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요약

이 비디오 기사는 체계적이고 효율적으로 많은 무척추 동물 배아에서 복잡한 신호 전달 경로 및 규제 네트워크의 구성 요소를 특성화하는 데 사용할 수있는 생체 방법론에 직접적인을 자세히 설명합니다.

초록

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

서문

유전자 조절 네트워크 (GRNs) 신호 전달 경로는 성인 동물 신체 계획을 작성하는 데 사용되는 배아 발달 동안 유전자의 시공간적 식을 설정. 세포 간 신호 전달 경로는 세포가 통신하는 수단을 제공하는 이러한 규제 네트워크의 필수적인 구성 요소이다. 이러한 세포의 상호 작용을 수립하고 배아 1, 2 중에 다양한 지역과 중 규제 및 분화 유전자의 발현을 수정. 세포 외 분비 조절제 (리간드 길항제) 수용체 공동 수용체 간의 상호 작용은 신호 전달 경로의 활동을 제어한다. 세포 내 분자의 구색은 세포의 변형 된 유전자 발현, 분할 및 / 또는 형상의 결과로 이러한 입력을 transduces. 주요 경로에있는 세포 및 세포 수준에서 사용되는 키 분자의 대부분은 있지만공지 그것은 개개 신호 경로의 복잡성으로 인해 많은 부분에서 불완전한 지식이다. 또한, 다른 신호 경로는 종종 세포, 세포 내에서 양 또는 음 중 서로 상호 작용하고 전사 레벨 3, 4, 5, 6. 중요한 신호 전달 경로의 중심 구성 요소는 고도로 모든 후생 동물 종에서 보존하고, 특히 관련성 phyla의 발 미생물과 비교하면 현저하게 중요한 신호 전달 경로의 대부분은 종종 많은 종에서 유사한 발달 기능을 수행하는 7, 8, 9, 10, 11.

개발하는 동안 신호의 연구는 모든 생물의 발굴 작업이며,이척추 동물에서 큰 가능한 리간드 및 수용체 / 공동 변조기 상호 작용의 수, 세포 내 전달 분자뿐만 아니라, 거기에 1) : 가장 후구 동물 모델 (척추 동물, 무척추 척색, 반삭 동물 및 극피)의 신호 전달 경로를 연구하는 몇 가지 중요한 문제는 때문에 유전체 (12, 13), (14)의 복잡도에 서로 다른 신호 경로들 사이의 상호 작용 가능성; 2) 척추 동물의 복잡한 형태와 형태 형성의 움직임은 종종 더 어렵게 및 신호 전달 경로 사이에서 상호 작용을 해석 할 수 있도록; 3) 대부분의 비 극피 동물 무척추 동물의 후구 동물 모델 종의 분석은 일부 피막이 종 (15, 16)를 제외하고 임신 횟수의 짧은 창으로 제한됩니다.

그만큼성게 배아 상술 제한 몇 가지며 생체 내 신호 전달 경로의 상세한 분석을 수행하기 위해 많은 독특한 특성을 제공한다. 이들은 다음을 포함한다 : 1) 성게 게놈의 상대적 단순성 크게 가능한 리간드, 수용체 / 공동 수용체 및 세포 내 전달 분자의 수를 감소시킨다 (17)과의 상호 작용; 2) 세균 층 및 주요 배아 축 사양 및 패턴을 제어하는 GRNs 잘 신호 (18), (19) 수신 셀 / 지역의 규제 문맥의 이해를 돕고, 성게 배아 년에 설립된다 배아가 그 형태를 분석하기 쉽다 단층 상피 구성 때 3) 다수의 신호 전달 경로는 초기 및 절단 낭배 단계 사이 연구 될 수있다 4) 분자를 포함쉽게 조작하는 성게의 신호 전달 경로에서 D; 5) 많은 성게는 10 ~ 11 개월 년 (예 : Strongylocentrotus의 purpuratus 및 Lytechinus의 variegatus)에 대한 임신하는됩니다.

여기서 우리는 체계적이고 효율적으로 지정하고 성게 배아의 패턴 영역이 여러 무척추 동물 모델 시스템은 복잡한 분자 메커니즘의 연구에 제공하는 이점을 설명하기 위해 신호 전달 경로의 구성 요소를 특성화 할 수있는 방법을 제시한다.

