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요약

이것은 높은 지방 다이어트를 먹이 초파리, 이해 기본적인 분자 메커니즘 lipotoxicity에 연루에 대 한 모델에서에서 비만 유발 하는 프로토콜 이다. 초파리 와 다양 한 식이, 환경, 유전적 또는 생리 적인 조건 하에서 (곤충) 잠재적으로 다른 모델에 지방 축적을 측정 하기 위한 높은 처리량 triacylglyceride 분석 결과를 제공 합니다.

초록

심장 질환은 인간의 죽음은 전세계의 번호 하나 원인이 다. 수많은 연구 비만 심장 기능 상실 사이 강한 연결 인간, 하지만 더 많은 도구 및 연구 노력 하는 데 필요한 더 관련 된 메커니즘을 명료 하 게. 세기 동안, 초파리 의 유전자 매우 온순한 모델이 되었습니다 핵심 유전자 및 분자 경로 매우 종에 걸쳐 보존 될 입증의 발견에. 많은 생물학 과정 및 질병 메커니즘 기능 개발 (예를 들어, 몸 계획, 심장), 암, 신경 질환 등 즉석에서 보존 하 고. 최근, 비만 심장 질환 모형 유기 체에서와 같은 보조 병 리의 연구는 인간의 신진 대사 증후군에 관련 된 주요 레 귤 레이 터의 식별에 매우 중요 한 역할을 했다.

여기, 우리는 비만, 즉, 과도 한 지방 축적을 유발 하 고 태그 축적의 형태로 지방 콘텐츠를 모니터링 하는 효율적인 프로토콜을 개발 하는 효율적인 도구로이 모델 유기 체를 사용 하 여 제안 합니다. 높은 보존 뿐만 아니라, 하지만 덜 복잡 한 게놈 비행 또한 빠른 실험, 비용 효율성과 결합에 대 한 짧은 수명이 있다. 높은 지방 다이어트 (HFD) 비만 지방 콘텐츠에 높은 재현할 것을 목표로 관련된 증가 측정 하기 위한 높은 처리량 triacylglyceride (태그) 분석 결과 유도 하기 위해 초파리 에서 먹이 기를 위한 상세한 프로토콜을 제공 하는이 종이 대규모 유전자 또는 화학 심사에 대 한 효율적인. 효율적으로 규제 메커니즘 비만에 참여 조사 뿐 아니라 신약 개발에 약물의 효과의 빠른 테스트를 위해 발견에 대 한 표준화 된 플랫폼을 제공 하는 새로운 기회를 제공 하는 이러한 프로토콜 또는 비만, 당뇨병 및 대사 관련된 질환의 예방.

서문

우리는 비만, 및 그것의 관련된 경제적 부담이는 세계적인 문제1시간 에입니다. 매 3 미국인 중 2 개는 체중 또는 비만 관련된 심장 병 리, 성인 인구2내에서 죽음의 주요 원인으로. 새로운 효율적인 방법은 적절 하 게 구성 요소 유전 및 분자 모형 유기 체를 사용 하 여 변화 증후군의 규칙에 연루 조사 필요 합니다. 이러한 이유로, 우리 과일 파리 초파리 모델 생쥐와 인간3,4,,56을 포함 한 포유류와 함께 가장 기본적인 생물 학적 프로세스를 공유 하기 때문에 선택 합니다. 초파리의 게놈은 높게 진화 하는 동안 보존 하지만 전반적으로 훨씬 더 작은 적은 유전자 복제와 대사 복잡성,4 많은 인간 질병 내포 하는 근본적인 메커니즘을 이해 하기에 적합 , 7 , 8. 또한, 특성 프로세스 지방 조직, 창 자에 의해 실시 하 고 췌 비행에 포도 당 및 지질 물질 대사에, 예를 들어 인간9, 와 유사한 규제 기능을 중재 10,11. 또한, 비만, 인슐린 저항 및 당뇨병 인간에서의 제어에 관련 된 기본적인 분자 경로 초파리 melanogaster12,,1314 보존 기능 , 15 , 16. 같은 더 높은 유기 체 초파리 는 포유류 심장3,17의 유사한 과정에 의해 개발 하는 동안 형성 되는 뛰는 심장. 따라서, 안정적인 HFD 프로토콜 및 높은 처리량 태그 분석 결과, 초파리의 유전 도구 상자를 사용 하 여 효율적인 심사 목적에 맞게 먹이의 개발 연구 하 고 근본적인 유전 기초를 이해 하는 중요 한 수단을 제공 기본 복잡 한 대사 질환입니다.

