그만큼<em&gt; 전의 VIVO</em항균 호스트 방어 연구에&gt; 콜론 오르간 문화와 그것의 사용

요약

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

초록

장 상피 세포의 종류, 점막 면역 세포를 포함 propia 및 간질로 이루어진 반복 토굴 구조체의 구조를 표시한다. 이러한 이종 세포 모두 장내 항상성에 기여 항균 호스트 방어에 참여한다. 따라서, 생체 외 환경에서 면역 반응과 소장의 항균 활성을 연구 대리 모델을 식별하는 것은 매우 어렵습니다. 시험관 연구에서 정상 소장과 미세 환경의 정확한 생리를 대변하지 않습니다 organoid 문화 불후의 장 상피 세포 라인 또는 기본 토굴을 사용. 여기서, 우리는 배양 접시와 어떻게 생체 기관 배양 물 시스템은 미생물 숙주 방어 반응에 관한 연구에서 구현 될 수있다에서 배양 마우스 결장암 조직의 방법을 논의한다. 대표 실험에서, 우리는 장기 문화에 콜론이 RESP에 항균 펩티드를 표현하는 것으로 나타났다외인성 IL-1β 및 IL-18 온세. 또한, 기관 배양 물에서의 결장 조직에 의해 생성 된 미생물 이펙터 분자가 효율적으로 시험 관내 대장균 죽인다. 이 방법은, 따라서, 장내 선천적 면역 반응과 미생물 숙주 방어 반응을 조절하는 pathogen- 및 위험 - 관련 분자 패턴 및 세포 수용체의 역할을 절개하는 데에 이용 될 수있다.

서문

소장은 공생 미생물에 대한 장벽 역할을하는 동적 시스템을 나타냅니다 침입하는 병원균에 대한 싸움, 그리고 미생물 조성물 ^{1을 조절한다.} 장 상피 세포, 장 세포, 술잔 세포 Paneth 세포 및 장 내분비 세포로 이루어진 장내 미생물 대 숙주 방어 반응을 제공하는 주요 세포 집단이다. 술잔 세포는 상피 층 ^(2)의 상단에 완충 영역을 작성 뮤신 생산. Paneth 세포 및 장 세포 항균 펩티드, 사이토 카인과 항균 숙주 방어 반응을 구성하고 장내 미생물 조성물 ^{(3, 4)를} 형성에 기여하는 활성 산소 및 질소 종을 생산한다. 상피 세포뿐만 아니라, 대 식세포, 수지상 세포, 호중구, 자연 살해 세포, 림프구 및 인나 포함한 면역 세포 ^{- 7} 점막 고유 층과 점막하에 테 림프 세포를 생산하는 사이토 카인, 케모카인, 기타 매개체 ⁵ 장 항균 호스트 방어 반응에 중요한 역할을한다. 점막 면역계는 미생물을 조절하고 미생물 감염에 대한 보호를 제공하는 방법을 이해하기 위해, 장내의 이종 세포 집단의 복잡한 상호 작용을 고려하는 것이 중요하다. 그러나, 소장의 기능을 모두 포함 체외 모델을 사용할 수 없습니다. 따라서, 소장에서 호스트 병원체 상호 작용에 대한 분자 연구는 매우 도전이다.