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프로토콜

1. 높은 처리량 모르 폴리 노 디자인 전략

  1. 관심의 유전자 (들) (예를 들어 후보 유전자 접근 방식, 시스 - 규제 분석, RNAseq 및 / 또는 단백체 차동 화면)를 확인합니다.
  2. 자주 업데이트되는 웹 사이트에서 게놈, transcriptomic 및 유전자 발현 데이터를 사용 (예 : SpBase http://www.echinobase.org (20)와 S. purpuratus 게놈 검색에 http : ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index .html)을 시공간 발현 프로파일이 문제의 발달 메커니즘과 겹치는 것을 확인합니다. 어떤 발현 데이터가 없다면, qPCR에 프라이머를 생성 및 / 또는 인 시츄 프로브는 안티센스 유전자 발현 패턴을 평가.
  3. 시공간 발현 패턴을 결정한 후, 게놈 웹 사이트로부터의 DNA 서열을 얻었다.
    1. 번역 차단 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드를 생성하는 오 시퀀스를 획득F 5 '비 - 번역 영역 (5'UTR) 직접 상류에서 SpBase 또는 S. purpuratus 게놈 검색 웹 사이트에서 표현 된 시퀀스 태그 (EST) 데이터베이스에서 개시 코돈. 이 정보가 관심의 유전자를 사용할 수없는 경우, 다음 5 'RACE를 수행합니다.
    2. , 스플 라이스 차단 모르 폴리 노를 설계 엑손과 SpBase 또는 S. purpuratus 게놈 검색 도구의 발판 BLASTN 도구를 사용하여 인트론을 포함하여 게놈 시퀀스를 검색합니다.
  4. 목적하는 25 염기 쌍 모르 시퀀스를 설계하기 위해, 올리고 뉴클레오티드 설계 사이트 http://oligodesign.gene-tools.com를 사용한다.
    1. 병진 차단 모르 들어 병진 표적 서열의 소스로 '3'(5)로부터의 mRNA 서열을 사용한다. 5 'UTR 서열 (전사 시작 사이트의 상류 약 70 뉴클레오티드) 플러스 마크 위스콘신 코돈 시작으로 (시작 사이트의 다운 스트림) 코딩 영역의 25 기지를 포함번째 괄호 (ATG).
    2. 스플 라이스 차단 모르 들면, 인트론 - 엑손 또는 인트론 - 엑손 경계 시퀀스를 선택하고, 경계 영역 50 염기 (엑손 서열 25 염기 및 인트론 서열 25 염기)를 포함한다. 순서가 고유한지 확인 모르 폴리 노 서열과 게놈을 스캔합니다.

모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드 2. 미세 주입

  1. 300 nmol의 모르 폴리 노의 바이알에 클레아없는 물 100 μL를 첨가하여 폴리 노 올리고 뉴클레오티드의 3 mM의 스톡 용액을 준비한다.
    참고 : 디 에틸 피로 카보네이트는 모르 폴리 노를 손상시킬 수 있기 때문에 재 현탁액에 대한 DEPC 처리 된 물을 사용하지 마십시오.
  2. 최고 속도로 30 초에 대한 재고 올리고 뉴클레오티드 용액이 들어있는 유리 병 아래 첫 번째 재구성 스핀 - 5 ~ 10 분, 짧게 소용돌이 65 ° C에서 (14,000 16,000 XG), 간단히 소용돌이, 열, 룸에서 모르 폴리 노의 재고를 유지 적어도 1 시간 동안 온도. 모르 폴리 노 원액 들 +4 ℃로 -20 ° C에서 저장됩니다.
  3. 원하는 농도 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오타이드를 포함하는 주사 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션은 일반적으로 20 % 글리세롤 또는 캐리어 125 밀리미터의 KCl 15 % (형광 염료 덱스 트란 10,000 MW 2.5 밀리그램 / μL 원액) FITC-덱스 트란이 포함되어 있습니다. FITC 덱스 트란 등의 형광 덱스 트란 접합체 일상적 표면 형광 현미경으로 주입 된 배아를 식별하는 데 사용된다. -20 ℃에서 보관 주사액.
  4. 5 분 - 적어도 2 열 블록 또는 수욕에서 65 ° C에서 모르 용액을 가열한다.
  5. 적어도 10 분 - (16,000 XG 14,000) 최고 속도로 1 분간 원심 분리를위한 - (16,000 XG 14,000), 소용돌이 짧게 모르 폴리 노의 최고 속도에서 30 초 동안 솔루션을 스핀.
  6. 모르 폴리 노 용액 주입 바늘을 넣습니다. 자세한 미세 주입 프로토콜 Stepicheva과 노래 2014 년 21 환호와 Ettensohn 2004를 참조하십시오"> 22.