HFD 음식 자체 포화 지방산 대사 증후군18와 관련 된 것으로 알려진의 주로 구성 되는 코코넛 오일 보충 표준 실험실 비행 음식에서 이루어집니다. 귀하는 초파리 에서 프로토콜 먹이 되는 것을 효과적으로 그리고 reproducibly 우리의 최적화 HFD organismal 지방 함량의 문제에 증가 유도 비만 모델 포유류, 설치류, 개월19,20걸릴 수 있습니다, 일12,14. 이 프로토콜, 높은 처리량 태그 분석 결과와 함께에서 유전적 요인, 환경 영향과 새로운 변조기의 뚱뚱한 물질 대사를 마약 후보자의 효과 대 한 효율적인 대량 검사를 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 가능성이 결과 이해 및 비만 비만 관련 된 인간의 병 리 전투 관련.

먹이 프로토콜 다목적 이며 단일 포화 또는 불포화 지방산의 신진 대사와 기능 효과 연구에 적용할 수 있습니다. 이 높은 처리량 태그 분석 결과 사용 하 여 D. melanogaster에 국한 되지 않습니다 하지만 작은 모형 유기 체 표 피와 거친 세포 외 매트릭스 (예를 들어, 다른 초파리 종, C. 선 충의 다양 한 적응 수 있습니다. 다른 신흥 무척 추 동물 모형 유기 체) 개발, 성인 또는 변화 질병의 단계의 모든 단계에서 다른 환경, 유전적 또는 생리 적인 조건 하에서 지방 콘텐츠를 측정 하. 태그 분석 결과 무료 지방산, 글리세롤, 글리세롤 3 인산 염 그리고 마지막으로 H2O2 와 4-aminoantipyrine (4-AAP) 3, 5-반응으로 태그 저하 효소 반응의 일련의 색채 측정에 기반 dichloro-2-hydroxybenzene 된 (3, 5 DHBS) 96-잘 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 된 빨간 색된 제품을 생산 하

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프로토콜

1. 프로토콜을 먹이 HFD

figure-protocol-69
표 1. 비행 음식 레시피.
이 표에서 우리의 제어 음식을 준비 하는 데 사용 하는 다른 재료를 요약 합니다. 일단, 음식의 10 mL 작은 유리병에 부 어 냉각 이며, 장기 저장을 위한 4 ° C에 저장.