지난 몇 년 동안, 장 점막의 양상을 모방 여러 모델 시스템은 염증성 장 질환 (IBD) 등의 위장 장애 ^(8)과 관련된 병리 생리 학적 과정을 연구 개발되어왔다 ^-= "외부 참조"> 14. 불후의 장 상피 세포 라인은 종종 상피 세포의 특정 반응을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나, 차등 유전자 발현 및 불멸화 세포 기능, 데이터는 주로 생체 내 연구에서 관찰 된 것과 일치하지 않는 세포를 사용하여 얻은. 최근에 다른 자극 ¹³ 장 상피 세포의 반응을 평가하기위한 잠재적 인 도구로 떠오르고있다 organoid 문화 장 토굴. 이 시스템에서, 굴 줄기 세포 성장 및 3D organoid 구조를 개발할 수있다. organoid 배양 시스템은 장 상피 세포의 여러 측면을 연구하는데 매우 유용하지만, 면역 세포, 상피 세포 및 미생물 제품의 복잡한 상호 작용을 모방하지 않는다. 장 조직의 생체 문화는 생체 내 숙주 방어 반응을 더 잘 표현을 제공합니다. 이 방법에서, 상기 부위의 일부는 세포 배양 용 접시에서 배양 재치장내 세포 집단의 다른 유형을 허용 시간 적절한 미디어는 최소 48 시간 동안 대사 활성화합니다. 따라서, 장기의 생체 외 배양 미생물 유전자의 발현하고 특정 자극에 창자 숙주 방어 반응을 측정 할 수있다.

^{21 -} 수사는 소장 ^(15)에 미생물 감염에 대한 숙주 방어 반응을 연구하기 위해 생체 장기 배양 시스템을 사용하고있다. 우리는 최근 마우스 콜론 ^(22)의 항균 호스트 방어 반응의 inflammasome을의 역할을 연구하기 위해 장기 배양 시스템을 채택했다. inflammasome을 성숙 IL-1β 및 IL-18의 생산을 위해 필요한 카스파 제 1의 활성화를위한 분자 플랫폼이다. 우리는 IL-1β 및 IL-18은 대장균 효과적으로 공생 pathobionts을 죽이는 항균 펩티드를 유도 것으로 나타났다 . 이러한 관찰 inflammasome을 결손 마우스 결장 ²² 증가 대장균 부담과 일치했다. 이 시스템은 따라서, 그러한 염증성 장 질환 (IBD)과 결장암 (CRC)와 같은 장 질환의 장내 미생물 숙주 방어 반응에 패턴 인식 수용체 (PRRS)와 기타 선천성 면역 분자의 역할뿐만 아니라 기전을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 이들 유전자의 대부분이 장내에서 변형 된 미생물 조성과 관련된 200 개 이상의 IBD 감수성 유전자, 돌연변이가있다. 그것은 IBD - 감수성 유전자가 장내 미생물 규제되는 정확한 메커니즘을 결정하는 큰 임상 적 의의이다. 이 방법의 전반적인 목표는 생체 대장 기관 배양의 기본 프로토콜을 소개하고,이 배양 방법은 대장의 항균 호스트 방어 반응을 연구하는 데 사용할 수있는 방법을 설명하는 것입니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 실험 동물 자원 센터 (ARC), UT 사우스 웨스턴 의료 센터에서 특정 병원체 무료 (SPF) 시설 유지 6-8주 세 남자 야생형 (C57BL6 / J) 마우스를 사용하여 수행 하였다. 모든 연구는 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을하고, IACUC 지침 및 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 가이드의 국립 연구소에 따라 실시 하였다.

1. 수집 및 결장의 준비

1. 자궁 경부 전위 다음 CO ₂ 질식와 쥐를 안락사.
2. 70 % 에탄올로 마우스 스프레이와 보드 아래로 마우스 등의 측면을 지키는 고정 보드에 사지를 고정.
3. 미리 멸균 해부 가위 집게를 사용하여 복부의 복막에 중심선을 절개한다. 집게로 복막을 접어 복부를 엽니 다.
4. 복강 위스콘신에서 장을 제거번째는 집게와 가위를 해부. 맹장 하단과 항문의 타단 절단함으로써 소장으로부터 대장 별개.
5. 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 멸균 배양 접시에 콜론을 배치합니다. 결장 내강 내에서 대변이 완전히 제거 될 때까지 20 G 바늘 또는 경구 위관 영양법 바늘을 잡고 20 ㎖ 주사기를 사용하여 빙냉 PBS로 결장 내강의 내용이 플러시.
6. 세로로 가위로 결장을 잘라. 멸균 페트리 접시에 얼음처럼 차가운 PBS에 격렬하게 흔들어 콜론을 씻으십시오.
7. 약 1cm 긴 멸균 메스 나 가위를 사용하여 조각으로 결장 조직을 잘라.
8. 대장 조각의 무게를 기록한다.
   참고 : 제 1의 모든 단계를 내부 또는 생물 안전 캐비닛의 외부에 수행 할 수 있습니다. 콜론 문화에 대한 준비가되면, 모든 단계는 무균 상태를 유지하기 위해 생물 안전 캐비닛 내부에서 수행해야합니다.