S. purpuratus 태아에서 24 시간 후 수정 (HPF)에서 3. 고정하고 제자리 프로토콜에서

참고 :이 프로토콜은 아레나스 - 메나 등에서 수정됩니다. 2000 년 23 세티 등. 2014 년 24.

  1. 정착
    1. , 배아를 포함하는 웰 (아래 참조) 정착의 몇 방울을 추가 피펫으로 부드럽게 혼합하고, 그들이 정착 할 수 있습니다. 정착액 솔루션을 제거하고 고정액의 두 개의 추가 180 μL 세척과 배아를 혼합한다.
      참고 : 철저하게 부드러운 피펫 위아래로 몇 번으로 세척하는 동안 배아를 혼합하는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 신호 대 잡음비를 낮출 수있다.
    2. pH를 7.0 10mM의 MOPS로 구성된 4 % 전자 현미경 등급 파라 포름 알데히드 실온에서 50 분 시간 1에 대한 두 번째 정착액 세척 (RT)에 수정 배아를 남겨, 0.1 % 트윈 20, 인공 seawateR (ASW). 최상의 결과를 위해 각 시간이 솔루션은 신선합니다. 또한, 편의성과 실용성 배아 96 웰 플레이트에 고정되어있다.
      1. 20 ML의 정착액 사용 5 mL의 16 % 파라 포름 알데히드, 15 mL의 ASW, 200 μL 1 M MOPS pH를 7.0, 20 μL 트윈 20.
    3. MOPS 180 μL에 실온에서 5 회 반복한다 0.1 M MOPS pH를 7.0, 0.5 M의 NaCl 및 트윈 20 적어도 5 분 동안 또는 배아 때까지이 우물의 바닥에 떨어 0.1 %로 구성된 버퍼를 씻는다. 다시, 충분히 부드럽게 피펫 팅하여 여러 번 아래 세척 완충액으로 배아를 혼합하는 것이 중요하다. (4)에 저장된 경우 MOPS 세척 완충액을 2 일 동안 사용될 수있다 기음.
      1. 40 mL를 들어 MOPS 버퍼 사용 4 mL의 1 M MOPS pH를 7.0, 4 ㎖의 5 M NaCl을 32 mL의 DH 2 O, 40 μL 트윈 20을 씻는다.
      2. 고정 배아 2 일 동안 4 ℃로 저장 될 수있다.
        주 : 이상 고정 된 배아를 저장하는 경우, 박테리아 성장을 방지하기 위해 버퍼 워시 MOPS에 0.2 % 아 지드 화 나트륨을 추가한다.
  2. 사전 하이브리드
    1. MOPS는 버퍼 워시 기음과 2의 180 μL를 추가, 하이브리드 버퍼에 버퍼 부드러운 피펫 몇 배 용액에 배아를 혼합하고 실온에서 적어도 20 분 동안 품어 씻어 MOPS의 1의 비율. 혼성화 완충액 70 % 포름 아미드, 0.1 M MOPS pH를 7.0, 0.5 M NaCl을 구성, 1 ㎎ / ㎖의 BSA, 0.1 % 트윈 -20.
      1. 40 mL의 하이브리드 버퍼 사용 4 mL의 1 M MOPS pH를 7.0, 4 ㎖의 5 M NaCl을, 4 mL의 DH 2 O, 0.04 g의 BSA, 40 μL 트윈 20. , 텍싱에 의해 잘 섞는다 다시 28 mL의 포름 아미드, 및 소용돌이를 추가합니다.
    2. MOPS 세척 및 하이브리드 버퍼의 1의 비율과 1의 180 μL를 추가 : 2를 제거, 하이브리드 버퍼에 버퍼 용액에 배아를 혼합하고 실온에서 적어도 20 분 동안 품어 씻어 MOPS 2 비율.
    3. 하이브리드 버퍼 150 μL - 프로브 하이브리드 부드럽게 (100)에 배아를 혼합하기 전에. 적어도 1, 50 ° C에서 배아 부화시간.
      참고 : 하룻밤 배아를 배양하는 것은 허용됩니다. 배양 전에 증발을 방지하기 위해 접착 시트 웰을 밀봉.
  3. 이종 교잡
    1. 프로브 솔루션을 만들 부드럽게 한 다음, 하이브리드 버퍼에 소용돌이를 0.3 프로브의 NG / μL 500 μg의 / mL의 효모의 tRNA - 별도의 튜브에 0.1를 추가합니다. 효모의 tRNA는 안티센스 프로브의 비특이적 결합을 감소 시키도록 프로브 용액에 첨가된다. 이 50 ° C의 솔루션 및 흡인 하이브리드 버퍼를 예열.