  1. HFD 준비
    1. 높은 지방 식품의 1kg를 만들기 위해 미리 만든 정상 비행 음식의 700 g의 무게 (표 1 참조) 및 분석 균형을 사용 하 여 두 개의 별도 용기에 코코넛 오일의 300 g.
    2. 는 내용을 완전히 용 해 될 때까지 각 컨테이너는 전자 레인지에서 개별적으로 열. 비행 음식 컨테이너에 코코넛 오일 붓으십시오. 기름은 비행 거리 음식으로 잘 혼합 때까지 털 다를 사용 하 여 저 어.
      참고: 아무 음식이 나 기름 덩어리는 표시 되어야 합니다. 날 식품은 전자 레인지에 때, 음식을 혼합 끓는 방지를 1 분 간격으로 중지.
    3. 다시 높은 지방 음식 무게. 총 중량 1kg (음식 + 코코넛 오일의 300 g 700 g) 미만의 경우 추가 물 (약 10ml) 난방 중 증발에 대 한 보상 하 고 다시을 무게 1 kg.
    4. 부 어 잘 혼합된 약 10 mL 유리병 (유리병 볼륨의 약 25%) 당 높은 지방 음식. 다음으로, 투박한 파리를 방지 하기 위해 커버 ' 오염. 실 온에서 1 시간을 기다린 다음 4 주 스토리지에 대 한 4 ° C에 튜브까지 전송.
      참고: 일반 음식 (NF) 제어 음식으로 사용 됩니다. 또한 유리병 당 NF의 10 mL (유리병 볼륨의 약 25%)를 붓는 다. HFD 음식에 대 한 NF의 30%를 코코넛 오일 바꿉니다. 제어 및 실험 조건, 파리 NF와 HFD (10 mL 유리병 당 음식의)의 동일한 금액을 부여 했다.

figure-protocol-1134
그림 1 . 초파리 먹이 HFD.
체계는 (와 코코넛 오일의 추가) 제어 식품 (코코넛 오일-NF의 추가 없이 일반 다이어트) 또는 HFD 파리에 대 한 다른 먹이 단계를 보여 줍니다. 전체 과정 초기 성인 파리 컬렉션 후 10 일 소요 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

  1. HFD D. melanogaster의 먹이
    참고:이 프로토콜 제어 음식과 HFD 먹이 어떤 비행 라인와 호환 되는 절차를 포함. 제어 및 실험 파리 같은 금액 음식 NF (HFD)를 포함 하는 튜브에 배치 됩니다.
    1. 파리 anesthetize를 사용 하 여 CO 2.
      참고: 새로운 일에 대 한 읽기를 참조 하십시오 모금에 D. melanogaster 처리에 대 한 21.
    2. 0-5를 수집 튜브 및 (튀기)에 의해 전송에서 하루 오래 된 파리 NF (실 온에서 이전 예 열)를 포함 하는 새로운 튜브에 파리. 21 5 추가 일에 대 한 파리 시대 하자 ° c.
    3. 5 일의 끝에, 4에서 HFD와 NF를 포함 된 튜브에 밖으로 ° c.
      참고: 찬 온도, 파리 생활 스트레스 수로 튜브를 사용 하기 전에 따뜻하게 실 온에서 30 분 동안 앉아 보자.
    4. 물티슈를 사용 하 여, 깨끗 하 고 튜브의 측면에서 과잉 액체를 제거.