2. 콜론 조직문화

1. 6- 웰 세포 배양 접시에 세포 스트레이너 (100 μm의)을 놓는다. 셀 스트레이너에 하나의 마우스에서 수집 결장 조각을 모두 전송합니다.
2. 5 % FBS, 페니실린 - 스트렙토 마이신 (1 배) 및 겐타 마이신 (20 μg의 / ㎖)를 포함하는 5 mL의 DMEM / F12 매체를 추가합니다. 완전히 매체와 콜론 조각을 커버합니다.
3. 5 % CO ₂ 및 95 % 공기 인큐베이터에서 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션.
4. 셀 스트레이너를 들어 올리고 미디어를 대기음.
5. 다시 우물의 셀 스트레이너를 놓고 어떤 항생제없이 5 ml의에게 신선한 매체를 추가 할 수 있습니다. 셀 스트레이너를 들어 올리고 미디어를 대기음.
6. 잔류 항생 물질을 모두 제거하기 위해 위 세척 단계 (단계 2.5) 두 번 더 (총 3 회) 반복한다.
7. 멸균 12 웰 세포 배양 플레이트의 한 웰에 단일 셀 스트레이너에서 결장 부분을 전송.
8. (어떤 항생제 제외) 5 % FBS가 포함 된 DMEM / F12 매체를 추가합니다. weig와 매체의 볼륨을 조절할결장 조각 저항성, 예를 들어, 조직의 100 mg을 1 ml의 배지. 5 % CO ₂ 및 95 % 공기 주입 배양기에서 37 ℃에서 12 시간 동안 배양.
9. 멸균 1.5 ML 튜브에서 배양 상등액을 수집합니다.
10. 5 분 동안 4 ° C에서 12,000 XG에 원심 분리기. 분석 및 / 또는 기타 면역 분석을 죽이는 박테리아에 사용하기위한 새로운 1.5 mL의 튜브에 뜨는을 분리합니다. 상층 액을 분석 전까지 -80 ℃에서 저장 될 수있다.
11. RNA 분리 용 튜브에 콜론 조각을 수집합니다.

분석을 죽이는 3. 대장균

1. 15 ML 튜브에 5 mL의 루리아 - 베르 타니 (LB) 국물에 대장균을 접종하고 밤새 200 rpm으로 진탕 37 ° C에서 품어. 약간 느슨한 문화 튜브의 캡을 보관하십시오.
2. 4 ℃에서 10 분 동안 1,200 XG에서 세균 배양 튜브를 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 5 ml의 얼음처럼 차가운 PBS로 세균 펠렛을 재현 탁.
3. BACT의 양도 1 mL의600 nm에서 큐벳 및 측정 OD에 erial 정지. 빈으로 PBS를 사용합니다.
4. 소정의 표준 곡선을 사용하여 콜로니 형성 유닛 (CFU)을 계산한다. 여기, 그 1 OD = 2 × ¹⁰⁹ CFU / ㎖ (약)를 가정합니다.
5. 주식 서스펜션 1 × ¹⁰⁵ CFU / mL로 세균 현탁액을 희석.
6. 24 웰 세포 배양 플레이트의 중복 웰에 2.10 수집 결장 기관 배양 상등액을 전송 (500 μL / 웰).
7. 하나 잘 포함 된 500 μL 대장 기관 배양 상청에 10 μL 대장균 문화 (1,000 CFU)를 추가합니다. 콜론 기관 배양 상청은 어떤 오염 물질을 포함하지 않는 것을 확인하는 대장균 접종하지 않고 다른 잘 둡니다.
8. 제어와 같은 항생제없이 배양 배지 (DMEM / F12 플러스 5 % FBS) 박테리아 동일한 수 (1000 CFU)를 부화.
9. 1 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
10. 각각의 샘플 드롭 위스콘신의 50 μL를 놓습니다맥 콘키 배지 플레이트에 자체. 하룻밤 37 ° C에서 맥 콘키 배지 판을 품어.
11. 콜로니의 수를 계산하고 CFU / ㎖을 계산합니다.