    2. 프로브 용액 100 μL에 미리 혼성화 된 배아 믹스 접착 시트로 밀봉하고, 상기 프로브에 따라 2 내지 7 일 동안 50 ° C에서 혼성화합니다 (foxq2 프로브 2 일 동안 배양 될 수있다).
      참고 : 배양 시간은 프로브를 따라 달라질 수 있습니다. 낮은 수준으로 발현 일부 유전자는 7 일 동안 배양까지 필요로한다. 96- 웰 플레이트는 ADHES 경우 증발에 대하여 보험 등 습도 상자에 배치 될 수있다필자 시트가 제대로 밀봉되지 않습니다.
    3. 갓 만든 MOPS 180 μL와 50 ° C에서 5 회 반복 3 시간 총 버퍼를 씻는다. 이어서, MOPS의 μL 실온에서 세척 완충액 (180)으로 3 회 (15 분) 세척 하였다. 세척에 배아 부드럽게 여러 번 피펫 팅에 의해 때마다 버퍼 혼합해야합니다.
  4. 항체 배양
    1. MOPS는 버퍼 워시 대기음 10 % 정상 양 혈청 5 밀리그램으로 구성된 버퍼를 차단의 180 μL에 배아를 혼합 / 버퍼 하룻밤 실온에서 적어도 45 분 4 ° C에 대해 품어 씻어 MOPS에서 ㎖의 BSA.
    2. 버퍼를 차단 제거한 다음 1 포함하는 버퍼 차단으로 배아를 혼합 : 버퍼를 차단에 희석 알칼리 포스 파타 아제 접합 된 항 - 디그 옥시 제닌 항체의 1,500 희석. 증발을 방지하기위한 밀봉 판에 RT에서 밤새 인큐베이션. 참고 : 하룻밤 이상에서 항체를 두지 마십시오.
    3. 배아 6 번 씻으 (5 분 또는 배아가 떨어질 때까지) MOPS에 실온에서 버퍼를 씻는다. 배아 수4 ℃에서 하룻밤 저장 될 수있다.
  5. 현장 개발
    1. 0.1 M 트리스의 pH 9.5, 100 mM의 염화나트륨, 50 mM의의 MgCl 2, 1 ㎜의 levamisole로 구성된 갓의 pH 9.5 완충액으로 실온에서 배아 3 회 (10 분) 세척하고, 0.1 % 트윈 20.
      1. 20 ㎖의 pH 9.5 버퍼 사용 2 mL의 1 M 트리스 산도 9.5, 400 μL 5M NaCl을 1 mL의 1 M의 MgCl 2, 20 μL 트윈 20, 16.6 mL의 DH 2 O, 및 0.0048 g의의 levamisole.
    2. 빛으로부터 보호 염색 버퍼에 37 ° C에서 배아를 품어. 염색 완충액 10 %의 디메틸 포름 아미드로 구성 4.5 μL / ㎖ 4- 니트로 블루 테트라 졸륨 클로라이드 (NBT) 및 갓의 pH 9.5 완충액 3.5 μL / ㎖의 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 일 포스페이트 (BCIP) .
      1. 염색 버퍼의 한 ML 100 μL 디메틸 포름 아미드, 4.5 μL NBT, 3.5 μL의 BCIP를 사용합니다.
    3. MOPS에 3 ~ 5 회 세척하여 알칼리 포스 파타 아제 반응을 중지 버퍼를 씻는다. 반응 위스콘신foxq2 프로브는 일반적으로 1 시간 30 분 소요 번째. 일부 프로브는 RT 4 °에 C 중 하나에서 하룻밤 배양을해야 할 수도 있습니다.
    4. 70 % MOPS 세척 30 % 글리세롤의 솔루션으로 배아를 섞는다. 글리세롤 현미경 필요한 굴절률을 제공한다. 배아 몇 주 동안이 용액에 저장 될 수있다. 증발을 방지하기 위해 플라스틱 파라핀으로 판을 밀봉합니다.
  6. 슬라이드 준비 및 이미지 캡처
    1. 슬라이드 위에 스트립 사이의 작은 틈으로 삼각형에 양면 테이프의 세 개의 작은 스트립을 배치하여 슬라이드를 준비합니다.
    2. 삼각형의 중심에 70 % MOPS 세척하고 30 %의 글리세롤 용액에서 배아를 전송하고, 커버 슬립으로 덮고.
    3. 커버 슬립의 가장자리 주위 매니큐어의 층을 도포하여 커버 슬립을 밀봉.
    4. 20 배의 대물 렌즈와 연결된 카메라 복합 광학 현미경을 사용하여 이미지를 캡쳐.