    5. 에 대 한 필터 종이의 작은 조각을 삽입 1 cm x 3 cm, 어떤 과잉 액체를 흡수 하 고 지방 음식으로.
      참고:이 단계는 파리 HFD 음식에 집착 하는 것을 방지 하는 것이 중요.
    6. 그런 다음 전송 높은 지방 음식에 파리 (튀기). 5 일 동안 가로 그들 측에, (서 안) 21-22 ° C에서 튜브를 하다.
      참고: 방지이 부분적으로 높은 지방 음식, 막대기 음식 및 다이를 파리를 일으키는 녹아 수로 높은 온도.
    7. 후 5 일, (튀기)에 의해 전송 그들의 용기를 30 분 동안 비어 있도록 음식 없이 새로운 튜브에 NF를 HFD 파리. 다음으로, 무게는 파리를 진행.
      참고:이 HFD 먹이 프로토콜에에서 중요 한 단계 중 하나는 잘 혼합된 HFD, 무료로 비행 음식이 나 압축 된 오일의 어떤 덩어리를 준비 하는. 균질 혼합 및 HFD 45-30 ° C에 냉각 하는 것이 좋습니다, 튜브에 붓는 고 4 ° C. 적절 한 나이에 음식을 저장 하기 전에 제어 및 실험 파리의 정합은 제어 영양 및 환경 조건 사전 뿐만 아니라 중요 한 HFD 먹이 하. 단계에서 먹이, 제어 및 실험 파리 제공 되어야 합니다 NF와 HFD의 동일한 금액. 결코 밀된 튜브 또는 병 (transgenerational 효과 피하기 위해)에서 파리를 수집 합니다. 항상 NF와 HFD 식이 제한이 나 다른 crowding 효과 피하기 위해 먹이 동안 유리병 당 최대 25 파리를 넣어. HFD는 30%의 코코넛 오일으로 구성 되어, 따라서 22 ° C의 위 온도 일으키는 기름진 음식에 다 막대기 파리 HFD 녹아 부분적으로 수 있습니다. HFD는에 파리를 놓기 전에 어떤 잔여 기름 제거 하는 음식에서 어떤 초과 액체를 흡수 하는 필터 종이 삽입 튜브 청소. HFD에 파리의 인큐베이션 기간 동안 튜브 파리에 대 한 지방 없는 수평 표면을 제공 하기 위해 그들의 측면에 누워 있다.
  2. 파리 무게
    1. 각 유전자 형 및 성별 테스트를 사용 하 여 매우 민감한 규모 미리 레이블, 빈 1.7 mL 튜브 무게를 기록 하.
    2. 비행 마 취 또는 CO 2를 사용 하 여 anesthetize의 동일한 유전자 형, 성별, 36 파리 수집 및 1.7 mL 튜브 무게 중 하나로 브러시로 상태를 먹이.
    3. 같은 매우 민감한 규모와 파리를 포함 하는 튜브 무게.
    4. 결정이 수식에 따라 평균 비행 무게:
      figure-protocol-3462
      참고:이 프로토콜에서 파리의 수는 36.
    5. 플래시 동결 1.7 mL 튜브 2 분 수집에 대 한 액체 질소에 폭락에 의해 파리를 포함 하 고 상자에 튜브를 넣어. 그런 다음 전송 상자-80 ° C (바람직 온도)를 스토리지에 대 한 태그 분석 결과 함께 사용 될 때까지.
      주의: 매우 낮은 온도에서 액체 질소가 이다. 적절 한 개인 보호 장비를 사용 하십시오.