4. 대장 항균 호스트 방어 응답에 외부와 내장 요인의 효과

주 : 여기에서 설명 된 것처럼 미생물 사멸 분석은 장기 배양 상등액의 살균 활성에 대한 병원체 관련 분자 패턴 (PAMPs가) 및 사이토 카인의 효과를 조사하기 위해 채용 할 수있다. IL-1β 및 IL-18을 이용한 실험 예에 대하여 설명한다.

1. 제 1 절에 설명 된대로 마우스의 콜론를 수집합니다.
2. 멸균 종이 타월에 콜론을 배치합니다. 가위를 사용하여 세 부분 (그림 2)에 길이 방향으로 결장을 잘라.
3. 제 1 항에 기재된 빙냉 PBS에서 결장의 각 부분을 세척한다.
4. 작은 조각으로 대장의 각 부분을 잘라 무균 무게. 각 파트의 부분을 전송6 웰 세포 배양 플레이트의 세 개의 웰 (도 2) 상에 배치 된 세 개의 셀 스트레이너 (100 μm의)으로 결장.
5. 5 % FBS, 페니실린 - 스트렙토 마이신 (1 배) 및 겐타 마이신 (20 μg의 / ㎖)를 포함하는 2 ml의 DMEM / F12 매체를 추가합니다.
6. 5 % CO ₂ 및 95 % 공기 주입 배양기에서 37 ℃에서 2 시간 동안 배양.
7. 2.4-2.6에 설명 된대로 대장 조각을 씻으십시오. 멸균 12 웰 세포 배양 플레이트의 한 웰에 단일 셀 스트레이너의 결장 부분을 전송. 하나의 마우스에서 결장의 세 부분을 포함하는 세 개의 우물 (그림 2) 치료, IL-1β로 지정하고, IL-18해야한다.
8. (어떤 항생제 제외) 5 % FBS가 포함 된 DMEM / F12 매체를 추가합니다. 결장 부분의 중량, 예를 들어, 조직의 100 mg을 1 mL의 매체를 상기 매체의 볼륨을 조정한다.
9. 12 시간 동안 IL-1β (20 NG / ㎖) 또는 IL-18 (20 NG / mL)로 콜론 기관 배양을 자극한다. 처리되지 않은 결장 장기 문화는 제어 역할을합니다.
10. 5 % CO ₂ 및 95 % 공기를 주입 인큐베이터에서 37 ℃에서 12 시간 배양 한 후 멸균 된 1.5 ㎖의 튜브에 배양 상등액을 모은다.
11. 24 웰 플레이트의 중복 우물에 500 μL의 배양 상등액을 전송합니다.
12. 각 조건에 대해 제 3 절에서 설명한대로 하나의 웰에 대장균을 접종 대장 기관 배양 상등액 대장균 (1000 CFU)을 접종한다. 대장균이없는 다른 잘 포함하는 동일 장기 배양 상층 액은 세균 오염에 대한 제어 역할을합니다.
13. 제어와 같은 항생제없이 배양 배지에서 세균이 동일한 양의 인큐베이션.
14. 1 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션.
15. 드롭 현명한 맥 콘키 배지 플레이트에 각 샘플의 50 μL를 놓습니다. 하룻밤에 37 ° C의 맥 콘키 배지 판을 품어.
16. 콜로니의 수를 계산하고 CFU / ㎖ (그림 4)을 계산합니다.