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결과

성게 배아에서 우리는 3 가지의 Wnt 신호 지점 (이 Wnt / β-catenin이,이 Wnt / JNK와의 Wnt / PKC) 4, 25 상호 작용은 전후방 (AP) 패턴에 적용의 Wnt 신호 전달 네트워크를 형성하는 것으로 나타났습니다. 이러한 시그널링 이벤트의 가장 중요한 결과 중 하나는 초기 넓게 표현 전방 neuroectoderm (ANE) GRN가 낭배의 시작 (S.의 purpuratus HPF 24)?...

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토론

여기에 제시된 방법은 .. 많은 연구소가 해부 일찍 성게 개발 과정에서 유사한 분석을 사용하는 기본적인 발달 메커니즘을 지배하는 신호 전달 경로와 GRNs을 이해하는 척추 동물보다 작은 게놈과 형태 학적 복잡성 배아를 사용하는 능력을 보여주는 예입니다 다른 세포 운명 사양 이벤트에 관련된 신호 전달 경로 (예 노치 헤지 호그, TGF-β의와 FGF 신호) 27,

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공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

We would like to thank Dr. Robert Angerer for his careful reading and editing of the manuscript. NIH R15HD088272-01 as well as the Office of Research and Development, and Department of Biological Sciences at Mississippi State University provided support for this project to RCR.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholinoGene Tools LLCCustomizedMore information at www.gene-tools.com
GlycerolInvitrogen15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)Invitrogen, Life TechnologiesD1821Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM GradeElectron Microscopy Sciences15710
MOPSSigma AldrichM1254-250G
Tween-20Sigma Aldrich23336-0010
FormamideSigma Aldrich47671-1L-F
Yeast tRNAInvitrogen15401-029
Normal Goat SerumSigma AldrichG9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibodyRoche11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)Sigma AldrichL9756-5G
Tris Base UltraPureResearch Products Internationall Corp56-40-6
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358-10
Magnesium chlorideSigma Aldrich7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphateRoche11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)Roche11 383 213 001
Dimethyl FormamideSigma AldrichD4551-500mL
Potassium ChlorideSigma AldrichP9541-5KG
Sodium BicarbonateSigma AldrichS5761-500G
Magnesium SulfateSigma AldrichM7506-2KG
Calcium ChlorideSigma AldrichC1016-500G

참고문헌

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