2. 태그 분석 결과

  1. 태그 표준 농도의 준비
    1. PBT의 500 mL를 준비 (PBS 1 X 0.05% 트리톤).
    2. 사용 0.5 mL 튜브와 태그 솔루션 (자료 테이블), 준비의 공백 (PBT만) 100 µ L (2 µ g / µ L, 1 µ g / µ L, 0.5 µ g / µ L, 0.25 µ µ g/L는; 6 표준 태그 농도의 100 µ L 0.125 µ µ g/l는; 0.0625 µ µ g/L는)는 PBT와.
    3. 얼음에 튜브를 놓고 파리를 연 삭 진행.
  2. 파리를 연 삭
    1. -80 ° C (1.3 단계)에서 냉동된 파리를 꺼내. 얼음에 파리를 포함 하는 튜브를 전송
    2. 첫째, 96-잘 볼 디스펜서로 분쇄 볼 2mm 금속, 작은 붓을 사용 하 여 추가 공 제거.
      3. 금속 알갱이 접시에 직접 전송 공 디스펜서와 플립 위에 거꾸로
    3. 장소 96 잘 연마 플레이트. 잘 당 한 공 이어야 한다.
    4. PBT의 600 µ L 96 잘 연마 플레이트의 각 행에 추가 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여.
    5. 집게, 추가 3 당 잘 난다. 파리 각 행/96-잘이 격판덮개의 우물에서의 유전자 형, 성별 및 식품 상태를 나타냅니다.
    6. 단단히 모자가 96 잘 접시에 놓습니다. 테이프는 누설을 상단에 배치 될 수 있습니다.
    7. 제대로 연 삭 기계 연 삭 96 잘 접시를 놓습니다. 최고 속도와 프레스 기계를 설정 " 실행 "을 3 분에 대 한 파리
    8. 후 3 분, 연 삭을 중지 하 고 격판덮개 원심 분리 진행: centrifu4000 x g, 4 ° c.에서 15 분 동안 ge 원심, 후 관리는 상쾌한 펠 릿 혼합 하지 않도록 신중 하 게 연 삭 접시.
  3. 샘플 로드 및 태그 콘텐츠 결정
    1. 새로운 분 광 광도 계 96 잘 접시를 가져가 라. 접시의 각 행에 태그 시 약의 200 µ L 로드 다중 채널 피 펫을 사용 하 여.
    2. 빈을 만들려면 첫 번째 행의 첫 번째 우물에 PBT의 부하 20 µ L. 아래로 pipetting으로 혼합. 거품 형성 방지.
    3. 나머지에 (2.1.2 단계)에서 각 표준 희석의 부하 20 µ L 웰 스의 첫 번째 행과 아래로 pipetting으로 믹스. 거품 형성 방지.
    4. 상쾌한의 20 µ L을 연 삭 플레이트의 각 행에서 분 광 광도 계 96 잘 접시에 해당 하는 행 전송 다중 채널 피 펫을 사용 하 여. 여기저기 잘 혼합 플라스틱. 거품 형성 방지.
    5. 다음, 가스 투과성 호 96 잘 접시 위에 배치.
    6. 품 어 10 분 동안 37 ° C에서 접시
      참고: 우물에 거품 경우 원심에서 모든 거품을 제거 하려면 2000 x g 2 분 접시. 거품의 존재는 흡 광도 읽기에 방해가 됩니다.
    7. 읽기 550 플레이트의 각의 흡 광도 nm 호환 microplate 리더를 사용 하 여. 다음, 표준 곡선을 추적 하 고 알 수 없는 샘플의 농도 [µ g / µ L] 결정.
    8. 태그 콘텐츠 당 평균 비행 중량의 양을 결정 하는 다음 수식을 사용 하 여:
      figure-protocol-5552
      참고:이 프로토콜 3 파리의 PBT 600 µ L에 다진 했다; 결과, 비행 당 평균 볼륨 200 µ L.
  4. Bradford 분석 실험 그리고 단백질 콘텐츠 태그 콘텐츠의 정규화
    1. 7을 준비 하는 것은 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 표준 희석의 100 µ L (75 µ g/mL, 100 µ g/mL, 150 µ g/mL, 200 µ g/mL; 250 µ g/mL; 500 µ g/mL; 1000 µ g/mL)는 PBT와.
    2. 새 96 잘 접시 하 고 접시의 각 행에 1 X Bradford 시의 200 µ L 로드.
    3. 에 첫 번째 행의 첫 번째 잘 만들 빈 PBT의 10 µ L를 추가. 아래로 pipetting으로 혼합. 거품 형성 방지.
    4. 나머지에 각 표준 희석의 추가 10 µ L 웰 스의 첫 번째 행과 아래로 pipetting으로 믹스. 거품 형성 방지.
    5. 96 잘 접시에 해당 하는 행에 연마 플레이트의 각 행에서의 표면에 뜨는 10 µ L을 전송 다중 채널 피 펫을 사용 하 여. 여기저기 잘 혼합 플라스틱. 거품 형성 방지.
    6. 96 잘 접시 위에 가스 투과성 호 장소.
    7. 품 5 분 동안 실내 온도에 격판덮개. 우물에 거품 경우 원심에서 그들을 제거 하려면 2000 x g 2 분 접시.
      참고: 거품의 존재는 흡 광도 읽기에 방해가 됩니다.
    8. 읽기 빈의 흡 광도, 표준, 595에서 알 수 없는 샘플을 분 광 광도 계를 사용 하 여 nm. 표준 곡선을 사용 하 여 각 행에 있는 샘플의 농도 [µ g / µ L] 결정.
    9. 정상화 단백질 수준 다음 수식을 사용 하 여 콘텐츠 태그:
      figure-protocol-6547