e_title "> 5. 항균 유전자의 발현 측정

1. 대장 기관 문화의 하룻밤 배양 (12 시간) 후 2 ml의 얼음처럼 차가운 PBS (2 배)와 콜론 조각을 씻고, 제 2 조 및 제 4에 설명 된대로.
2. 2 용액의 RNase / DNase의 무료 스크류 캡 튜브에 콜론 조각을 수집합니다. 얼음에 튜브를 놓습니다.
3. 튜브에 1 mL의에게 상업 트리 졸 시약 및 용균 매트릭스 구슬을 추가합니다.
4. 를 Lyse 자동화 조직 균질화기를 사용하여 조직.
5. 새로운 microcentrifuge 관에 조직 해물를 수집합니다.
6. 표준 프로토콜을 사용하여 RNA를 분리합니다.
7. RNA의 농도를 측정한다.
8. 탈 이온수로 적절 RNA를 희석하는 cDNA를 합성하기 위해 500 NG의 RNA를 사용합니다.
9. 대상 항균 유전자, 사이토 카인, 케모카인, 관심의 다른 유전자의 실시간 RT-PCR 분석을위한 cDNA를 사용합니다.

결과

기관 배양에서 콜론의 대표적인 그림은 그림 1과 같다. 문화의 대장 조각 대사 및 생리 활성 남아있다. 그들은 배지에 첨가 외인성 자극에 효율적으로 반응한다. 생체 외 배양과 외인성 자극 자극, 예를 들어, IL-1β 및 IL-18에 대한 결장 조직의 제조 방법의 개략적 인 작업 흐름은,도 2에 도시되어있다. 기관 배양에서 콜론과 같은 항균 ?...

토론

장 상피 세포 성장 요구 사항의 관점에서 매우 민감하고 문화에 따라서 어렵다. EDTA 처리에 의해 고립 된 상피 세포는 DMEM ^(8)과 같은 기존의 세포 배양 배지에서 생존하지 않습니다. 따라서, 고립 된 지하실 또는 기본 상피 세포를 사용하여 호스트 병원체 상호 작용 연구는 매우 도전이다. 최근, 사토 등. 장 병태 생리 ^(13)에 관한 연구에 매우 유망하고 유용한 토?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM/ F12	Life Technologies	12634-010
Dulbecco's phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride & Magnesium chloride	Sigma	5634
FBS, heat inactivated	Sigma	F4135
Penicillin-Streptomycin	Life Technologies	15070063
Gentamicin solution	Sigma	G1272
Mouse IL-1b recombinan	Reprokine	RKP10749
Mouse IL-18 recombinant	Reprokine	RKP70380
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596018
Difco Luria-Bertani Broth	BD Bioscience	244620
BD Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar	Fisher Scientific	DF0075-17-1
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Scientific		Uded to measure RNA concentration
UV/Vis Spectrophotometer	BECKMAN	DU 530	Used to determine E. coli count
iScript RT Supermix, 100 rxns	Bio-Rad	1708841
iTaq Univer SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725125
Lysing Matrix S (1/8"), 2 ml Tube	MP Biomedicals	116925500	Used to homgenize colon organ for RNA isolation
FastPrep-24 5G System	Bio-Rad	116005500
100 mm x 15 mm Petri Dish	Falcon	5687
Plate 6 well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile	Cellstar	5085
100 μm cell strainer	Falcon	5698
Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific
Sorvall ST40R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific
Forma Scientific orbital shaker	Thermo Fisher Scientific