신 EDTA, 보통) 및 혈구를 사용하여 가능한 세포를 카운트 트리 판 블루 배제을 사용합니다. 원하는 세포 밀도 (플러그 당 5 × 10 ⁴ 세포)로 조정합니다.
3. 무균 조건 하에서 모든 솔루션 (수산화 나트륨, 소 태아 혈청, DMEM 5 _{배,의 NaHCO3)} 별도로 (표 1)을 준비하고 얼음에 냉장 보관하십시오. 주 : 각종 용액의 첨가 순서는 셀 또는 산성 삼투압 충격을 방지하는 것이 중요하다.
4. 가능한 한 빨리 최종 콜라겐 용액 (5 mL)에 셀 분산액 (1.25 × 10 ⁶ 세포)를 수행한다. 기포를 방지하고 신속 96- 웰 플레이트의 각 웰에 즉시 사용 용액 200 μL를 배포하면서 (최대 피펫 아래쪽으로) 잘 섞는다. 부드럽게 기포를 제거하는 세포 배양 후드의 작업 영역 표면의 멀티 웰 플레이트를 찍는 웰 내부에서 균일 용액을 전파.
5. 모든 우물을 작성 후 인큐베이터에 보관 (이 단계는 96 웰 플레이트 당 약 15 ~ 20 분 소요).
6. 하룻밤에 2 시간에서 37 ° C에서 접시를 품어. 콜라겐 겔화 (즉, fibrillogenesis)는 30 분 이내에 발생합니다. 하룻밤 배양을 수행하기 위해 문화 문화 매체 (100 μL / 웰)를 추가합니다.

섬유소 젤 2. 첫 번째 레이어

1. 피브리노겐 용액 준비.
   주 : 피브린 겔 같은 일괄 적 재현성 있습니다 END_STRONG_1 사용해야TS와 같은 피브린 겔 형성은 상업 동결 건조 피브리노겐의 다른 배치에 따라 다를 수 있습니다.
   1. 항상 새로 제조 피브리노겐 용액을 사용한다. 수화물 결정 형성을 방지하기 위해 유리 병을 열기 전에 실온으로 동결 건조 된 피브리노겐을 가지고.
   2. 점진적으로 사전 예열 (37 ° C) ^칼슘과 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS가) / 3 ㎎ / ㎖의 작업 농도의 Mg ²⁺ (최소 최종 부피의 15 % 초과를 준비 고려할 필요에서 피브리노겐을 용해 : 예를 들면, 5 ml의 솔루션에 대한 5.75 용액에 17.25 mg)을 얻었다.
      1. 피브리노겐 조각을 용해하기 위해 처음에 미리 예열 HBSS의 적하를 추가합니다. 비커에 주걱으로 더 큰 조각을 분해. 시간과 혼합 용이하게하기 위해 시간을 비커를 교반. 절차를 수행하는 동안 교반기 플레이트를 사용하지 마십시오. 위아래 정지를 피펫 팅하여 나머지 분말을 녹여.
   3. steri 동안 미지근한 피브리노겐 용액 유지0.22 ㎛의 필터에 통과시켜, 용액을 LIZING. 주 : HBSS 충분히 따뜻하지 않거나 피브리노겐이 완전히 용해되지 않은 경우, 솔루션은 필터를 막히게 할 수있다. 해당되는 경우, 피브리노겐 농도를 감소, 따라서 섬유소 응고 강성 수있는, 한 번 또는 두 번 필터를 교체합니다.
   4. 다른 방법으로서, 최종 부피를 조절하면서 즉시 사용 피브리노겐 용액에 관심있는 세포 (예, 내피 세포)에 일시.
2. 트롬빈 솔루션을 준비.
   1. DDH ₂ O (50 NIH 단위 / ㎖)의 스톡 용액을 제조 한 후 0.22 ㎛의 필터를 사용하여 멸균.
   2. 피브리노겐 / 트롬빈 비율 ≥1 사용 0.0075 (V / V)이 피브린 겔을 생성하기 위해서이다.
3. 섬유소 젤을 생성.
   1. 멸균 피브리노겐을 유지하고 모든 다음 단계 동안 얼음에 재고 솔루션을 트롬빈. 섬유소 젤은 24 웰 플레이트에 형성 할 수 있습니다.
   2. 즉시 오버레이 일각각의 E면 웰과 기포의 형성을 피하면서 피브리노겐 용액 (200 μL / 웰). 한 번에 6 우물을 처리합니다.
   3. 피브리노겐 용액이 완전히 웰의 표면을 커버하면, 45 ° 각도로 플레이트를 기울 웰의 중심에 트롬빈 놓아 제 1 웰에 트롬빈 용액 1.5 μL를 추가 한 다음 부드럽게 대해 가로 판 소용돌이 1-2 초.
      1. 층류 후드 (5-10 분) 겔화 / 응고 과정이 완료 될 때까지 아래 안정 위치에서 상기 플레이트를 남겨 (NB : 중합 공정은 인큐베이터에 플레이트를 반송하여, 예를 들어 방해 안된다).
   4. 처음 여섯 우물이 중합 한 후 모든 우물이 처리 될 때까지, 다음 6 우물에 동일한 순서 (즉, 3 이전 단계)를 반복합니다.