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결과

D. melanogaster, 다른 종족과 경우는 성적인이 형태 성 남성 및 여성22사이. 그것은 잘 알려진 여성은 남성22보다 그들의 인체에 더 많은 지방, 더 큰입니다. 우리의 프로토콜의 효율성을 테스트 하려면 우리 차이 태그 콘텐츠 남성과 여성 표준 실험실 wildtype (w1118)의 파리 확인 하려면 태그 분석을 수행 합니다. 데이터는...

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토론

생쥐에서 비만 유도 개월19,20걸릴 수 있습니다. 파리에서 프로토콜을 먹이이 HFD 과잉 지방 축적의 문제에 일의 또는 더 적은, 18 h ( 그림 2참조) 후 지방 축적 증가 일으키는 유도 수 있습니다. HFD 설명 프로토콜 먹이 포도 당 콘텐츠 12 증가 하 고 Bmm lipase와 PGC-1 식24감소. 이것은 지방 질 및 ...

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공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

우리는 에리카 테일러가이 원고를 편집 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 부여는 건강의 국가 학회 (P01 HL098053, P01 AG033561 R01 HL054732) R.B., 박사 후 연구 보충 (R01 HL085481)와 친목 (AAUW)에서 S.B.D., 및 S.B.D.에는 미국 심장 협회에서 교부 금에 의해 투자 되었다 그리고 R.T.B.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Talboys Ball dropper/bead DispenserTalboys#: 930150
Talboys High Throughput HomogenizerTalboys#: 930145
Grinding Balls, Stainless Steel OPS Diagnostics, LLC# GBSS 156-5000-015000 balls
Masterblock 96 Well deep MicroplatesGreiner Bio-One# T-3058-1case of 80 plates
Greiner  96 well microplate flat bottomSigma Aldrich# M443640 plates
Greiner CapMat for sealing multiwell platesSigma Aldrich# C360650 sealing plates
Reagent Reservoirs Thomas Scientific# 1192T7112/PK
Thermo Scientific Finnpipette 4661040Thermo Scientific# 46610401-10 ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661070Thermo Scientific# 466107030-300ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661020Thermo Scientific#466102010-100ul multipipette
Multichannel tipsDenville Scientific Inc# P3131-Sfor 10 uL pipette
Multichannel tipsDenville Scientific Inc# P3133-Sfor 200 uL pipette
Multichannel tipsDenville Scientific Inc#P1125for 100 uL pipette
Forceps Roboz Surgical# 5 DumontsSuper fine forceps
Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64Cole-Parmer scientific experts# EW-11333-00
Metler Toledo Excellence XS Toploading BalanceCole-Parmer scientific experts# EW-11333-49
96-Well microplate CentrifugeHettich Zentrifugen# Rotina 420R
Microplate ReaderMolecular devices# SpectraMax 190
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker IncubatorBiostad# 3527
Infinity Triglycerides reagentThermo Scientific# TR22421
Triglyceride StandardStanbio#2103 - 030
Quick Start Bradford Protein AssayBio-RAD# 500-02051x dye Reagent
Coconut oilNutiva# 69275220001415 0z jar
PBS 10XThermo Scientific# AM9625500 ml
Triton X-100Sigma Aldrich# 9002-93-1
Gas-permeable FoilMacherey-Nagel# 74067550 pieces
filter PaperVWR# 28317-241Pack of 100
Drosophila vialsGenesee ScientificCat #: 32-116SB
Quick Start Bovine Serum Albumin StandardBio-Rad# 5000206
FlyNap AnestheticCarolina# 173025100 mL
Kimwipes Low-LintUline# S-81151-Ply, 4.4 x 8.4"

참고문헌

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