섬유소 젤과 샌드위치 콜라겐 플러그의 3 번째 레이어

1. 선택권A : (즉시 콜라겐 플러그를 사용).
   1. 섬유소 젤의 제 1 층 섬세 접시를 기울여 모든 우물에서 중합 것을 확인합니다. 콜라겐 플러그의 전송을 쉽게하기 위해 (섬유소 젤을 포함) 24 웰 플레이트 옆에 콜라겐 겔 플러그 측을 포함하는 96 웰 플레이트를 놓습니다.
   2. 콜라겐 플러그를 함유하는 플레이트의 각 웰에 HBSS 한 방울을 추가한다.
   3. 얇은 (핸들로 사용) 주사기에 장착 된 바늘 또는 (동영상 참조) 마이크로 스푼을 이용하여 우물에서 각 콜라겐 플러그를 제거합니다. 콜라겐 플러그 웰 웰에 중심을 그 불임성이 잘 유지되고 있는지 확인하면서, 하나 또는 두 개의 마이크로 숟가락을 사용하여 상기 제 피브린 겔 층에 각각 콜라겐 플러그를 옮긴다.
   4. 피브리노겐 용액의 두번째 층이 미리 형성된 피브린 겔 오버레이 (300 μL / 웰) 및 2.3에 기재된 바와 같이 최소한 1 유지 트롬빈 소개 :. 한번에 0.0075 비율 여섯 웰 시퀀스
2. (성장 인자 - 감소 지하 막 (GFRBM)의 얇은 층으로 콜라겐 플러그 코팅) 옵션 B.
   1. 쿨 모든 준비 솔루션 및 악기 사전 및 GFRBM의 냉동 분취 이후 처리 과정 (예를 들면, 피펫, 조언, 테스트 튜브) 4 ° C 또는 얼음에 그들을 유지는 (제조업체의 지침에 따라) 해동시 과도한 가열 속도에 매우 민감하다 .
   2. 플레이트 웰로부터 제거 후, ​​순수 GRFBM 용액 100 ㎕를 함유하는 얼음에 1.5 mL의 원심 분리 튜브에서 2 분 동안 각각 콜라겐 플러그 소크.
   3. 전술 한 바와 같이 그것을 보장하는 것은 물론 중심 동안 첫 번째 섬유소 층에 각각 코팅 플러그를 전송합니다. 5 분의 GRFBM이 겔을 형성 할 수 있도록 37 ℃에서 플러그 - 함유 플레이트를 인큐베이션. 단계 3.1.4에서와 같이 두 번째 섬유소 층을 추가합니다.

4. 세포 배양 중간 조건

1. (배지와 잘 4 각 채우기00 μL). 배양액 및 보조제는 세포주 및 실험 조건에 따라 선택 될 것이다.
2. 100 칼리 크레인 저해 단위 (KIU) / ㎖의 최종 농도로 배양 배지에 아프로 티닌, antifibrinolytic 제를 추가한다.
   주 : 시험 된 세포주에 이용되는 조건 하에서 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 저장.
3. 매일 신선한 매체와 문화를 보충하거나 실험 일정에 따라, 그리고 아프로 티닌을 추가합니다. 새로운 배지를 추가하기 전에 약간의 (a 30 ~ 35 ° 각도로) 판을 기울 조심스럽게 일정한 관찰에서 조정 배지를 흡입하는 동안 잘의 측면에 대해 피펫을 경사.

결과

앞서 언급 한 바와 같이,이 3 차원 세포 배양 검정의 흥미로운 특징은 암세포에만 인접 피브린 겔 콜라겐 플러그 마이그레이션뿐만 아니라, 이차 종양 (예, 위성 종양 형 구조)를 확립 할 수 있다는 것이다. 이는 직접 특히 긴 작동 거리 응축기 (도 2)과, 겔의 두께를 통해 저 및 고 배율에서의 역 위상차 현미경으로 관찰 할 수있다. 다른 실험 셋업 ^(15)?...

토론

중요한 기술적 각주, 갭 중앙과 주변 겔 사이의 계면에 존재하지 않는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 / 마이그레이션 피브린 겔 침투하는 전지의 용량을 줄일 수있다. 트롬빈 적절히 희석되지 않은 경우 콜라겐과 피브린 겔 사이의 공간은 배양의 처음 24 시간 동안 형성 할 수도있다. 콜라겐 겔을 초래할 수 시험 세포주 모두시켜 겔 사이에 형성하기 위해 상대적으로 큰 공간을 일으키는 동안 배양 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freeze-dried collagen	Sigma-Aldrich	C7661	from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14)
Fibrinogen (freeze-dried)	Sigma-Aldrich	F8630	Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable
Thrombin	EMD Chemicals Inc.	605157	Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356234	Previously from BD Biosciences
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6279	solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit)
Micro-spoons	Fisher Scientific	2140115	Fisherbrand Handi-Hold Microspatula
96 well plate, round base	Sarstedt	3925500
24 well plate	Sarstedt	3922
Dulbecco's modified Eagle's Medium	Sigma Chemical, Co.	D5546	DMEM
Fetal Bovine Serum	VWR	CAA15-701	FBS, Canadian origin.
Trypsin-EDTA	Sigma Chemical, Co.	T4049
Hank’s Balanced Salt Solution	Sigma Chemical, Co.	H8264	HBSS